JP2024505807A - 遺伝子ｂｂｄ２９ １４９００を改造した組換え菌株及びその構築方法と応用 - Google Patents
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Abstract
遺伝子ＢＢＤ２９ １４９００を改造した組換え菌株及びその構築方法と応用を提供した。その具体的な応用は、Ｌ－グルタミン酸の生産に用いる。コリネバクテリウムにおいてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード配列に点変異を導入する又はその発現を改善する方法も提供されている。この方法は変異を持つ菌株によりグルタミン酸の発酵生産量を増加させるために用いることができる。点変異により、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子配列の１１１４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変異し、コードされた対応するアミノ酸配列の３７２番目のアスパラギン酸がアスパラギンで置換される。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子工学と微生物技術分野に属し、具体的に遺伝子ＢＢＤ２９＿１４９００を改造した組換え菌株及びその構築方法と応用に関し、具体的な応用は、Ｌ－グルタミン酸生産である。
よく知られているように、日常的に使われる調味料である味の素は、Ｌ－グルタミン酸単ナトリウム塩である。１９０９年に日本で味の素が発明され、工業的に生産されて以来、幾多の変遷を経て、グルタミン酸発酵をテーマとした世界的なアミノ酸発酵工業へと発展してきた。味の素のグルタミン酸などのアミノ酸を生産する発酵は、従来の醸造や抗生物質発酵とは異なり、微生物の代謝を変える代謝制御発酵である。
現在、メーカーがブドウ糖発酵に使用した菌種は、主にいくつかの変異株であり、前記生産菌種は、主に変異誘導を主とする微生物育種によって得られたものである。しかし、既存の酸産生能力の下で、古典的な微生物育種技術、例えば変異誘導、細胞融合などの手段を引き続き採用すれば、酸産生率と糖酸転化率を大幅に向上させることは、かなり困難になっている。そのため、現代の遺伝子工学的手段を用いて菌種を改造し、酸産生率と糖酸転化率を高めることは、現在最も有効な方法である。
遺伝子工学的手段を用いて菌種を改造して生産することができれば、グルタミン酸の酸産生率と糖酸転化率に大きな突破がある。
本発明は、遺伝子ＢＢＤ２９＿１４９００を改造した組換え菌株及びその構築方法と応用を提供した。
本発明の目的は、細菌のＬ－グルタミン酸生産能力を改善するための新技術を開発することによって、Ｌ－グルタミン酸を効率的に製造する方法を提供することである。
上記目的を実現するために、本発明の発明者らは、遺伝子ＢＢＤ２９＿１４９００又はその相同遺伝子について、前記遺伝子を修飾するか又はその発現を改善することにより、増強されたＬ－グルタミン酸生産能力を有する細菌を得られることを研究により発見した。これらの発見に基づいて、本発明を完了した。
本発明は、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善された。本発明は、前記微生物を用いたＬ－グルタミン酸の製造方法をさらに提供した。
本発明の第一の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、そのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現は、改善されている。本発明によれば、前記改善された発現は、前記ポリヌクレオチド発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである。
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列は、遺伝子ＢＢＤ２９＿１４９００又はその相同遺伝子コードのタンパクである。
前記細菌は、未修飾菌株と比べて増強されたＬ－グルタミン酸生産能力を有する。
本発明において、用語である「Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌」とは、細菌が培地で培養される時にＬ－グルタミン酸を収集できるように、培地及び／又は細菌の細胞において以下の程度で目的Ｌ－グルタミン酸を生産、蓄積能力を有する細菌を指す。Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、未修飾菌株の取得可能な量よりも多い量で培地及び／又は細菌の細胞において目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
用語である「未修飾菌株」とは、特定の特徴を有するように修飾されていない対照菌株を指す。即ち、未修飾菌株の例は、野生型菌株と親株を含む。
Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、培地において好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
本発明において、別段の説明がない限り、用語である「Ｌ－グルタミン酸」とは、遊離形態のＬ－グルタミン酸、その塩又はその混合物を指す。
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。本明細書で使用されるように、用語である「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドモジュール間のパーセンテージ同一性を指す。当分野で既知の方法であるモジュールと別のモジュールとの間の配列相同性を測定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってこのような配列相同性を測定することができる。
ポリヌクレオチドの発現は、置換又は変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）による発現調節配列、ポリヌクレオチド配列への変異導入、染色体挿入又はベクターを介して導入されるポリヌクレオチドコピー数の増加、又はその組み合わせなどによって増強されることができる。
ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾してもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、且つ例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドを染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させてもよい。本明細書において、特定の部位は、例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させてもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記アミノ酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、変異前の前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していることによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の３７２番目のアスパラギン酸（Ｄ）は、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、３７２番目のアスパラギン酸は、アスパラギンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、３７２番目のアスパラギン酸がアスパラギンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用されるように、用語である「操作可能な連結」とは、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、それによって調節配列は、ポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発現レベルを向上させることができる強力なプロモーターであってもよい。調節配列は、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のプロモーターであってもよく、又は他の微生物由来のプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子）のプロモーターである。
本明細書で使用されるように、用語である「ベクター」とは、遺伝子の調節配列と遺伝子配列を含み且つ適切な宿主細胞において標的遺伝子を発現するように構成されたポリヌクレオチド構築体を指す。又は、ベクターは、相同組換えに利用可能な配列を含むポリヌクレオチド構築体をさらに指してもよく、それによって宿主細胞に導入されたベクターにより、宿主細胞のゲノムにおける内因性遺伝子の調節配列を変更することができ、又は発現可能な標的遺伝子を宿主のゲノムの特定の部位に挿入することができる。この点では、本発明で使用されるベクターは、ベクターの宿主細胞への導入又はベクターの宿主細胞の染色体への挿入を決定する選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、選択可能な表現型、例えば薬物耐性、栄養欠損型、細胞毒剤に対する耐性、又は表面タンパクの発現を与えるマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理された環境では、選択マーカーを発現させた細胞のみが生存できるか又は異なる表現型性状を示すため、形質転換された細胞を選択してもよい。
本発明のいくつかの具体的な実施の形態において、使用されるベクターは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
本明細書で使用されるように、用語である「形質転換」とは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することによって、ポリヌクレオチドがゲノム外素子とするか又は宿主細胞に挿入されたゲノムで複製できることを指す。本発明で使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術に開示されるように、宿主細胞に応じて電気パルス法を実施することができる。
本発明によれば、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する微生物、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）などであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１であり、該菌は、多収型グルタミン酸であり、保存情報は、以下のとおりである。菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム、ラテン名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、保存機構：中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保存日：２０２０年１１月２３日、保存センター登録簿番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０。
本発明によれば、前記細菌は、Ｌ－グルタミン酸の生産量の向上に関連する他の改良、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼなどの酵素の活性又は遺伝子の増強又は低下の発現をさらに有してもよく、又は遺伝子を外来遺伝子に置換させてもよい。
本発明の第二の態様によれば、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株を提供する。
本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つ前記配列の３７２番目のアスパラギン酸は、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、３７２番目のアスパラギン酸は、アスパラギンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、３７２番目のアスパラギン酸がアスパラギンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記変異方法は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から少なくとも一つを選択してもよい。本発明において、好ましくは、ＰＣＲ固定点変異法及び／又は相同組換えを採用する。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明によれば、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築される。
本発明の一つの実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
本発明の別の実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を介して前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドを組換えベクターとして構築してもよい。
