CN117264034B - Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 - Google Patents
Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264034B CN117264034B CN202311554152.1A CN202311554152A CN117264034B CN 117264034 B CN117264034 B CN 117264034B CN 202311554152 A CN202311554152 A CN 202311554152A CN 117264034 B CN117264034 B CN 117264034B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bbd29
- protein
- corynebacterium glutamicum
- nucleic acid
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 7
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 5
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 10
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000424760 Corynebacterium crenatum Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
- C12P13/18—Glutamic acid; Glutamine using biotin or its derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/265—Micrococcus
- C12R2001/28—Micrococcus glutamicus ; Corynebacterium glutamicum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了BBD29_09715基因突变体及其在制备L‑谷氨酸中的应用。本发明提供了BBD29_09715蛋白突变体，是将BBD29_09715蛋白（SEQ ID No.3）的第198位氨基酸残基由G替换为D后得到的蛋白质。本发明的有益效果：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09715基因编码区进行点突变BBD29_09715 G593A（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_09715基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列），可以显著提高L‑谷氨酸产量。本发明对提高L‑谷氨酸产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及BBD29_09715基因突变体及其在制备L-谷氨酸中的应用。
背景技术
L-谷氨酸作为最大宗的氨基酸品种，具有成熟的发酵生产工艺。目前，L-谷氨酸的工业生产以葡萄糖为主要碳源，采用谷氨酸棒杆菌生物素亚适量控制工艺与温度敏感突变株发酵工艺，应用的菌株大多通过诱变筛选获得。
谷氨酸生产菌的代谢及其调控是一个十分活跃的研究课题，谷氨酸固然与我们日常生活关系密切，其需要量也极大。因此，这些关于谷氨酸的代谢很为人们所关注。
目前，L-谷氨酸的生产主要通过微生物发酵法生产，其中最主要的生产菌株为谷氨酸棒杆菌。在谷氨酸棒杆菌中，主要由TCA循环的中间产物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下生产L-谷氨酸。
RNA结合转录辅助蛋白是一类可以与特定RNA和DNA结合的蛋白质，以调节基因转录的速率，能够增强或者抑制靶基因的表达，在细胞的代谢过程中发挥着重要的作用。
由于L-谷氨酸合成途径较短，可改造靶点和策略相对有限，因此工业菌种水平进一步改造提升的难度很大，因此，本领域仍需进一步鉴定能够影响L-谷氨酸合成、转运和调节的新靶点，以提高L-谷氨酸的产量。
目前，对于BBD29_09715基因编码的RNA结合转录辅助蛋白在谷氨酸发酵过程中提高L-谷氨酸产量方面还未见报道。
发明内容
为了有效解决上述技术问题，本发明将产L-谷氨酸菌株的编码RNA结合转录辅助蛋白的编码基因BBD29_09715进行点突变，以增强L-谷氨酸转录水平的调控能力，其相对于野生型菌株而言，L-谷氨酸的产量有所提高，在生产中可降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略。
第一方面，本发明要求保护BBD29_09715蛋白突变体。
本发明所要求保护的BBD29_09715蛋白突变体是将BBD29_09715蛋白的第198位氨基酸残基由G替换为D后得到的蛋白质；
所述BBD29_09715蛋白可包含（或为）如下任一：
（A1）如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
即所述BBD29_09715蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面中所述BBD29_09715蛋白突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子可包含（或为）如下任一：
（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（B2）与（B1）限定的DNA序列具有95%以上同一性且编码所述BBD29_09715蛋白突变体的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物（如重组菌）。
进一步地，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
进一步地，所述表达盒由启动子、由所述启动子启动表达的所述核酸分子，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述核酸分子连接，且所述核酸分子与所述转录终止序列连接。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子。
进一步地，所述重组微生物（如重组菌）为含有所述表达盒或所述重组载体的重组微生物（如重组菌）。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌（brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌（Pantoea）。进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。更进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
进一步地，所述重组菌为重组细菌，如重组谷氨酸棒杆菌。
更进一步地，所述重组菌为将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后得到的重组菌。
其中，编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子可包含（或为）如下任一：
（C1）SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（C2）与（C1）限定的DNA序列具有95 %以上同一性且编码所述BBD29_09715蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95 ％以上同一性具体可为96 ％以上同一性或97 ％以上同一性或98 ％以上同 一性或99 ％以上同一性。
具体地，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中SEQID No.4的第593位由G突变为A（其他核苷酸序列不变）实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_09715G593A实现的。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第一方面中所述的BBD29_09715蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸（如L-谷氨酸）中的应用；
P2、前文第一方面中所述的BBD29_09715蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量中的应用；
