KR100830290B1

KR100830290B1 - Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100830290B1
Application number: KR1020070005832A
Authority: KR
Inventors: 김혜원; 최혜진; 이지혜; 황수연; 이선영
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2007-01-18
Publication date: 2008-05-16
Also published as: WO2008088149A1

Abstract

본 발명은 L-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소의 유전자로 추정되는 argF2 유전자(Ncgl0990)를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-아르기니 생산 숙주미생물에 도입하여 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-아르기닌을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체는 L-아르기닌 생산 숙주미생물에서 argF2 유전자를 과발현시켜 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있어, 인간 의약 및 약학산업 등에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Ｌ－아르기닌, argF2 유전자(Ncgl0990), 재조합 벡터, 형질전환체

Description

Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법 {Corynebacterium glutamicum Variety Producing L-Arginine and Method for Fabricating the Same}

도 1은 argF2 유전자, CJ1 프로모터 및 rrnB ₁ B ₂ 터미네이터를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pHC131T-argF2의 제작도이다.

본 발명은 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있어 인간 의약 및 약학산업에 유용하게 사용할 수 있는 L-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소의 유전자로 추정되는 argF2 유전자(Ncgl0990)를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-아르기닌 생산 숙주미생물에 도입하여 argF2 유전자를 과발현시켜 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-아르기닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있으며, 아미노산류 강화제로도 사용되고, 의약품, 식품 등에도 널리 이용된다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

종래에 알려져 있는 생물학적 발효법에 의한 L-아르기닌의 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로서, 글루타민산(glutamate) 생산 균주인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본공개특허 소화 57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산 균주를 이용하는 방법(일본공개특허 소화 59-158185) 등이 보고되었다. 최근에는 아르기닌 생합성 오페론의 발현을 억제하는 유전자 argR을 불활성화시킨 유전자 재조합 균주를 이용하는 방법(미국특허 US2002/0045223A1)과 아르기닌 오페론의 argF를 과발현(over-expression)시키는 방법(대한민국 특허출원번호 제10-2004-107215호) 등이 보고되어 있다.

미생물에서 L-아르기닌의 생합성은 선형 단계와 고리형 단계의 서로 다른 두 개의 경로를 통해, L-글루타민산(L-glutamate)으로부터 8단계의 효소계(enzyme systeme)를 거쳐서 이루어진다.

코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물은 고리형 단계 경로를 통해 아르기닌 생합성이 이루어지며, 고리형 단계에서, L-아르기닌은 L-글루타메이트에서 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate), N-아세틸글루타밀포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate), N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde), N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 및 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다. 상기 중간물질들은 각각 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제(glutamate N-acetyltransferase), N-아세틸글루타메이트 키나아제(N-acetylglutamate kinase), 아세틸글루타메이트 세미알데히드 디하이드로게나제(acetylglutamate semialdehyde dehydrogenase), 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제(acetylornithine aminotransferase), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine cabomoyltransferase), 아르기노숙시네이트 신타아제(arginosuccinate synthase) 및 아르기노숙시네이트 리아제(arginosuccinate lyase)의 연속적인 효소반응에 의해 합성되며, 상기 효소들은 각각 argJ , argB , argC , argD , argF , argG 및 argH 에 의해 코딩된다.

본 발명자들은 L-아르기닌을 고수율로 생산하기 위해, L-아르기닌 생합성에 관여하는 효소들에 대해 오랜 기간 연구를 수행하였으며, 아르기닌 생합성 중간 단계인 오르니틴(ornithine)이 시트룰린(citrulline)으로 전환되는 효소반응을 증폭시킬 경우 L-아르기닌 생합성 플럭스(flux)가 강화되어 L-아르기닌의 생산성을 향 상시킬 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 오르니틴 카바모일기 전이효소(ornithine carbamoyltransferase)를 코딩하는 argF 유전자를 증폭시킴으로써 L-아르기닌의 생산수율을 높일 수 있음을 확인한바 있으며(대한민국 특허출원 제10-2006-065989), L-아르기닌을 고수율로 생산하는 균주에 대한 후속 연구를 계속하고 있다.