本発明によれば、前記組換え菌株は、前記のポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の第三の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その１１１４番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１４９００コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その１１１４番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１４９００コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
本発明の構築方法によれば、前記改造は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも一つを含む。
本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における１１１４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変化することを指し、具体的には、前記変異ＢＢＤ２９＿１４９００コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その１１１４番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿１４９００コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その１１１４番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿１４９００コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点変異のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の構築を含み、即ち、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子断片を増幅するプライマーＰｌとＰ２及びＰ３とＰ４を２組合成し、ＰＣＲ固定点変異法によって野生型ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ｌに点変異を導入し、点変異ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を得、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａとする。
本発明の一つの実施の形態において、前記未修飾菌株ゲノムは、ＡＴＣＣ １３８６９菌株に由来してもよく、そのゲノム配列は、ＮＣＢＩサイトから取得されてもよい。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧ－３’
Ｐ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：６）：５’－ＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧ－３’
Ｐ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：７）：５’－ＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＣＡＧ－３’
Ｐ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＴＡＧＴＣ－３’
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧ－３’
Ｐ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：６）：５’－ＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧ－３’
Ｐ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：７）：５’－ＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＣＡＧ－３’
Ｐ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＴＡＧＴＣ－３’
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築を含み、分離精製されたＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４ＡとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築を含み、即ち組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得る。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、電気変換法である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記組換えは、相同組換えによって実現される。
本発明の第四の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿１４９００の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿１４９００の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ－３’
Ｐ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’－ＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ－３’
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：５’－ＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ－３’
Ｐ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ－３’
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：５’－ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：５’－ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
Ｐ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ－３’
Ｐ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’－ＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ－３’
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：５’－ＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ－３’
Ｐ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ－３’
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：５’－ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：５’－ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
本発明の一つの実施の形態において、採用されたＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと統合相同アーム断片を組み立て、統合プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、統合プラスミドを宿主菌株にトランスフェクトし、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を導入する。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明の第五の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生産する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：
５’－ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：
５’－ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自己プロモーターを持つＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片を組み立て、過剰発現プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明で得た組換え菌株は、単独でＬ－グルタミン酸の発酵生産に応用されてもよく、Ｌ－グルタミン酸を生産する他の細菌と混合してＬ－グルタミン酸を発酵生産してもよい。
本発明の別の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸の製造方法を提供し、該方法は、前記細菌を培養し、且つ培養物からＬ－グルタミン酸を得ることを含む。
当分野の既知の培養条件で適切な培地において細菌の培養を行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びその組み合わせを含んでもよい。培養において、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養の際に、気泡の発生を防止することを含んでもよく、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止する。また、培養の際に、培養物にガスを注入することを含んでもよい。ガスは、培養物の好気条件を維持できる任意のガスを含んでもよい。培養において、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。生成されたＬ－グルタミン酸を培養物から回収し、即ち硫酸又は塩酸などで培養物を処理し、そして例えばアニオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析と等電点沈殿の方法を組み合わせて行ってもよい。
本発明は、タンパク質（変異タンパクであって、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクと命名される）を提供し、ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの３７２番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からアスパラギンに変異して得られたものであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるタンパク質、又は
（ａ２）細菌由来であり且つ（ａ１）と９５％以上の同一性を有し且つ細菌のグルタミン酸生産に関連するタンパク質、又は
（ａ３）（ａ１）に示されるタンパク質を、一つ又は複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られ且つ細菌のグルタミン酸生産に関連する（ａ１）から誘導されるタンパク質である。
前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるタンパク質、又は
（ａ２）細菌由来であり且つ（ａ１）と９５％以上の同一性を有し且つ細菌のグルタミン酸生産に関連するタンパク質、又は
（ａ３）（ａ１）に示されるタンパク質を、一つ又は複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られ且つ細菌のグルタミン酸生産に関連する（ａ１）から誘導されるタンパク質である。
ここで使用される用語である「同一性」とは、天然アミノ酸配列との配列類似性を指す。同一性は、肉眼又はコンピュータソフトウェアで評価されることができる。コンピュータソフトウェアを使用して、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセンテージ（％）で表示することができ、関連する配列間の同一性を評価するために用いられてもよい。
前記９５％以上の同一性は、具体的に９６％以上の同一性又は９７％以上の同一性又は９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性であってもよい。
具体的には、前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクをコードする遺伝子である。
ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクをコードする遺伝子である。
具体的には、前記ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、
（ｂ１）コード領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１に示されるＤＮＡ分子である、又は
（ｂ２）細菌由来であり且つ（ｂ１）と９５％以上の同一性を有し且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子又は、
（ｂ３）厳格な条件で（ｂ１）とハイブリダイズし且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
（ｂ１）コード領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１に示されるＤＮＡ分子である、又は
（ｂ２）細菌由来であり且つ（ｂ１）と９５％以上の同一性を有し且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子又は、
