CN117551708A - 一种制备l-谷氨酸的方法及其相关bbd29_13530基因突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备L‑谷氨酸的方法及其相关BBD29_13530基因突变体。本发明一种提高细菌L‑氨基酸产量的方法，包括：将细菌基因组中的编码BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为编码BBD29_13530蛋白突变体的核酸分子，实现细菌所述L‑氨基酸产量的提高；所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白(SEQ IDNo.3)的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质。在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_13530基因编码区进行点突变BBD29_13530C71T、C508T能显著提高L‑谷氨酸产量。本发明对提高L‑谷氨酸产量具有重要意义。

Description

一种制备L-谷氨酸的方法及其相关BBD29_13530基因突变体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备L-谷氨酸的方法及其相关BBD29_13530基因突变体。
背景技术
L-谷氨酸作为最大宗的氨基酸品种，具有成熟的发酵生产工艺。目前，L-谷氨酸的工业生产主要采用谷氨酸棒杆菌生物素亚适量控制工艺与温度敏感突变株发酵工艺，应用的菌株大多通过诱变筛选获得，发酵产量最高可达220g/L以上。
L-谷氨酸的高效生产与细胞内代谢状态变化、细胞的高效分泌过程密切相关，多种处理方式都可以促进谷氨酸棒杆菌高效分泌L-谷氨酸，如生物素亚适量控制、表面活性剂添加、青霉素添加、温度提升等。但对于这些谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸快速分泌的机制仍然未有清晰阐释。
自改造机械敏感通道蛋白YggB可提高菌株L-谷氨酸的产量被报道后，利用L-谷氨酸运输蛋白降低胞内谷氨酸的浓度，从而提高重组菌的产量的改造方法受到广泛关注。谷氨酸棒杆菌的基因组包含约3000个蛋白编码基因，预测至少有750个基因编码的蛋白定位于细胞膜上，可能具有转运蛋白(或转运蛋白亚基)的功能。这些蛋白可分为57个不同的转运蛋白家族，其中10个可能参与氨基酸的分泌转运；NCgl1221编码的蛋白MscCG与MscCG2属MscS家族(机械敏感通道蛋白)，具有分泌转运L-谷氨酸的功能。
然后，对于工业高产菌株而言，以上外排蛋白并不能完全解决胞内L-谷氨酸浓度过高的问题，这也限制了L-谷氨酸代谢工程育种的应用。
发明内容
为了使更多的L-谷氨酸及时分泌到细胞外，本发明将编码假定膜蛋白的BBD29_13530基因点突变，使其在谷氨酸发酵过程中间接或者直接协助其他膜通道蛋白将已合成的L-谷氨酸及时分泌到胞外，从而更高产L-谷氨酸。
第一方面，本发明要求保护一种提高细菌L-氨基酸产量的方法。
本发明所要求保护的提高细菌L-氨基酸产量的方法，可包括如下步骤：将细菌基因组中的编码BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为特定核酸分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
其中，所述特定核酸分子编码BBD29_13530蛋白突变体；所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白可包含(或为)如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)来源于细菌且与(A1)所限定的蛋白质具有95％以上同一性并且与细菌产L-氨基酸(如L-谷氨酸)相关的蛋白质；
(A3)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产L-氨基酸(如L-谷氨酸)相关的由(A1)衍生的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
进一步地，所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为L，并且第170位氨基酸残基由H替换为Y后得到的蛋白质。即所述BBD29_13530蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
对应于基因层面，编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一：
(C1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(C2)在严格条件下与(C1)限定的DNA分子杂交且编码所述BBD29_13530蛋白的DNA分子；
(C3)与(C1)-(C2)中任一限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_13530蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE或0.1×SSC或0.1％SDS溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
具体地，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为所述特定核酸分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.4的第71位由C突变为T，并且第508位由C突变为T(其他核苷酸序列不变)实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为所述特定核酸分子是通过向所述细菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T实现的。
进一步地，在所述方法中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为所述特定核酸分子后还包括对所得重组细菌进行发酵培养的步骤。从发酵培养产物中可以获得L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
在进行所述发酵培养过程中，可以调节培养物的pH(如控制pH为6.8-7.0)。在进行所述发酵培养过程中，培养物的温度可以是30至40℃。在进行所述发酵培养过程中，可以控制流加糖浓度(如控制为50-55％，即100mL液体中含糖的质量是50-55g)，可以控制发酵体系残糖(如控制为0.5-1.0％，即100mL液体中含糖的质量是0.5-1.0g)。在本发明的具体实施方式中，进行所述发酵培养时采用的培养基的配方和发酵控制工艺具体参见实施例。
进一步地，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
进一步地，所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
第二方面，本发明要求保护一种构建产L-氨基酸工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建产L-氨基酸工程菌株的方法，可包括如下步骤：将细菌基因组中的编码BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为特定核酸分子，得到所述产L-氨基酸工程菌株；
所述特定核酸分子编码BBD29_13530蛋白突变体；所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白可包含(或为)如上(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。
对应于基因层面，编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子可包含(或为)如上(C1)-(C3)中任一所示DNA分子。
具体地，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为所述特定核酸分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.4的第71位由C突变为T，并且第508位由C突变为T(其他核苷酸序列不变)实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为所述特定核酸分子是通过向所述细菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T实现的。