현재까지 알려진 사실에 의하면 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우, 아르기닌 생합성에 관여하는 argCJBDF 유전자가 오페론(operon)의 형태로 이루어져 있으며, 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback-inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al , Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의 L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 L-아르기닌의 생산 수율을 더욱 높일 수 있는 균주를 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 오르니틴 카바모일기 전이효소를 코딩하는 argF 유전자와 같은 기능을 하는 것으로 추정되는 argF2 유전자로 형질전환된 미생물이 argF2 유전자를 과발현시켜 L-아르기닌 생산 모균주에 비해 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소의 유전자로 추정되 는 argF2 유전자(Ncgl0990)가 코딩하는 폴리펩티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 벡터를 도입하여 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있는 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 형질전환체를 배양하여 L-아르기닌을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

일 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소(ornithine carbamoyltransferase)의 유전자로 추정되는 argF2 유전자(Ncgl0990)가 코딩하는 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 1로 표시될 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소의 유전자로 추정되는 argF2 유전자(Ncgl0990)는, 염기서열분석에 의하면 마그네토스피릴럼 마그네토탁티쿰(Magnetospirillum magnetotacticum)의 argF 유전자와 아미노산 서열에서 32%의 상동성을 가지며, N-terminal 부위에 카바모일포스페이트 결합 도메인(carbamoyl-P binding domain)을 갖는 것으로 알려져 있으나(KEGG Database), 아직까지 argF2 유전자에 의해 코딩되 는 단백질의 명확한 기능이 정의되어 있지 않다. 다만, argF와 argF2 유전자의 염기서열의 상동성은 낮으나, KEGG에서 모티프 검색(motif search)을 하였을 경우 argF2에서 pf:OTCace_N(Aspartate/ornithine carbamoyltransferase, carbamoyl-P binding domain)과 pf:OTCace (Aspartate/ornithine carbamoyltransferase, Asp/Orn binding domain)가 존재하고 있음을 확인하였으며, argF의 경우도 위와 동일한 모티프를 가지는 것으로 조사되었다. 상기와 같이 두 유전자는 Carbamyl-P 결합영역 및 Asp/Orn 결합영역을 갖고 있어, argF2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 argF 유전자에 의해 코딩되는 아르기닌 생합성 과정에 필요한 오르니틴 카바모일기 전이효소와 유사한 기능을 가질 것으로 추정되고 있을 뿐이었다(KEGG Database 검색 결과). 본 발명의 구체적 실시예에서는, argF2 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 L-아르기닌 생산 균주가 모균주에 비해 향상된 L-아르기닌 생산 수율을 가짐을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열이 서열번호 2로 표시될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게, 상기 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로서, 본 발명의 구체적인 실시예에 따라 제조된 pHC131T-argF2 인 재조합 벡터일 수 있다(도 1).

상기 재조합 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 실시예에서는, L-아르기닌 생산 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 PCR에 의해 argF2 유전자의 ORF 부위를 증폭하였다. argF2 유전자의 과발현을 위한 재조합 벡터의 제작을 위해, pECCG117-CJ1과 E. coli K-12를 주형으로 하여 각각 CJ1 프로모터(등록특허 제10-0620092호) 및 rrnB ₁ B ₂ 터미네이터 부위를 증폭하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스 Hsp60의 상단부위로 코리네박테리움 글루타미쿰에서 강하게 발현되는 것으로 밝혀져 있는 CJ1 프로모터와, 일반적으로 상용되는 rrnB1B2 터미네이터를 각각 프로모터와 터미네이터로 사용하였다. 이때, 얻어진 argF2 유전자의 염기서열을 통상적인 시퀀싱 방법에 의해 분석하였으며, 상기 수득한 프로모터 부위, 터미네이터 부위 및 argF2 유전자를 적합한 플라스미드 또는 기타 클로닝 벡터 내로 클로닝하여 적절한 적격세포(competent cell)에 형질전환하여 그로부터 조합 벡터를 제조하였다(도 1).