P3、前文第一方面中所述的BBD29_09715蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株中的应用。
第五方面，本发明要求保护一种提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的方法。
本发明要求保护的提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的方法，可包括如下步骤：将细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，实现细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的提高。
第六方面，本发明要求保护一种构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株的方法，可包括如下步骤：将细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，得到所述产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株。
在第五方面和第六方面中，编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子可包含（或为）如下任一：
（C1）SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（C2）与（C1）限定的DNA序列具有95 %以上同一性且编码所述BBD29_09715蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95 ％以上同一性具体可为96 ％以上同一性或97 ％以上同一性或98 ％以上同 一性或99 ％以上同一性。
具体地，将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中SEQ ID No.4的第593位由G突变为A（其他核苷酸序列不变）实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_09715G593A实现的。
进一步地，在所述方法中，将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后，还可包括对所得重组细菌（如谷氨酸棒杆菌）进行发酵培养的步骤。从发酵培养产物中可以获得L-氨基酸（如L-谷氨酸）。
进行所述发酵培养本领域技术人员可以采用现有技术中方法进行，也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行所述发酵培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH（如控制pH为6.8-7.0）。在培养中，培养物的温度可以是30至40 ℃。在培养中，可以控制流加糖浓度（如控制为50-55 %，即100 mL液体中含糖的质量是50-55 g），控制发酵体系残糖（如控制为0.5-1.0 %，即100 mL液体中含糖的质量是0.5-1.0 g）。
在本发明的具体实施方式中，进行所述发酵培养时采用的培养基的配方见表2，余量为水。进行所述发酵培养时，发酵控制工艺见表3。
在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
相应地，前文第三方面中所要求保护的重组菌具体为重组菌YPG-09715或重组菌G09715。
所述重组菌YPG-09715与所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220的区别仅在于：所述重组菌YPG-09715为将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220基因组中BBD29_09715基因（SEQ IDNo.4）替换为突变后BBD29_09715基因序列（SEQ ID No.2）（具体可通过将SEQ ID No.4的第593位由G突变为A实现），并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌G09715与所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的区别在于：所述重组菌G09715为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869基因组中BBD29_09715基因（SEQ ID No.4）替换为突变后BBD29_09715基因序列（SEQ ID No.2）（具体可通过将SEQ IDNo.4的第593位由G突变为A实现），并保持其他序列不变得到的菌株。
在上述各方面中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
本发明的BBD29_09715蛋白突变体可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的谷氨酸，所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明BBD29_09715蛋白突变体的编码基因置于目的产物合成途径中，并对合成途径中的基因进行表达，即可实现目的产物的生产。
实验证明：本发明在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09715基因编码区进行点突变BBD29_09715G593A（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_09715基因编码区野生型序列替换为SEQID No.2所示的突变序列），可以显著提高L-谷氨酸产量（P<0.01）。本发明对提高L-谷氨酸产量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。下文简称谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。保藏人宁夏伊品生物科技股份有限公司已经授权内蒙古伊品生物科技有限公司使用该菌株。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869为ATCC中编号为13869的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。下文简称谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
实施例1、构建包含点突变的BBD29_09715基因编码区片段的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869基因组序列，设计并合成两对扩增BBD29_09715基因编码区及其上游序列的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_09715基因）及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_09715基因编码区中引入点突变，所述点突变为将BBD29_09715基因编码区的野生型核苷酸序列（SEQ ID No.4）的第593位鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A，其他序列不变，得到SEQ IDNo.2所示的BBD29_09715基因突变序列。SEQ ID No.4编码SEQ ID No.3所示的BBD29_09715野生蛋白；上述点突变导致BBD29_09715野生蛋白的第198位的甘氨酸（G）突变为天冬氨酸（D），即得到SEQ ID No.1所示BBD29_09715突变蛋白。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示的BBD29_09715突变蛋白。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下（上海invitrogen公司合成），加粗字体的碱基为突变位置：
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGCCTCGCGATAGAAACTG-3'，
P2：5'-CGGGCAAGGAGCAGGAAGACGCAAAGTTCAAGGACTAC-3'，
P3：5'-GTAGTCCTTGAACTTTGCGTCTTCCTGCTCCTTGCCCG-3'，
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGATGGGGAAAGAGGCCGTGC-3'。