（ｂ３）厳格な条件で（ｂ１）とハイブリダイズし且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
ここで使用される用語である「同一性」とは、天然核酸配列との配列類似性を指す。同一性肉眼又はコンピュータソフトウェアで評価されることができる。コンピュータソフトウェアを使用して、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセンテージ（％）で表示することができ、関連する配列間の同一性を評価するために用いられてもよい。
前記９５％以上の同一性は、具体的に９６％以上の同一性又は９７％以上の同一性又は９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性であってもよい。
前記厳格な条件は、０．１×ＳＳＰＥ（又は０．１×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳの溶液において、６５℃の条件でハイブリダイズして膜を洗浄することであってもよい。
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクのコード遺伝子（ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子と命名される）も、本発明の保護範囲に属する。
具体的には、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子は、
（ｃ１）コード領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＤＮＡ分子である、又は
（ｃ２）細菌由来であり且つ（ｃ１）と９５％以上の同一性を有し且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、又は
（ｃ３）厳格な条件で（ｃ１）とハイブリダイズし且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
（ｃ１）コード領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＤＮＡ分子である、又は
（ｃ２）細菌由来であり且つ（ｃ１）と９５％以上の同一性を有し且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、又は
（ｃ３）厳格な条件で（ｃ１）とハイブリダイズし且つ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
ここで使用される用語である「同一性」とは、天然核酸配列との配列類似性を指す。同一性肉眼又はコンピュータソフトウェアで評価されることができる。コンピュータソフトウェアを使用して、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセンテージ（％）で表示することができ、関連する配列間の同一性を評価するために用いられてもよい。
前記９５％以上の同一性は、具体的に９６％以上の同一性又は９７％以上の同一性又は９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性であってもよい。
前記厳格な条件は、０．１×ＳＳＰＥ（又は０．１×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳの溶液において、６５℃の条件でハイブリダイズして膜を洗浄することであってもよい。
ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有するＤＮＡ分子、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する発現カセット又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えベクター又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有するＤＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＤＮＡ分子又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＤＮＡ分子であってもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＤＮＡ分子を有するプラスミド又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＤＮＡ分子を有するプラスミドであってもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えベクターは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａであってもよい。
前記組換え菌は、具体的に組換え細菌であってもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＤＮＡ分子を有する組換え菌又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＤＮＡ分子を有する組換え菌又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＤＮＡ分子を有する組換え菌であってもよい。
ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、具体的に細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換える方式で製造されてもよい。
例示的に、細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換える実現方式は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＤＮＡ分子を細菌に導入することである。
例示的に、細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換える実現方式は、実施例におけるベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを細菌に導入することである。
前記組換え菌において、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子をゲノムＤＮＡに統合して発現させてもよくプラスミドで発現させてもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、具体的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＤＮＡ分子又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＤＮＡ分子を細菌に導入する方式で製造されてもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、具体的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＤＮＡ分子を有するプラスミド又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＤＮＡ分子を有するプラスミドを細菌に導入する方式で製造されてもよい。
例示的に、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌は、具体的に実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを細菌に導入する方式で製造されてもよい。
本発明は、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパク、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する発現カセット又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えベクター又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換え菌の応用をさらに保護し、
前記応用は、
（Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用である。
前記応用は、
（Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用である。
本発明は、特定物質の応用をさらに保護し、
前記応用は、
（Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用である。
前記特定物質は、
（ｄ１）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ２）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの存在度を向上させるための物質、
（ｄ３）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの活性を向上させるための物質、
（ｄ４）ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ５）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの存在度を向上させるための物質、又は
（ｄ６）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの活性を向上させるための物質である。
前記応用は、
（Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用である。
前記特定物質は、
（ｄ１）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ２）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの存在度を向上させるための物質、
（ｄ３）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの活性を向上させるための物質、
（ｄ４）ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ５）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの存在度を向上させるための物質、又は
（ｄ６）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの活性を向上させるための物質である。
例示的に、前記を向上させるためのＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子の発現の物質は、具体的にＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えプラスミドであってもよい。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａであってもよい。
例示的に、前記を向上させるためのＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の発現の物質は、具体的にＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を有する組換えプラスミドであってもよい。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００であってもよい。
本発明は、組換え菌をさらに提供し、細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００を過剰発現させて得られたものである。
例示的に、過剰発現ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子実現方式は、細菌にＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えプラスミドを導入することである。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａであってもよい。
例示的に、過剰発現ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子実現方式は、細菌にＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を有する組換えプラスミドを導入することである。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００であってもよい。
本発明は、前記組換え菌の、グルタミン酸の製造における応用をさらに保護する。
本発明は、細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換えるステップを含む、細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法をさらに保護する。
例示的に、細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換える実現方式は、実施例におけるベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを細菌に導入することである。