상기 재조합 벡터의 제조방법에 있어서, 클로닝 벡터는 원핵 또는 진핵세포에서 발현 가능한 임의의 벡터를 사용할 수 있으며, 본원 발명의 구체적 실시예에서는, 플라스미드 pECCG117(Han J.K., et al , Biotechnology letters , 13(10):721-726, 1991 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)을 사용하였다. 또한, 상기 L-아르기닌 생산 균주는 원핵 및 진핵을 포함한 L-아르기닌을 생성할 수 있는 모든 미생 물일 수 있으며, 바람직하게는 L-아르기닌을 생산할 수 있는 대장균, 코리네형 세균, 바실러스속 세균, 더욱 바람직하게는 L-아르기닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, argF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 제공한다.

구체적으로, 상기 숙주 미생물은 원핵 및 진핵을 포함한 L-아르기닌을 생성할 수 있는 모든 미생물일 수 있다. 바람직하게, 에스케리키아(Escherichia), 에어로박터(Aerobacter), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 피치아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 뮤코(Mucor), 토룰롭시스(Torulopsis), 메틸로박터(Methylobacter), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 브레비박테리움(Brevibacterium), 마그네토스피릴럼(Magnetospirillum) 및 코리네박테리움(Corynebacterium) 속(species)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나, 더욱 바람직하게는 L-아르기닌 유사체에 대한 내성을 가지며, L-아르기닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움(Corynebactrium) 속에 속하는 미생물, 더더욱 바람직하게는 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC21831일 수 있다. L-아르기닌 유사체로는 작두콩에 들어 있는 알파 아미노산의 하나인 카나바닌(canavanine) 및 아르기닌 하이드록사메이트(arginine hydroxamate)가 포함된다.

본 발명의 특정 구현예에서는 상기 재조합 벡터 pHC131T-argF2를, L-아르기 닌 유사체에 대한 내성을 가지며 L-아르기닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC21831에 도입하여 형질전환시킨 미생물 “CA06-0011”을 제조하였으며, 이를 2006년 12월 13일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, 이하 "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM10819P로서 기탁하였다.

상기 형질전환체는 임의의 형질전환 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는, 전기천공법을 이용하여 상기 재조합 벡터 pHC131T-argF2를 숙주미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 제조하였으며, 항생제 내성을 이용하여 재조합 벡터를 포함하는 균주를 분리하였다.

상기 본 발명에 따라 제조된 형질전환된 미생물의 L-아르기닌 생성능을 더욱 증대시키기 위해, 통상적인 유전자 재조합 기술에 의해 상기 형질전환된 미생물의 염색체에 존재하는 argF2 유전자를 발현(expression)시키거나 결손(deletion)시키 는 방법을 추가로 수행할 수 있으며, 이들의 유전자 염기서열은 형광물질을 활용한 시퀀싱 방법에 의해서 분석될 수 있음은 본 발명의 기술분야에서 공지된 사실일 것이다.

L-아르기닌을 생합성 하는 경로에서, 오르니틴은 아르기닌 대사 경로의 중간체로서 요소회로(urea cycle)와 함께 질소대사에 중요한 물질이다. 본 발명의 방법으로 형질전환된 CA06-0011균주는 L-아르기닌의 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체로부터 PCR을 통해 수득한 오르니틴 카바모일기 전이효소 기능을 할 것으로 추정되는 단백질을 코딩하는 argF2 유전자를 벡터에 삽입한 후, L-아르기닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831에 도입함으로써 argF2 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환된 미생물이다. 본 발명에 의한 방법으로 형질전환된 상기 CA06-0011균주는 argF2 유전자의 과발현을 통해 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 하나의 양태에서는, 상기 형질전환체, 바람직하게는 수탁번호 KCCM10819P로 표시되는 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는 L-아르기닌의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 L-아르기닌을 제조하는 방법에서, 상기 형질전환된 L-아르기닌 과발현 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여 기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-아르기닌 생산량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다. 배양물로부터의 L-아르기닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시에 불과하며 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.