注：P1和P4上下划线部分是pK18mobsacB载体上自带的序列。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物对P1/P2和引物对P3/P4进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小均为781 bp的BBD29_09715基因编码区的DNA片段，分别命名为BBD29_09715Up（引物对P1/P2的扩增产物）和BBD29_09715 Down（引物对P3/P4的扩增产物）。
PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg2+（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL。
PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s）30个循环；72 ℃过度延伸10 min。
将上述两条DNA片段（BBD29_09715Up和BBD29_09715 Down）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切（Xba I和BamHI）后纯化的pK18mobsacB质粒（BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆经M13引物（M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’）PCR鉴定获得阳性重组载体，命名为pK18-BBD29_09715G593A。
将酶切正确的重组质粒pK18-BBD29_09715G593A送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变（G-A）的重组载体pK18-BBD29_09715G593A 保存备用。
重组载体pK18-BBD29_09715G593A的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点Xba I和BamHI之间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1486位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
重组载体pK18-BBD29_09715G593A中含有完整的SEQ ID No.5。SEQ ID No.5的第1-36位和第1487-1524位为pK18mobsacB质粒上自身序列；第37-1355位为谷氨酸棒杆菌基因组上BBD29_09715基因编码区前半部分序列的反向互补序列；第1356-1486位为BBD29_09715基因编码区上游序列的反向互补序列。其中，SEQ ID No.5的第763位为突变位点，该突变位点使得谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中BBD29_09715基因编码区的第593位的鸟嘌呤（G）突变为腺嘌呤（A）（对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第593位）。
实施例2、构建包含基因BBD29_09715 G593A的工程菌株
构建方法：将实施例1中构建得到的等位替换质粒（pK18-BBD29_09715G593A）通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R（5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’）进行鉴定，能扩增出1531 bp（序列如SEQ ID No.6所示）大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，各选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的八株菌株（即与基因组发生同源重组阳性的菌株）进一步采用P1和P4引物（序列参见实施例1）扩增后，将PCR产物进行测序，通过序列比对，均获得BBD29_09715基因编码区的第593位碱基序列发生突变（G-A）（对应SEQ ID No.2和SEQ IDNo.4的第593位）的菌株，即为等位替换成功的阳性菌株，分别命名为YPG-09715、G09715。
重组菌YPG-09715和G09715含有SEQ ID No.5的第37-1486位所示的包括突变基因BBD29_09715G593A的片段。
重组菌YPG-09715与谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCCNo.21220的区别仅在于：YPG-09715为将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220的BBD29_09715基因编码区的野生型序列（SEQ ID No.4）替换为突变序列（即SEQ ID No.2），并保持其他序列不变得到的菌株。
重组菌G09715与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869的区别在于：G09715为将ATCC13869的BBD29_09715基因编码区的野生型序列（SEQ ID No.4）替换为突变序列（即SEQID No.2），并保持其他序列不变得到的菌株。
实施例3、L-谷氨酸发酵实验
将上述实施例2构建的重组菌株（YPG-09715、G09715）和对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）中以表2所示的培养基和表3所示的控制工艺进行发酵实验。发酵结束采用SBA生物传感仪器（SBA-40E）检测L-谷氨酸产量与OD(562nm)。每个菌株重复三次，结果如表4和表5所示。
如表4和表5所示，在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09715基因编码区进行点突变BBD29_09715G593A（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_09715基因编码区野生型序列替换为SEQID No.2所示的突变序列），可以显著提高L-谷氨酸产量（p<0.01）。
上述实施例L-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析，实验结果P<0.05(*)表示具有显著性差异，P<0.01(**)表示具有极显著性差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1. BBD29_09715蛋白突变体，其特征在于：所述BBD29_09715蛋白突变体是将BBD29_09715蛋白的第198位氨基酸残基由G替换为D后得到的蛋白质；
所述BBD29_09715蛋白为如下任一：
（A1）如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.编码权利要求1所述BBD29_09715蛋白突变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（B2）与（B1）限定的DNA序列具有95%以上同一性且编码所述BBD29_09715蛋白突变体的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。
5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子后得到的重组菌。
6.权利要求1所述的BBD29_09715蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌在谷氨酸棒杆菌生产L-谷氨酸中的应用。
7.权利要求1所述的BBD29_09715蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体在提高谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量中的应用。
8.权利要求1所述的BBD29_09715蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体在构建产L-谷氨酸工程菌株中的应用；所述L-谷氨酸工程菌株为谷氨酸棒杆菌。
9.一种提高谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量的方法，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子，实现谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量的提高。