本発明は、細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させるか又は細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を過剰発現させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの存在度を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの存在度を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの活性を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの活性を向上させるステップを含む、細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法をさらに提供する。
例示的に、過剰発現ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子実現方式は、細菌にＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を有する組換えプラスミドを導入することである。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａであってもよい。
例示的に、過剰発現ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子実現方式は、細菌にＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を有する組換えプラスミドを導入することである。例示的に、前記組換えプラスミドは、実施例における統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００又は過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００であってもよい。
本発明は、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパク又はＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの、細菌のグルタミン酸の生産量の制御における応用をさらに保護する。
前記制御は、正の制御であり、即ちＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの含有量が増加し、グルタミン酸の生産量が増加する。
前記制御は、正の制御であり、即ちＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの含有量が減少し、グルタミン酸の生産量が減少する。
前記制御は、正の制御であり、即ちＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの含有量が増加し、グルタミン酸の生産量が増加する。
前記制御は、正の制御であり、即ちＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの含有量が減少し、グルタミン酸の生産量が減少する。
前記組換え菌を用いてグルタミン酸を製造する時に、具体的な方法は、前記組換え菌を発酵させるステップを含む。
当業者は、従来技術における発酵方法を採用して発酵を行うことができる。通常の試験によって発酵方法の最適化と改良を行うこともできる。当分野で既知の発酵条件で適切な培地において細菌の発酵を行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びその組み合わせを含んでもよい。培養において、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養の際に、気泡の発生を防止し、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止することを含んでもよい。また、培養の際に、培養物にガスを注入することを含んでもよい。ガスは、培養物の好気条件を維持できる任意のガスを含んでもよい。培養において、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。
前記方法は、培養物からグルタミン酸を得るステップをさらに含んでもよい。培養物からグルタミン酸を得ることは、様々な方式で実現されることができ、硫酸又は塩酸などで培養物を処理し、そして例えばアニオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析と等電点沈殿の方法を組み合わせて行うことを含むが、それらに限らない。
前記発酵中、例示的に発酵培地の処方は、表３に示され、残量は、水である。
前記発酵中、例示的に発酵制御プロセスは、表４に示される。
例示的に、前記発酵において、系における菌濃度は、１５ｇ／Ｌである。
例示的に、前記発酵の発酵過程において、ブドウ糖水溶液を補充することによって系の糖度（残糖）を制御する。
上記のいずれか一つの前記細菌は、コリネバクテリウム属細菌、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ） を含むが、それらに限らない。
上記のいずれか一つの前記細菌は、グルタミン酸生産能力を有する細菌である。
「グルタミン酸生産能力を有する細菌」とは、培地及び／又は細菌の細胞においてグルタミン酸を生産して蓄積する能力を有する細菌を指す。これによって、細菌培地において培養する際にグルタミン酸を収集することができる。
前記細菌は、自然に採取された野生型細菌であってもよく、修飾後の細菌であってもよい。
「修飾後の細菌」とは、自然に採取された野生型細菌を人工的に変異し及び／又は変異誘導して得られた改造後の細菌を指す。
具体的には、前記コリネバクテリウム・グルタミクムは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２６０であってもよい。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ２１２２０は、菌株名がＹＰＧＬＵ００１であり、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と略称され、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣと略称され、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所）に保存されており、保存登録番号がＣＧＭＣＣ ２１２２０である。
上記のいずれか一つの前記グルタミン酸の意味は、広義のグルタミン酸であり、遊離形態のグルタミン酸、グルタミン酸の塩又は両者の混合物を含む。
具体的には、前記グルタミン酸は、Ｌ－グルタミン酸である。
上記のいずれかの方法又は応用はさらに、グルタミン酸の下流製品の製造に用いられてもよい。
コリネバクテリウム・グルタミクムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、そのコード遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１に示される。本発明では、点変異を導入することにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクを得、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクのコード遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２に示される。ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の相であるＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子との相違点は、１１１４番目がグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）からアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に変化することである。ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクと比べて、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの相違点は、３７２番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）に変化することである。
本発明は、ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクが細菌のグルタミン酸の生産量を正の制御し、即ちＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの含有量が増加し、グルタミン酸の生産量が増加し、ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの含有量が減少し、グルタミン酸の生産量が減少することを発見した。ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の発現を抑制することにより、グルタミン酸の生産量を減少させることができ、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の過剰発現により、グルタミン酸の生産量を増加させることができる。さらに、本発明は、点変異により、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクを得ており、その機能は、ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクよりも優れる。本発明は、グルタミン酸の産業化生産に対して、重要な応用価値を有する。
以下の実施例は、本発明のより良い理解を容易にするが、本発明を限定するものではない。下記の実施例における実験方法は、別段説明がない限り、通常の方法である。下記の実施例において使用される試験材料は、別段説明がない限り、通常の生化学試薬販売店から購入されたものである。
下記の実施例において菌株を培養するために使用される培地は、いずれも基礎培地の上に他の成分を添加して得たものである。他の成分は、ショ糖、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどである。固体培地には、アガロースが含まれる。基礎培地の構成は、表１に示される。別段説明がない限り、実施例における菌株の培養温度は、いずれも３２℃である。
ｓｓｃｐ電気泳動におけるＰＡＧＥの処方は、表２に示される。電気泳動条件は、電気泳動槽を氷に入れ、１×ＴＢＥ緩衝液を使用し、１２０Ｖの電圧で、電気泳動時間を１０ｈとすることである。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ２１２２０は、菌株名がＹＰＧＬＵ００１であり、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と略称され、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣと略称され、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所）に保存されており、保存登録番号がＣＧＭＣＣ ２１２２０コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９、即ちコリネバクテリウム・グルタミクムＣＩＣＣ２０２１６であり、ＣＩＣＣのフルネームは、中国工業微生物菌種保存管理センターである。
実施例１、点変異のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０（シークエンスによりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０染色体上のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域とコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９染色体上のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域とが一致していることが確認された）に点変異を導入した。変異前の対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、変異前のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１遺伝子に単一点変異が導入され、即ちコード領域１１１４番目がグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）からアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に変化したものである。それに応じて、タンパク質の単一点変異を引き起こし、即ち３７２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）に変化した。変異後の遺伝子は、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子と呼ばれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。変異後のタンパクは、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクと呼ばれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０（シークエンスによりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０染色体上のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域とコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９染色体上のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域とが一致していることが確認された）に点変異を導入した。変異前の対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、変異前のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１遺伝子に単一点変異が導入され、即ちコード領域１１１４番目がグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）からアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に変化したものである。それに応じて、タンパク質の単一点変異を引き起こし、即ち３７２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）に変化した。変異後の遺伝子は、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子と呼ばれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。変異後のタンパクは、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクと呼ばれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