실시예 1. argF2 유전자, CJ1 프로모터 및 rrnB ₁ B ₂ 터미네이터의 준비

argF2 유전자, CJ1 프로모터 및 rrnB ₁ B ₂ 터미네이터를 포함하는 재조합 벡터 pHC131T-argF2 제작을 위해, L-아르기닌 생산 균주인 ATCC 13032의 게놈 DNA(gDNA)로부터 argF2 유전자의 오픈 리딩골격(Open Reading Frame, 이하 "ORF"로 약칭함)를 포함하는 DNA 단편 825bp을 얻었고, CJ1 프로모터는 pECCG117-CJ1(출원번호 제10-2004-107215호)을 주형으로 PCR을 수행하여 300bp의 단편을 얻었으며, rrnB ₁ B ₂ 터미네이터는 E. coli K-12 W3110의 게놈를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 411bp의 단편을 수득하였다.

실시예 1-1. argF2 유전자의 ORF 를 포함하는 DNA 단편의 증폭

Masterpure^TM Gram positive DNA purification kit(Epicentre사 제품, 이하 동일함)을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. argF2 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편 825bp를 증폭하기 위해, 상기 gDNA를 주형(template)으로 PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJ Research사 제품, USA, 이하 동일함)을 사용하여 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다. 이때, argF2 유전자의 ORF 부위 증폭에 사용된 프라이머들은 다음과 같다: 서열번호 5; 5'-acgcgatatcatggccagaaaacatctgc-3', 및 서열번호 6; 5'-catccgccaaaacagggatccgaaaaccgctacgcattgat-3'. PCR 반응조건은 변성(denaturation) 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 55℃ 30초, 연 장(elongation) 68℃ 1분, 이를 24회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 0.8Kb 크기의 밴드를 용출(溶出)하여 수득하였다.

실시예 1-2. CJ1 프로모터의 증폭

CJ1 프로모터를 증폭하기 위해, pECCG117-CJ1(출원번호 제10-2004-107215호)을 주형으로 PTC-200 Peltier Thermal Cycler를 사용하여 PCR을 수행하여 이때, CJ1 프로모터 증폭을 위해 사용한 프라이머들은 다음과 같다: 서열번호 3; 5'-cgggtaccaccgcgggcttattccattacat-3' 및 서열번호 4; 5'-acgcgatatcttaatctcctagattgggtttc-3'. PCR 반응조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 연장 68℃ 30초, 이를 24회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 0.3Kb 크기의 밴드를 용출하여 수득하였다.

실시예 1-3. rrnB ₁ B ₂ 터미네이터 증폭

Qiagen Genomic DNA kit(QIAGEN, Germany)을 이용하여 E. coli K-12 W3110의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. rrnB ₁ B ₂ 터미네이터 증폭을 위해, 상기 gDNA를 주형으로 PTC-200 Peltier Thermal Cycler를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, rrnB ₁ B ₂ 터미네이터 증폭을 위해 사용한 프라이머들은 다음과 같다: 서열번호 7; 5'-gctctagagctgttttggcggatgaga-3' 및 서열번호 8; 5'- ataagaatgcggccgccgcaaaaaggccatccgtcag-3'. PCR 반응조건은 상기 실시예 1-2의 CJ1 프로모터 증폭을 위한 조건과 동일하게 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 411bp 단편을 용출하여 수득하였다.

실시예 2. 재조합 플라스미드 제작

실시예 2-1. 재조합 플라스미드 pHC131T 의 제작

이. 콜라이/씨.글루타미쿰 셔틀벡터(E. coli /C. glutamicum shuttle vector)인 플라스미드 pECCG-117(Han J.K., et al , Biotechnology letters , 13(10):721-726, 1991 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)을 제한효소 EcoRⅤ와 KpnⅠ으로 처리한 다음, 이를 0.8% 아가로스 겔에서 약 5.9Kb 크기의 밴드를 용출하였다. 또한, 상기 실시예 1-2에서 준비한 CJ1 프로모터를 제한효소 KpnⅠ과 EcoRⅤ로 처리한 후 Quiaquick PCR purification kit(Qiagen사의 제품, 이하 동일함)을 이용하여 분리하였다.