进一步地，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
进一步地，所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
第三方面，本发明要求保护BBD29_13530蛋白突变体。
本发明所要求保护的BBD29_13530蛋白突变体是将BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H替换为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白可包含(或为)如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)来源于细菌且与(A1)所限定的蛋白质具有95％以上同一性并且与细菌产L-氨基酸(如L-谷氨酸)相关的蛋白质；
(A3)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产L-氨基酸(如L-谷氨酸)相关的由(A1)衍生的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
进一步地，所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为L，并且第170位氨基酸残基由H替换为Y后得到的蛋白质。即所述BBD29_13530蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
第四方面，本发明要求保护编码前文第三方面中所述BBD29_13530蛋白突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子可包含(或为)如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述BBD29_13530蛋白突变体的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_13530蛋白突变体的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE或0.1×SSC或0.1％SDS溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
第五方面，本发明要求保护含有前文第四方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
进一步地，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
进一步地，所述表达盒由启动子、由所述启动子启动表达的所述核酸分子，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述核酸分子连接，且所述核酸分子与所述转录终止序列连接。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子。
进一步地，所述重组微生物为含有所述表达盒或所述重组载体的重组微生物。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(Pantoea)。进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。更进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
进一步地，所述重组菌为重组细菌。
更进一步地，所述重组菌为将细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为前文第四方面中所述核酸分子后得到的重组菌。
其中，编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一：
(C1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(C2)在严格条件下与(C1)限定的DNA分子杂交且编码所述BBD29_13530蛋白的DNA分子；
(C3)与(C1)-(C2)中任一限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_13530蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE或0.1×SSC或0.1％SDS溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
具体地，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为前文第四方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.4的第71位由C突变为T，并且第508位由C突变为T(其他核苷酸序列不变)实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为前文第四方面中所述核酸分子是通过向所述细菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T现的。
更进一步地，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
更进一步地，所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
相应地，所述重组菌具体为重组菌YPG-13530或重组菌G13530。
所述重组菌YPG-13530为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220基因组中BBD29_13530基因(SEQ ID No.4)替换为SEQ ID No.2所示突变后BBD29_13530基因序列，具体可通过将SEQ ID No.4的第71位由C突变为T，并且第508位由C突变为T实现，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌G13530为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869基因组中BBD29_13530基因(SEQ ID No.4)替换为SEQ ID No.2所示的突变后BBD29_13530基因序列，具体可通过将SEQ ID No.4的第71位由C突变为T，并且第508位由C突变为T实现，并保持其他序列不变得到的菌株。
第六方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第三方面中所述的BBD29_13530蛋白突变体或前文第四方面中所述的核酸分子或前文第五方面中所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)中的应用；
P2、前文第三方面中所述的BBD29_13530蛋白突变体或前文第四方面中所述的核酸分子或前文第五方面中所述的表达盒或重组载体在提高细菌L-氨基酸(如L-谷氨酸)产量中的应用；
P3、前文第三方面中所述的BBD29_13530蛋白突变体或前文第四方面中所述的核酸分子或前文第五方面中所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸(如L-谷氨酸)工程菌株中的应用。
进一步地，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
进一步地，所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
在上述各方面中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
本发明的BBD29_13530蛋白突变体可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的谷氨酸，所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明BBD29_13530蛋白突变体的编码基因置于目的产物合成途径中，并对合成途径中的基因进行表达，即可实现目的产物的生产。