プライマーは、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧ－３’
Ｐ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：５’－ＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧ－３’
Ｐ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）：５’－ＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＣＡＧ－３’
Ｐ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＴＡＧＴＣ－３’
Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧ－３’
Ｐ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：５’－ＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧ－３’
Ｐ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）：５’－ＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＣＡＧ－３’
Ｐ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＴＡＧＴＣ－３’
１．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれＰ１とＰ２からなるプライマーセットを採用し又はＰ３とＰ４からなるプライマーセットを採用し、ＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。
ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。
ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
２．回収ステップ１の２つのＰＣＲ系の増幅産物をそれぞれ回収するとともに、テンプレートとし、Ｐ１とＰ４からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。
ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。
ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
３．ステップ２のＰＣＲ増幅により得られた約１２５３ｂｐの増幅産物を回収し、該回収されたＤＮＡ断片は、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片である（シークエンスを経て、該ＤＮＡ断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される）。
ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片は、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に統合されることができ、これによってＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域の１１１４番目のヌクレオチドは、グアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）からアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に変異し、最終的にコードされたタンパク質の３７２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）に変異した。
ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片は、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に統合されることができ、これによってＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域の１１１４番目のヌクレオチドは、グアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）からアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に変異し、最終的にコードされたタンパク質の３７２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）に変異した。
４．制限酵素Ｘｂａ Ｉ酵素を採用してｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製品）を切断し、リニアプラスミドを回収した。
５．ステップ３で得られたＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片とステップ４で得られたリニアプラスミドとをＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によって組み立て、ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを得た。ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａは、シークエンス検証されており、その中には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片を有した。ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａには、カナマイシン耐性マーカーを有した。
５．ステップ３で得られたＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片とステップ４で得られたリニアプラスミドとをＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によって組み立て、ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを得た。ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａは、シークエンス検証されており、その中には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ断片を有した。ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａには、カナマイシン耐性マーカーを有した。
実施例２、点変異のＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを含む工学的菌株の構築
実施例１で構築されたベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを電撃形質転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒ（Ｍ１３Ｒ：５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’）からなる誘導対でＰＣＲ鑑定し、約１２６０ｂｐバンドの菌株を陽性菌株として増幅することができた。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し且つカナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ５とＰ６からなるプライマーセット（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定された。ＰＣＲ鑑定におけるＰＣＲ増幅産物を回収し、高温変性、氷浴後にｓｓｃｐ電気泳動（ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａの増幅断片を陽性対照とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。スクリーニングしたアイソサイト置換に成功した菌株を、プライマーＰ５とＰ６からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を回収してＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比によりアイソサイト置換に成功した菌株を検証してコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９と命名された。
Ｐ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：５’－ＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴ－３’
Ｐ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：５’－ＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９との相違点は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムにおける配列表の配列１に示されるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を配列表の配列２に示されるＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置換したことだけである。配列１と配列２には、１１１４番目に位置するヌクレオチドの相違点が１つしか存在しない。
実施例１で構築されたベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを電撃形質転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒ（Ｍ１３Ｒ：５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’）からなる誘導対でＰＣＲ鑑定し、約１２６０ｂｐバンドの菌株を陽性菌株として増幅することができた。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し且つカナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ５とＰ６からなるプライマーセット（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定された。ＰＣＲ鑑定におけるＰＣＲ増幅産物を回収し、高温変性、氷浴後にｓｓｃｐ電気泳動（ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａの増幅断片を陽性対照とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。スクリーニングしたアイソサイト置換に成功した菌株を、プライマーＰ５とＰ６からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を回収してＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比によりアイソサイト置換に成功した菌株を検証してコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９と命名された。
Ｐ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：５’－ＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴ－３’
Ｐ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：５’－ＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９との相違点は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムにおける配列表の配列１に示されるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を配列表の配列２に示されるＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置換したことだけである。配列１と配列２には、１１１４番目に位置するヌクレオチドの相違点が１つしか存在しない。