Quick ligation kit(NEB사의 제품, 이하 동일함)를 이용하여, 상기 두 DNA 단편을 연결시켜 재조합 플라스미드 pECCG117-CJ1을 제작한 다음, 이에 제한효소 XbaⅠ과 NotⅠ을 처리하였으며, 이를 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 약 6.2Kb 크기의 밴드를 용출하였다.

Quick ligation kit를 이용하여, 상기에서 수득한 pECCG117-CJ1과 상기 실시예 1-3에서 수득한 rrnB ₁ B ₂ 터미네이터 단편을 연결시켜 재조합 플라스미드 pECCG117-CJ1-rrnB₁B₂(약 6.6Kb)를 수득하였으며, 이를 "pHC131T"로 명명하였다.

상기 제작한 pHC131T 플라스미드를 EcoRⅤ와 BamHI으로 처리한 다음, 1% 아가로스 겔에서 약 6.6Kb 크기의 밴드를 용출하여 수득하였다.

실시예 2-2. pHC131T - argF2 플라스미드의 제작

상기 실시예 1-1에서 수득한 argF2 유전자의 PCR 결과물을 제한효소 EcoRⅤ와 BamHI으로 처리한 다음, 이를 Quiaquick PCR purification kit를 이용하여 분리하였다. Quick ligation kit를 이용하여, 상기 실시예 2-1에서 제작한 pHC131T와 연결시켜 약 7.4Kb의 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1). 본 발명에서는 이를 "pHC131T-argF2" 재조합 플라스미드라 명명하였다.

실시예 3. argF2 유전자의 염기서열 분석

상기 실시예 2-2에서 제작한 pHC131T-argF2의 염기서열 분석을 위해, pHC131T-argF2의 DNA 0.1 ug을 주형으로 PCR을 수행하였다. 이때, 사용한 프라이머는 각각 2 mM의 서열번호 3 및 서열번호 8, 사용한 반응액은 BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction(PE Biosystems 사의 제품) 1 ㎕, PCR 반응조건은 변성 95 ℃ 30 초, 어닐링 55 ℃ 30 초, 신장 72 ℃ 1분 30초이며, 이를 24 회 반복 수행한 후, PCR 반응액을 4 ℃로 냉각하여 반응을 종료시켰다. 상기 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 1.5Kb 크기의 DNA 단편을 용출하여 분리하였다.

상기 DNA 단편과 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer^TM (Applied Biosystems 사 제품)로 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 마그네토스피릴럼 마그네토탁티쿰(Magnetospirillum magnetotacticum)의 argF 유전자와 아미노산 서열에서 32%의 상동성을 가지고 있어, argF와 argF2 유전자의 염기서열의 상동성은 낮으나, KEGG에서 모티프 검색(motif search)을 하였을 경우 argF2에서 pf:OTCace_N(Aspartate/ornithine carbamoyltransferase, carbamoyl-P binding domain)과 pf:OTCace (Aspartate/ornithine carbamoyltransferase, Asp/Orn binding domain)가 존재하고 있음을 확인하였으며, argF의 경우도 위와 동일한 모티프를 가지는 것으로 조사되었다. 상기와 같이 두 유전자는 Carbamyl-P 결합영역 및 Asp/Orn 결합영역을 가지고 있어, argF2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 argF 유전자에 의해 코딩되는 아르기닌 생합성 과정에 필요한 오르니틴 카바모일기 전이효소와 유사한 기능을 가질 것으로 추정할 수 있었다(KEGG Database 검색 결과). 본 발명의 argF2 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과 이의 염기서열을 각각 서열번호 1 및 2에 나타내었다.