本发明研究发现：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_13530基因编码区进行点突变BBD29_13530C71T、C508T(具体为将SEQ ID No.4所示的BBD29_13530基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列)，能够显著提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的产量。本发明对提高利用谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸产量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。下文简称谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869为ATCC中编号为13869的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。下文简称谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
实施例1、构建含有BBD29_13530基因突变体的重组谷氨酸棒杆菌并进行发酵检测谷氨酸产量
一、构建包含点突变的BBD29_13530基因编码区片段的重组载体
首先，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869基因组序列，设计并合成三对用于扩增BBD29_13530基因编码区及其上游序列的引物，然后以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21220(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_13530基因)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_13530基因编码区中引入点突变。所述点突变为将BBD29_13530基因编码区的野生型核苷酸序列(SEQ ID No.4)的第71位和第508位的胞嘧啶C菌突变为胸腺嘧啶T，其他序列不变，得到SEQ ID No.2所示的BBD29_13530基因突变序列。SEQ ID No.4编码SEQ ID No.3所示的BBD29_13530野生蛋白；上述点突变导致BBD29_13530野生蛋白的第24位的丝氨酸(S)突变为亮氨酸(L)，且第170位的组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，即得到SEQ IDNo.1所示BBD29_13530突变蛋白。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示的BBD29_13530突变蛋白。
引物由上海invitrogen公司合成，具体引物序列如下：
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GCGTGCCATAAAGATCGCTC-3'，
P2：5'-CTGGGCTGCGAAGCACTACTTCGATTTCATCAAGGAAG-3'，
P3：5'-CTTCCTTGATGAAATCGAAGTAGTGCTTCGCAGCCCAG-3'，
P4：5'-CAGGCATCGTACTGTGGCGCGCGGACTTGTCTAAACAGGC-3'，
P5：5'-GCCTGTTTAGACAAGTCCGCGCGCCACAGTACGATGCCTG-3'，
P6：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCACTGCCACCGCTGAATGTG-3'。
注：加粗字体的碱基为突变位置。P1和P4上下划线部分是pK18mobsacB载体上自带的序列。
采用NEBuilder重组技术构建重组载体，具体操作如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物对P1/P2、引物对P3/P4、引物对P5/P6进行PCR扩增，获得三条大小分别为806bp、486bp和790bp的BBD29_13530基因编码区及其上游的反向互补DNA片段(均带有突变碱基)，分别命名为BBD29_13530Up(引物对P1/P2的扩增产物)、BBD29_13530Middle(引物对P3/P4的扩增产物)和BBD29_13530Down(引物对P5/P6的扩增产物)。
其中，PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃过度延伸10min。
将经上述PCR扩增得到的三条DNA片段(BBD29_13530Up、BBD29_13530Middle和BBD29_13530Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过双酶切(Xba I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，然后将所得连接产物转化DH5a，长出的单克隆经M13引物(M13F：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)PCR鉴定获得阳性重组载体，命名为pK18-BBD29_13530C71T、C508T。
将经酶切鉴定初步正确的重组质粒pK18-BBD29_13530C71T、C508T送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(C71T、C508T)的重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T保存备用。
重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点Xba I/BamH I之间的小片段替换为SEQ ID No.5的第37-1966位所示的DNA片段后得到的重组质粒(保持pK18mobsacB载体的其他序列不变)。
重组载体pK18-BBD29_13530C71T、C508T中含有完整的SEQ ID No.5。SEQ ID No.5的第1-36位和第1967-2004位为pK18mobsacB质粒上自身序列；第37-1297位为谷氨酸棒杆菌基因组上BBD29_13530基因编码区前半部分的反向互补序列；第1298-1966位为BBD29_13530基因编码区上游的反向互补序列。其中，SEQ ID No.5的第790位和第1227位为突变位点，这两个突变位点使得谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中BBD29_13530基因编码区的第71位和第508位的胞嘧啶(C)均突变为胸腺嘧啶(T)(对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第71位和第508位)。
二、构建含有BBD29_13530基因突变体的重组谷氨酸棒杆菌
将步骤一构建得到的等位替换质粒(pK18-BBD29_13530C71T、C508T)通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中后，在培养基中于32℃条件下进行培养，培养基的组成如下：蔗糖10g/L；多聚蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；酵母粉5g/L；尿素2g/L；氯化钠2.5g/L；琼脂粉20g/L；余量为水；pH 7.0。
然后，对培养产生的单菌落分别通过步骤一种的引物P1和通用引物M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行鉴定，能扩增出2011bp(序列如SEQ ID No.6所示)大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，各选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的十五株菌株(即与基因组发生同源重组阳性的菌株)进一步采用步骤一中的引物P1和P6进行扩增后，将PCR产物进行测序，通过序列比对，均获得BBD29_13530基因编码区的第71位和第508位碱基序列发生突变(C71T、C508T；对应SEQ IDNo.2和SEQ ID No.4的第71位和第508位)的菌株，即为等位替换成功的阳性菌株，分别命名为YPG-13530、G13530。