実施例３、ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させた工学的菌株の構築
Ｉ． 統合プラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、プライマーを３組設計して合成し、それぞれ上流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域（又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子コード領域）、下流相同アーム断片を増幅し、相同組換えの方式でコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムＤＮＡにＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を統合した。
Ｉ． 統合プラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、プライマーを３組設計して合成し、それぞれ上流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域（又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子コード領域）、下流相同アーム断片を増幅し、相同組換えの方式でコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムＤＮＡにＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を統合した。
プライマーは、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ－３’
Ｐ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’－ＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ－３’
Ｐ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：５’－ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：５’－ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
Ｐ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：５’－ＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ－３’
Ｐ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９をテンプレートとし、それぞれ以Ｐ７／Ｐ８からなるプライマーセット、Ｐ９／Ｐ１０からなるプライマーセット、Ｐ１１／Ｐ１２からなるプライマーセット、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ｂｐ、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片約１４９４ｂｐ、下流相同アーム断片約７８８ｂｐを得、そしてＰ７／Ｐ１２からなるプライマーセットを採用し、以上増幅された三つの断片混合をテンプレートとして増幅を行い、約３００８ｂｐの統合相同アーム断片（シークエンスを経て、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される）を得た。米用ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系は、統合相同アーム断片とＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを連結し、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを得た。統合プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含まれており、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９の代わりとしてコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９を用いて上記ステップを行い、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００を得た。
Ｐ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ－３’
Ｐ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’－ＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ－３’
Ｐ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：５’－ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：５’－ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
Ｐ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：５’－ＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ－３’
Ｐ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９をテンプレートとし、それぞれ以Ｐ７／Ｐ８からなるプライマーセット、Ｐ９／Ｐ１０からなるプライマーセット、Ｐ１１／Ｐ１２からなるプライマーセット、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ｂｐ、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片約１４９４ｂｐ、下流相同アーム断片約７８８ｂｐを得、そしてＰ７／Ｐ１２からなるプライマーセットを採用し、以上増幅された三つの断片混合をテンプレートとして増幅を行い、約３００８ｂｐの統合相同アーム断片（シークエンスを経て、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される）を得た。米用ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系は、統合相同アーム断片とＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを連結し、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａを得た。統合プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含まれており、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０μＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９の代わりとしてコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９を用いて上記ステップを行い、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００を得た。
ＩＩ． 組換え菌の製造
統合プラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをＰ１３／Ｐ１４からなるプライマーセットによりＰＣＲ鑑定し、ＰＣＲが増幅できた大きさ約１８２７ｂｐの断片を含むのは、形質転換に成功した陽性菌株であり、断片を増幅できなかったのは、形質転換に成功しなかった菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖スクリーニングを経てた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し且つカナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１６からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ約１５１７ｂｐの菌は、目的遺伝子としてコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムに統合された菌株である。
Ｐ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）：５’－ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ－３’
Ｐ１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）：５’－ＧＣＡＧＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧ－３’
Ｐ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）：５’－ＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣ－３’
Ｐ１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）：５’－ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ－３’
統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００で上記ステップを行い、得られた組換え菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０は、ゲノムＤＮＡにおいてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を過剰発現させた組換え菌である。
統合プラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをＰ１３／Ｐ１４からなるプライマーセットによりＰＣＲ鑑定し、ＰＣＲが増幅できた大きさ約１８２７ｂｐの断片を含むのは、形質転換に成功した陽性菌株であり、断片を増幅できなかったのは、形質転換に成功しなかった菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖スクリーニングを経てた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し且つカナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１６からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ約１５１７ｂｐの菌は、目的遺伝子としてコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムに統合された菌株である。
Ｐ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）：５’－ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ－３’
Ｐ１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）：５’－ＧＣＡＧＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧ－３’
Ｐ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）：５’－ＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣ－３’
Ｐ１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）：５’－ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ－３’
統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００で上記ステップを行い、得られた組換え菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０は、ゲノムＤＮＡにおいてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を過剰発現させた組換え菌である。
統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａで上記ステップを行い、得られた組換え菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２１である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２１は、ゲノムＤＮＡにおいてＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させた組換え菌である。
実施例４、プラスミド上においてＢＢＤ２９＿１４９００又はＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させた工学的菌株の構築
Ｉ．組換えプラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表された野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、Ｐ１７とＰ１８とした（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：