실시예 4. 형질전환 미생물의 제작

상기 실시예 2-2에서 제작한 재조합 플라스미드 pHC131T-argF2를 L-아르기닌 생산 균주인 ATCC21831에 전기충격요법(electroporation)으로 유입시켜 argF2 유전 자가 과발현된 형질전환체를 제작하였다. 이를 본 발명에서는 CA06-0011로 명명하였으며, 상기 형질전환체를 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganism)에 2006년 12월 13일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM10819P).

상기 ATCC21831균주 및 형질전환체인 CA06-0011을 가나마이신(Kanamycin) 25mg/L 함유 #3 (Nutrient medium, 이하 "#3"라 약칭하며, 조성은 Beef extract 3 g/L, 펩톤 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L이고, 이하 동일함) 고체 배지에 도말하여 30℃에서 16시간 배양하였으며, 선발한 콜로니에 대하여 하기 실시예 5에서와 같은 플라스크 역가 확인 실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 argF2 유전자가 과발현된 형질전환체가 L-아르기닌을 고수율로 생산하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 삼각 플라스크에서의 아르기닌 생산 역가 비교 실험

상기 실시예 4에서 제작한 형질전환체인 CA06-0011와 ATCC 21831 인 L-아르기닌 생산 균주를 항생제인 가나마이신(Kanamycin) 25mg/L 함유 #3 고체 배지에 도말하여 30℃에서 16시간 배양한 다음, 선별된 각 균주에서 콜로니 10주씩을 선별하였다. 이를 표 1에 나타낸 L-아르기닌 seed 배지(종배지)에서 배양한 다음, 다시 이를 표 1에 나타낸 역가 배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 L-아르기닌 생산성을 평균값으로 비교하였다.

조성	L-아르기닌 종배지	L-아르기닌 역가배지
포도당	5 %	4 %
박토펩톤	1 %	-
염화나트륨(NaCl)	0.25%	-
효모엑기스	1 %	-
비오틴	3 ㎍/L	200 ㎍/L
요소	0.4 %	0.3 %
pH	7.0	7.2
황산암모늄 (NH₄)₂SO₄)	-	3 %
제1인산칼륨 (KH₂PO₄)	-	0.1 %
제2인산칼륨 (K₂HPO₄)	-	0.1 %
황산마그네슘7수염 (MgSO₄7H₂O)	-	0.025 %
CSL(옥수수 침지액)	-	2.0 %

선별한 콜로니를 종배지에 접종한 후, 30℃ 배양기(incubator)에서 16시간 동안 배양한 다음, 배양액을 24 mL의 역가배지에 1 mL씩 접종하여 30℃, 220 rpm의 배양기에서 72시간 동안 배양하였으며, ATCC21831 및 형질전환체의 L-아르기닌 생산 역가 실험 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 아르기닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21831 균주에서는 L-아르기닌 생산량이 4.4 g/L인 반면, 본 발명의 argF2 유전자가 과발현된 재조합 균주 CA06-0011의 L-아르기닌 생산량은 5.2 g/L로, 모균주에 비해 0.6 g/L (18.2%)의 향상된 수율로 L-아르기닌을 생산함을 확인할 수 있었다.

생산량	균 주
생산량	모균주 (ATCC21831)	형질전환 미생물 (CA06-0011)
L-아르기닌 (g/L)	4.4	5.2

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 아르기닌 생합성에 관련된 오르니틴 카바모일기 전이효소의 유전자로 추정되는 argF2 유전자(Ncgl0990)를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-아르기닌 생산 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-아르기닌을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 형질전환체는 argF2 유전자를 과발현시켜 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있어, 인간 의약 및 약학산업에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

argF2 (NCBI 허가번호 Ncg10990) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 L-아르기닌 생산 미생물.
제1항에 있어서, argF2 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것인 L-아르기닌 생산 미생물.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 것인 L-아르기닌 생산 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 L-아르기닌 생산 미생물.
제1항에 있어서, 수탁번호 KCCM10819P로 표시되는 L-아르기닌 생산 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법.