重组菌YPG-13530和G13530含有SEQ ID No.5的第37-1966位所示的包括突变的基因BBD29_13530C71T、C508T的片段。
重组菌YPG-13530与谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21220的区别仅在于：YPG-13530为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220的BBD29_13530基因编码区的野生型序列(即SEQ IDNo.4)替换为突变序列(即SEQ ID No.2)，并保持其他序列不变得到的菌株。
重组菌G13530与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的区别在于：G13530为将ATCC13869的BBD29_13530基因编码区的野生型序列(即SEQ ID No.4)替换为突变序列(即SEQ ID No.2)，并保持其他序列不变得到的菌株。
三、L-谷氨酸发酵实验
将上述步骤二构建的重组菌株(YPG-13530、G13530)以及对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中进行发酵实验。发酵结束采用SBA生物传感仪器(SBA-40E)检测L-谷氨酸产量与OD(562nm)。发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L；磷酸0.38g/L；硫酸镁1.85g/L；氯化钾1.6g/L；生物素550μg/L；维生物素B1300μg/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰10g/dl；KH2PO42.8g/L；维生素C0.75mg/L；维生素B12 2.5μg/L；对氨基苯甲酸0.75mg/L；消泡剂0.0015ml/dl；甜菜碱1.5g/L；甘蔗糖蜜7ml/L；玉米浆77ml/L；天冬氨酸1.7g/L；毛发粉2g/L；余量为水。发酵工艺如表1所示。
表1、发酵控制工艺
每个菌株重复三次，结果如表2和表3所示。
由表2和表3可知：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_13530基因编码区进行点突变BBD29_13530C71T、C508T(即将SEQ ID No.4所示的BBD29_13530基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列)，可以显著提高L-谷氨酸产量(p<0.01)。
表2、谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
表3、野生型菌株ATCC13869及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
上述实施例L-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析，实验结果P<0.05(*)表示具有显著性差异，P<0.01(**)表示具有极显著性差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.一种提高细菌L-氨基酸产量的方法，包括如下步骤：将细菌基因组中的编码BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为特定核酸分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
所述特定核酸分子编码BBD29_13530蛋白突变体；所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白包含如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)来源于细菌且与(A1)所限定的蛋白质具有95％以上同一性并且与细菌产L-氨基酸相关的蛋白质；
(A3)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产L-氨基酸相关的由(A1)衍生的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.一种构建产L-氨基酸工程菌株的方法，包括如下步骤：将细菌基因组中的编码BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为特定核酸分子，得到所述产L-氨基酸工程菌株；
所述特定核酸分子编码BBD29_13530蛋白突变体；所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白包含如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)来源于细菌且与(A1)所限定的蛋白质具有95％以上同一性并且与细菌产L-氨基酸相关的蛋白质；
(A3)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产L-氨基酸相关的由(A1)衍生的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为L，并且第170位氨基酸残基由H替换为Y后得到的蛋白质；
和/或
所述细菌为谷氨酸棒杆菌；
和/或
所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
4.BBD29_13530蛋白突变体，其特征在于：所述BBD29_13530蛋白突变体是将BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为其他氨基酸，并且第170位氨基酸残基由H突变为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_13530蛋白包含如下任何一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)来源于细菌且与(A1)所限定的蛋白质具有95％以上同一性并且与细菌产L-氨基酸相关的蛋白质；
(A3)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产L-氨基酸相关的由(A1)衍生的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的BBD29_13530蛋白突变体，其特征在于：所述BBD29_13530蛋白突变体是将所述BBD29_13530蛋白的第24位氨基酸残基由S替换为L，并且第170位氨基酸残基由H替换为Y后得到的蛋白质。
6.编码权利要求4或5所述BBD29_13530蛋白突变体的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述BBD29_13530蛋白突变体的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_13530蛋白突变体的DNA分子。
8.含有权利要求6或7所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述重组微生物为重组菌；
进一步地，所述重组菌为将细菌基因组中的编码权利要求4中所述BBD29_13530蛋白的核酸分子替换为权利要求6或7所述核酸分子后得到的重组菌。
10.如下任一应用：
P1、权利要求4或5所述的BBD29_13530蛋白突变体或权利要求6或7所述的核酸分子或权利要求8或9所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸中的应用；
P2、权利要求4或5所述的BBD29_13530蛋白突变体或权利要求6或8所述的核酸分子或权利要求9或0所述的表达盒或重组载体在提高细菌L-氨基酸产量中的应用；
P3、权利要求4或5所述的BBD29_13530蛋白突变体或权利要求6或7所述的核酸分子或权利要求8或9所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸工程菌株中的应用；
进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌；和/或
进一步地，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
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