５’－ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８からなるプライマーセットでＰＣＲ増幅を行い、１５２４ｂｐのＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片（シークエンスを経て、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される）を得た。ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片とＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９とを連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４ Ａを得た。過剰発現プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれており、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９の代わりとしてコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０を用いて上記ステップを行い、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００を得た。
Ｉ．組換えプラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表された野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、Ｐ１７とＰ１８とした（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ－３’
Ｐ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：
５’－ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８からなるプライマーセットでＰＣＲ増幅を行い、１５２４ｂｐのＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片（シークエンスを経て、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される）を得た。ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子断片とＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９とを連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４ Ａを得た。過剰発現プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれており、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。ＰＣＲ系（５０μＬ）：テンプレート、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、残量が水である。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０１９の代わりとしてコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２０を用いて上記ステップを行い、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００を得た。
ＩＩ．組換え菌の製造
過剰発現プラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをＭ１３Ｒ（－４８）とＰ１８からなるプライマーセットでＰＣＲ鑑定し、ＰＣＲが約１５６３ｂｐの断片を増幅したのは、組換え菌である。Ｍ１３Ｒ（－４８）：５’－ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ－３’である。
過剰発現プラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをＭ１３Ｒ（－４８）とＰ１８からなるプライマーセットでＰＣＲ鑑定し、ＰＣＲが約１５６３ｂｐの断片を増幅したのは、組換え菌である。Ｍ１３Ｒ（－４８）：５’－ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ－３’である。
過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００で上記ステップを行い、得られた組換え菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２２である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２２は、プラスミドがＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を過剰発現させた組換え菌である。
過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａで上記ステップを行い、得られた組換え菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２３である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２３は、プラスミドがＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させた組換え菌である。
実施例５、ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を欠失させた工学的菌株の構築
Ｉ．ノックアウトプラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づき、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域両端断片を増幅するプライマーを２組合成し、上、下流相同アーム断片の増幅に用いられた。
Ｉ．ノックアウトプラスミドの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づき、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域両端断片を増幅するプライマーを２組合成し、上、下流相同アーム断片の増幅に用いられた。
プライマーは、以下のとおりである（上海英俊公司により合成された）。
Ｐ１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ－３’
Ｐ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）：５’－ＡＧＧＣＧＴＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣ－３’
Ｐ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）：５’－ＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＴ－３’
Ｐ２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＣＧＴＣＴＴ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれＰ１９／Ｐ２０からなるプライマーセット又はＰ２１／Ｐ２２からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、それぞれ上流相同アーム断片（約８０４ｂｐ）と下流相同アーム断片（約７９１ｂｐ）を得た。同時に上流相同アーム断片と下流相同アーム断片作をテンプレートとし、プライマーＰ１９／Ｐ２２からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、相同アーム断片全体（約１５５５ｂｐ、シークエンスを経て、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示される）を得た。ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によって相同アーム断片全体とＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドとを連結し、ノックアウトプラスミドを得た。ノックアウトプラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含まれた。
Ｐ１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）：
５’－ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ－３’
Ｐ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）：５’－ＡＧＧＣＧＴＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣ－３’
Ｐ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）：５’－ＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＴ－３’
Ｐ２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）：
５’－ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＣＧＴＣＴＴ－３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれＰ１９／Ｐ２０からなるプライマーセット又はＰ２１／Ｐ２２からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、それぞれ上流相同アーム断片（約８０４ｂｐ）と下流相同アーム断片（約７９１ｂｐ）を得た。同時に上流相同アーム断片と下流相同アーム断片作をテンプレートとし、プライマーＰ１９／Ｐ２２からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ増幅を行い、相同アーム断片全体（約１５５５ｂｐ、シークエンスを経て、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示される）を得た。ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によって相同アーム断片全体とＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドとを連結し、ノックアウトプラスミドを得た。ノックアウトプラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含まれた。
ＩＩ．組換え菌の製造
ノックアウトプラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをそれぞれＰ２３とＰ２４からなるプライマーセット（上海英俊公司により合成された）でＰＣＲ鑑定された。ＰＣＲが増幅できた大きさ１４８１ｂｐ及び２６６０ｂｐのバンド菌株は、形質転換に成功した陽性菌株であり、１４８１ｂｐバンドのみを増幅した菌株は、形質転換に成功しなかった菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３とＰ２４からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅産物が１つのみで且つ１４８１ｂｐである菌株は、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２４と命名された。
Ｐ２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）：５’－ＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ－３’
Ｐ２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）：５’－ＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＣＧＴＣＴＴ－３’
ノックアウトプラスミド電気変換をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーをそれぞれＰ２３とＰ２４からなるプライマーセット（上海英俊公司により合成された）でＰＣＲ鑑定された。ＰＣＲが増幅できた大きさ１４８１ｂｐ及び２６６０ｂｐのバンド菌株は、形質転換に成功した陽性菌株であり、１４８１ｂｐバンドのみを増幅した菌株は、形質転換に成功しなかった菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長し、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３とＰ２４からなるプライマーセットを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅産物が１つのみで且つ１４８１ｂｐである菌株は、ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２４と命名された。
Ｐ２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）：５’－ＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ－３’
Ｐ２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）：５’－ＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＣＧＴＣＴＴ－３’
実施例６、Ｌ－グルタミン酸発酵実験
以上の実施例で構築された各組換え菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０をＢＬＢＩ０－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で発酵させた。
発酵培地処方を表３（残量が水である）に示し、ｄ１の意味は、０．１Ｌである。
制御プロセスを表４に示す。接種完了の初期時刻で、系における菌濃度は、１５ｇ／Ｌである。発酵中に、５０－５５％のブドウ糖水溶液を補充することによって系の糖度（残糖）を制御した。
以上の実施例で構築された各組換え菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０をＢＬＢＩ０－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で発酵させた。
発酵培地処方を表３（残量が水である）に示し、ｄ１の意味は、０．１Ｌである。
制御プロセスを表４に示す。接種完了の初期時刻で、系における菌濃度は、１５ｇ／Ｌである。発酵中に、５０－５５％のブドウ糖水溶液を補充することによって系の糖度（残糖）を制御した。
いずれも３つの繰り返し処理を設定し、結果を表５に示す。
結果は、表５に示すように、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子コード領域に対して点変異ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ及び過剰発現を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の生産量の向上に有利であるが、遺伝子を弱化又はノックアウトすることにより、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。
以上、本発明について詳細に記述した。当業者にとって、本発明の主旨と範囲を逸脱することなく、及び不必要な実験を行うことなく、同等のパラメータ、濃度と条件で、より広範囲内で本発明を実施することができる。本発明は、特別な実施例を与えるが、本発明をさらに改良できると理解されるべきである。要すると、本発明の原理によれば、本出願は、任意の変更、用途又は本発明の改良を含むことが望ましく、本出願において開示された範囲から逸脱し、本分野で既知の従来技術を用いた変更を含む。以下に付随する請求項の範囲によれば、いくつかの基本的特徴の応用を行うことができる。
本発明は、本発明がＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を弱化又はノックアウトすることにより、該遺伝子のコードする産物がＬ－グルタミン酸生産能力に影響を与えることを発見し、コード配列に点変異を導入し、又は該遺伝子のコピー数を増加又は過剰発現させることによりを得組換え菌株、得られた菌株が未改造菌株と比べて、高濃度のグルタミン酸を生産するのに有利であるという役割を開示した。
菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、受託番号：ＣＧＭＣＣ ２１２２０
Claims (20)
- Ｌ－グルタミン酸生産細菌であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されており、
好ましくは、前記改善された発現は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸生産細菌。 - ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点変異により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の３７２番目のアスパラギン酸は、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、３７２番目のアスパラギン酸は、アスパラギンで置換される、ことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌。
- 前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基の変異により形成され、
好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含み、
好ましくは、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。 - 前記細菌は、コリネバクテリウム属細菌であり、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）であり、さらに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０又はＡＴＣＣ １３８６９である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌。
- ポリヌクレオチド配列であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、ここで、３７２番目のアスパラギン酸は、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、３７２番目のアスパラギン酸は、アスパラギンで置換され、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基の変異により形成され、好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１１１４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異であり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド配列。 - 前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される、ことを特徴とするタンパク質。
- 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換え菌株。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌を培養し、前記培養物からＬ－グルタミン酸を回収することを含む、Ｌ－グルタミン酸の製造方法。
- ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクと命名されたタンパク質であって、ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの３７２番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からアスパラギンに変異して得られたものであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクタンパクは、
（ａ１）配列表の配列３に示されるタンパク質、又は
（ａ２）細菌由来であり且つ（ａ１）と９５％以上の同一性を有し且つ細菌のグルタミン酸生産に関連するタンパク質、又は
（ａ３）（ａ１）に示されるタンパク質を、一つ又は複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られ且つ細菌のグルタミン酸生産に関連する（ａ１）から誘導されるタンパク質である、タンパク質。 - 請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクのコード遺伝子。
- 請求項１２に記載のコード遺伝子を有する発現カセット又は組換えベクター又は組換え菌。
- （Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用である、請求項１１に記載のタンパク質、請求項１２に記載のコード遺伝子、請求項１３に記載の発現カセット、請求項１３に記載の組換えベクター又は請求項１３に記載の組換え菌の応用。 - 特定物質の応用であって、
（Ｉ）細菌グルタミン酸の生産量の向上への応用、又は
（ＩＩ）グルタミン酸生産への応用であり、
前記特定物質は、
（ｄ１）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ２）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの存在度を向上させるための物質、
（ｄ３）ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの活性を向上させるための物質、
（ｄ４）ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子の発現を向上させるための物質、
（ｄ５）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの存在度を向上させるための物質、又は
（ｄ６）ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの活性を向上させるための物質であり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクをコードする遺伝子であり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００タンパクであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクをコードする遺伝子である、特定物質の応用。 - 組換え菌であって、細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子又はＢＢＤ２９＿１４９００を過剰発現させて得られたものであり、前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子は、請求項１５に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子であり、前記ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、請求項１５に記載のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子である、組換え菌。
- 請求項１６に記載の組換え菌の、グルタミン酸の製造における応用。
- 細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法であって、細菌ゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子をＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子に置き換えるステップを含み、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子は、請求項１５に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子であり、前記ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、請求項１５に記載のＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子である、細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法。 - 細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法であって、細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子を過剰発現させるか又は細菌においてＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子を過剰発現させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの存在度を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの存在度を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクの活性を向上させるか又は細菌におけるＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの活性を向上させるステップを含み、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｇ１１１４Ａ遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクをコードする遺伝子であり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００タンパクであり、
前記ＢＢＤ２９＿１４９００遺伝子は、前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクをコードする遺伝子である、細菌のグルタミン酸の生産量を向上させる方法。 - 前記ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパクであり、前記ＢＢＤ２９＿１４９００タンパクは、請求項１１に記載のＢＢＤ２９＿１４９００タンパクである、ＢＢＤ２９＿１４９００Ｄ３７２Ｎタンパク又はＢＢＤ２９＿１４９００タンパクの、細菌のグルタミン酸の生産量の制御における応用。
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