10.一种构建产L-谷氨酸工程菌株的方法，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_09715蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子，得到所述产L-谷氨酸工程菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311554152.1A CN117264034B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311554152.1A CN117264034B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117264034A CN117264034A (zh) | 2023-12-22 |
| CN117264034B true CN117264034B (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89216373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311554152.1A Active CN117264034B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117264034B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006200807A1 (en) * | 1999-06-25 | 2006-03-23 | Basf Aktiengesellschaft | Coryneracterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| CN114409751A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-29 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 一种yh66_04470基因突变的重组菌及其在制备精氨酸中的应用 |
| CN114835783A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-02 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 |
| CN116063417A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-05 | 内蒙古伊品生物科技有限公司 | Bbd29_14255基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
-
2023
- 2023-11-21 CN CN202311554152.1A patent/CN117264034B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006200807A1 (en) * | 1999-06-25 | 2006-03-23 | Basf Aktiengesellschaft | Coryneracterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| CN114409751A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-29 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 一种yh66_04470基因突变的重组菌及其在制备精氨酸中的应用 |
| CN114835783A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-02 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 |
| CN116063417A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-05 | 内蒙古伊品生物科技有限公司 | Bbd29_14255基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117264034A (zh) | 2023-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2022143761A1 (zh) | 一种改造基因bbd29_04920的产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| US20240067998A1 (en) | Strain having enhanced l-glutamic acid productivity, construction method therefor and application thereof | |
| CN111471693B (zh) | 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN110218749B (zh) | 用改变NCgl1859的细菌发酵生产赖氨酸的方法 | |
| KR100830290B1 (ko) | Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법 | |
| WO2023231547A1 (zh) | NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 | |
| CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| CN116063417A (zh) | Bbd29_14255基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN117264034B (zh) | Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| US20240076701A1 (en) | Recombinant strain with modified gene bbd29_14900, and method for constructing the same and use thereof | |
| EP4230723A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| CN115975957A (zh) | 大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI及其突变体在L-氨基酸生产中的应用 | |
| CN112522175B (zh) | 一种改造基因bbd29_09525产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN112625992B (zh) | 一种改造基因bbd29_11265产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN117264924B (zh) | Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN117551181A (zh) | Bbd29_04985基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN114369559B (zh) | 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN117568299A (zh) | Bbd29_06325基因突变体及其应用 | |
| CN114249803B (zh) | 一种高产精氨酸的工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN117551708A (zh) | 一种制备l-谷氨酸的方法及其相关bbd29_13530基因突变体 | |
| CN114539367B (zh) | Cey17_rs11900基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 | |
| CN117535293A (zh) | Bbd29_03870基因启动子突变体及其应用 | |
| CN114410615B (zh) | Yh66_00525蛋白及其编码基因在调控细菌精氨酸产量中的应用 | |
| CN117535335A (zh) | Bbd29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产l-谷氨酸中的应用 | |
| CN112266891B (zh) | 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |