KR20220129797A - L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 부산물의 생성을 저해하고 L-시트룰린을 고수율 및 고농도로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법에 관한 것이다.
L-시트룰린(citrulline)은 비필수 아미노산 중의 하나로, 시트룰린에는 암모니아 대사 촉진이나 혈관 확장에 의한 혈류 개선, 혈압 저하, 신경 전달, 면역력 증진, 활성 산소 소거 등의 유용한 작용이 있다는 점이 알려져 있다. 이러한 시트룰린은 아르기닌의 생합성 과정에서 중간 생산물로 합성된다. 미생물에서 아르기닌의 생합성은 선형 단계와 고리형 단계의 서로 다른 두 경로를 통해, L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 8번의 효소 단계를 거쳐서 이루어진다. 선형 단계에서, L-아르기닌은 L-글루타메이트에서 N-아세틸글루타메이트(N-acetyl glutamate), N-아세틸오르니틴(N-acetyl ornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 그리고 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다.
L-시트룰린 생산은 일반적으로 세균이나 효모와 같은 미생물을 이용한 발효에 의해 생산되며, 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 L-시트룰린 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다. 최근에는 L-시트룰린의 생산 효율을 개선시키기 위하여 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-시트룰린 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린 생산 방법이 개발되고 있다. 한국등록특허 제10-1102263호 및 제10-1053429호에 따르면, L-시트룰린 생산에 관련된 효소, 전사 인자 등 단백질의 활성 또는 발현을 강화하거나 약화함으로써 L-시트룰린 생산능이 향상됨을 확인하였다. 따라서 L-시트룰린의 생산 경로에 작용하는 효소를 포함한 다양한 단백질의 활성 또는 발현 조절을 통해 L-시트룰린의 생산량 또한 조절할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용하여 L-시트룰린 생산능이 향상된 새로운 변이주를 개발하기 위해 연구한 결과, L-시트룰린 생합성 경로에서 부산물로 생산되는 6-아세틸오르니틴의 생성에 관여하는 효소를 암호화하는 NCgl2657 유전자에 변이를 도입하거나 NCgl2657 유전자를 제거할 경우 그 효소의 활성이 약화 또는 불활성화되어 6-아세틸오르니틴의 생산량이 현저히 감소할 뿐만 아니라 L-시트룰린 생산량이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화된, L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제공한다.
본 발명에서 사용된 “NCgl2657 유전자”는 L-시트룰린 생합성 경로에서 아세틸-CoA와 포스페이트(phosphate)를 기질로 하여 아세틸오르니틴의 전구체인 아세틸포스페이트(acetyl phosphate)를 생성하는 효소 (phosphate acetyltransferase)를 암호화하는 유전자를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2657 유전자는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 수라나래에(Corynebacterium suranareeae), 코리네박테리움 루브리칸티스(Corynebacterium lubricantis), 코리네박테리움 두사넨세(Corynebacterium doosanense), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 우테레키(Corynebacterium uterequi), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 파캔세(Corynebacterium pacaense), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 휴미레듀센스(Corynebacterium humireducens), 코리네박테리움 마리눔(Corynebacterium marinum), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스페니스코룸(Corynebacterium spheniscorum), 코리네박테리움 프레이부르겐세(Corynebacterium freiburgense), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 카니스(Corynebacterium canis), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 레날레(Corynebacterium renale), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 카스피움(Corynebacterium caspium), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 코리네박테리움 슈도펠라지(Corynebacaterium pseudopelargi) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체에에 따르면, 상기 NCgl2657 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “활성이 약화”는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 약화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주, 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.
본 발명에서 사용된 "불활성화"는 효소, 전사 인자, 수송 단백질 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주, 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우이거나 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성 약화 또는 불활성화는 NCgl2657 유전자의 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 결실 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “일부”는 염기서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부가 아닌 것을 의미하며, 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성 약화 또는 불활성화는 NCgl2657 유전자의 개시코돈에 변이를 유발하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 NCgl2657 유전자의 개시코돈 변이는 NCgl2657 유전자의 개시코돈 ATG를 다른 염기, 예컨대 TTG, GTG로 치환하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 NCgl2657 유전자를 암호화하는 서열번호 1의 염기서열에서 개시코돈을 ATG에서 TTG로 치환하여 NCgl2657 유전자의 새로운 개시코돈을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 획득하였다. 이러한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 서열번호 2의 염기서열로 암호화된 NCgl2657 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성 약화 또는 불활성화는 NCgl2657 유전자를 제거 또는 결손하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 NCgl2657 유전자를 결손시켜 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 시트룰린이 과량 생산되도록 기 개발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에 비해 부산물인 아세틸오르니틴의 생산이 현저히 감소될 뿐만 아니라 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 획득하였다.
본 발명에서 사용된 “생산능이 향상된”은 모균주에 비해 L-시트룰린의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 야생형으로부터 변이된 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 모균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 NCgl2657 유전자의 개시코돈에 변이를 도입하거나 NCgl2657 유전자를 제거함으로써 모균주에 비해 증가된 L-시트룰린 생산능을 나타내며, 특히 모균주 또는 기 개발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에 비해 L-시트룰린 농도가 5% 이상, 구체적으로 5 내지 50%, 더욱 구체적으로 10 내지 30% 증가하며, 이때 부산물로 생산되는 6-아세틸 오르니틴이 20% 이상, 구체적으로 20 내지 100%, 더욱 구체적으로 30 내지 100% 감소하였다.
본 발명의 일 구체예에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 모균주에서 NCgl2657 유전자의 개시코돈이 변이된 변이체를 포함하는 재조합 벡터, 또는 NCgl2657 유전자를 결손하는 재조합 벡터를 통해 구현될 수 있다.
본 발명에서 사용된 “변이체”는 L-시트룰린의 생합성에 관여하는 NCgl2657 유전자의 개시코돈이 ATG에서 TTG로 치환된 유전자 변이체를 의미한다.
본 발명에서 사용된 “벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된(operably linked) 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 의미한다. 여기서, “작동 가능하게 연결된”은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결된 것을 의미하고, “조절요소”는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 “재조합 벡터”는 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이때, 상기 "적합한 숙주세포"는 벡터가 복제 가능한 것으로서 복제가 개시되는 특정 염기서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 형질전환 방법으로 전기 천공 방법 (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999)을 사용할 수 있다.
상기 숙주세포는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물이다.
또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환 된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환용 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자들은 상동성 재조합 교차로 인하여 코리네박테리움 속 균주, 대장균 등의 미생물과 같은 숙주세포 내로 치환될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 속 균주일 수 있으며, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 a) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-시트룰린을 회수하는 단계를 포함하는 L-시트룰린의 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이주 및 변이주가 배양된 배지에서 L-시트룰린을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-시트룰린을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, L-시트룰린을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-시틀룰린을 회수하는 단계는 L-시트룰린을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 부산물의 생성을 저해하고 L-시트룰린을 고수율 및 고농도로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조
NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 E. coli DH5a를 사용하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 증류수 1 L에 글루코오스 5 g, NaCl 2.5 g, 효모 추출물 5.0 g, 유레아(urea) 1.0 g, 폴리펩톤 10.0 g 및 비프(beef) 추출물 5.0 g 조성의 CM-broth 배지 (pH 6.8)에서 30℃의 온도로 배양하였다.
상기 E. coli DH5a는 증류수 1 L에 트립톤 10.0 g, NaCl 10.0 g 및 효모 추출물 5.0 g 조성의 LB 배지 상에서 37℃의 온도로 배양하였다.
항생제 카나마이신(kanamycin)은 시그마(Sigma)사의 제품을 사용하였고, DNA 시퀀싱 분석은 마크로젠(주)에 의뢰하여 분석하였다.
1-1. 재조합 벡터의 제작
Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, 미국)을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 추출한 후 이를 주형으로 하여 프라이머 1 및 2와 프라이머 3 및 4의 조합으로 각각 PCR을 수행하였다. 이를 통해 얻은 PCR 산물을 다시 프라이머 1 및 4의 조합을 이용하여 크로스오버(crossover) PCR로 증폭한 후 재조합 벡터 pK19mobSacB의 제한효소 HindIII, XbaI 위치에 삽입하였다. 이를 벡터 pK19ms/NCgl2657(A1T)로 명명하였다. 상기 벡터를 제작하는데 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다.
| 프라이머 | 서열 (5’→3’) | 서열번호 |
| 프라이머 1 | ctatgaccatgattacgccacagtggagaacacgatcgcg | 3 |
| 프라이머 2 | gaggtcggtgtgtcagacaaacatcgcctttctaatttca | 4 |
| 프라이머 3 | tgaaattagaaaggcgatgtttgtctgacacaccgacctc | 5 |
| 프라이머 4 | gctcggtacccggggatcctcggcgtcgccgttgtggacc | 6 |
이상의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다. Thermocycler (TP600, TAKARA BIO Inc., 일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1 pM, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13032의 염색체 DNA 10 ng을 주형(template)으로 이용하여, PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara, 일본) 1 유닛의 존재 하에서 25 ~ 30 주기(cycle)를 수행하였다. PCR 수행 조건은 (i) 변성(denaturation) 단계: 94℃에서 30초, (ii) 결합(annealing) 단계: 58℃에서 30초, 및 (iii) 확장(extension) 단계: 72℃에서 1 ~ 2분 (1 kb 당 2분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.
이와 같이 제조된 유전자 단편을 self-assembly cloning을 이용하여, pK19mobSacB 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균(E. coli) DH5a에 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.
상기 방법에서 공통적으로 진행된 과정으로서, 해당 유전자들의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 genomic DNA로부터 PCR 방법으로 증폭하여 전략에 따라 self-assembled cloning 방법으로 pK19mobSacB 벡터에 삽입하여 E. coli DH5a에서 선별하였다. 이때 증폭된 유전자를 pK19mobSacB 벡터에 삽입하기 위해 DNA ligation kit (Takara, 일본) 및 제한효소 HindIII, XbaI (NEB, 미국)를 공급된 버퍼 및 프로토콜에 따라 사용하였다.
1-2. 변이주의 제조
상기 pK19ms/NCgl2657(A1T) 벡터를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주인 CT2 균주를 제조하였다.
상기 벡터의 최종 농도가 1 ㎍/㎕ 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법 (문헌 [Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347] 참조)을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때, 전기 천공한 균주를 2YT-Km 고체배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, NaCl 5g/L, 한천 1.5% 및 카나마이신 30 ㎍/㎖ 함유)에 도말하였다. 30℃에서 2일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 1차 상동재조합이 유도된 콜로니 중 상기 표 1의 프라이머 1 및 4를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR로 증폭이 확인된 콜로니를 1차 재조합주로 선별하고 2YT 액체배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L 및 NaCl 5 g/L 함유)에서 12시간 배양 후 2YT-10% sucrose 고체배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, NaCl 5 g/L, 한천 1.5% 및 sucrose 100 g/L 함유)에 도말하여 2차 상동재조합을 유도하여 항생제 마커를 제거하였다. 카나마이신에 저항성이 없으며, 10% sucrose 배지에서 생육이 가능한 균주를 최종적으로 선별한 후 NCgl2657 유전자의 개시코돈에 변이가 도입되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다 (문헌 [Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73] 참조). 최종적으로 변이 NCgl2657 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (CT2)를 획득하였다.
실시예 2. 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조
NCgl2657 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제조하기 위하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 E. coli DH5a를 사용하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, E. coli DH5a 및 항생제는 실시예 1에서 사용된 바와 동일하다.
2-1. 벡터의 제작
프라이머 1 및 2 대신 프라이머 5 및 6을 사용하고, 프라이머 3 및 4 대신 프라이머 7 및 8을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터를 pK19ms/△NCgl2657로 명명하였고, 이를 제작하는데 하기 표 2의 프라이머를 사용하였다.
| 프라이머 | 서열 (5’→3’) | 서열번호 |
| 프라이머 5 | ctatgaccatgattacgccacagtggagaacacgatcgcg | 7 |
| 프라이머 6 | caaaacaagtgccaatgccaacatcgcctttctaatttca | 8 |
| 프라이머 7 | tgaaattagaaaggcgatgttggcattggcacttgttttg | 9 |
| 프라이머 8 | gctcggtacccggggatcctatcgatgctcatgccagcgg | 10 |
2-2. 변이주의 제조
pK19ms/NCgl2657(A1T) 벡터 대신 pK19ms/β 벡터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주인 CT3 균주를 제조하였다. 카나마이신에 저항성이 없으며, 10% sucrose 배지에서 생육이 가능한 균주를 최종적으로 선별한 후 상기 표 2의 프라이머 5 및 8을 사용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 NCgl2657 유전자가 제거되었는지 최종 확인하였고, NCgl2657 유전자가 결손된 균주를 CT3로 명명하였다.
비교예 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주
시트룰린이 과량 생산되도록 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 및 카바모일 인산 합성효소의 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (한국특허출원 제10-2019-0151321호 참조, 이하 'CT1'이라 함)를 사용하였다.
CT1 균주는 모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 비해 L-생산량 및 발효 수율이 증가한 것이 확인되었다.
실험예 1. 변이주의 L-시트룰린 생산성 확인
실시예 1 및 2에서 제조된 NCgl2657 유전자 변이주 (CT2 및 CT3 균주)와 비교예 1의 CT1 균주 간의 L-시트룰린 생산성을 비교하였다.
각 균주를 시트룰린 종배지에 접종하여 30℃에서 10시간 배양 후 배양액 250 mL을 5 L 배양기 배지에 접종하였다. 초기 배지에 포함된 당이 모두 소진되면, 추가 배지를 투입하였다. 본 실험에서 사용된 배지의 조성은 하기 표 3과 같다. 배양 종료 후 배양액을 증류수로 100배 희석하고 0.45 um 필터로 여과한 다음 컬럼 (DionexIonPacTM CS12A)과 자외선 검출기 (195 mm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 균주에서 생산된 배양액 내 L-시트룰린과 부산물인 6-아세틸오르니틴의 농도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 조성 (/L) | |
| 시트룰린 종배지 | 포도당 2.67%, YPA 3.14%, KH2PO4 0.1%, K2HPO4 0.1%, MnSO4 10 ppm, FeSO4 10 ppm, Biotin 100 ug/L, Thiamin-HCl 200 ug/L |
| 5L 배양기 배지 | 포도당 8%, MgSO4 0.08%, FeSO4 16 ppm, MnSO4 8 ppm, CuSO4 1.6 ppm, ZnSO4 1.6 ppm, CaCl2 32 ppm, Biotin 160 ppb, Thiamine-HCl 8 ppm, HVP 0.4%, NaCl 0.08%, KH2PO4 0.22%, (NH4)2SO 4 2.4% |
| 추가 배지 | 포도당 52%, MgSO4 0.1%, CaCl2 120 ppm, Biotin 160 ppb, Thiamine-HCl 16 ppm, NH4H2PO4 0.08%, (NH4)2SO4 4.4% |
| 균주 | L-시트룰린(%) | 6-아세틸오르니틴 (%) |
| CT1 | 9.73 | 1.21 |
| CT2 | 11.46 | 0.38 |
| CT3 | 10.92 | 0.01 |
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, NCgl2657 유전자가 암호화하는 효소의 활성이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 CT2 및 NCgl2657 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 CT3은 기 개발된 변이주 CT1에 비해 부산물인 6-아세틸오르니틴의 생산이 각각 약 69%, 99% 감소하였고, L-시트룰린의 생산성이 각각 약 17.8%, 12.2% 증가한 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해, NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 부산물의 생성이 현저히 감소할 뿐만 아니라 균주의 L-시트룰린 생산능이 향상되어 L-시트룰린을 고순도로 생산할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<120> Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-citrulline
productivity and method for preparing L-citrulline using the same
<130> PN210035
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2657 gene
<400> 1
atgtctgaca caccgacctc agctctgatc accacggtca accgcagctt cgatggattc 60
gatttggaag aagtagcagc agaccttgga gttcggctca cctacctgcc cgacgaagaa 120
ctagaagtat ccaaagttct cgcggcggac ctcctcgctg aggggccagc tctcatcatc 180
ggtgtaggaa acacgttttt cgacgcccag gtcgccgctg ccctcggcgt cccagtgcta 240
ctgctggtag acaagcaagg caagcacgtt gctcttgctc gcacccaggt aaacaatgcc 300
ggcgcagttg ttgcagcagc atttaccgct gaacaagagc caatgccgga taagctgcgc 360
aaggctgtgc gcaaccacag caacctcgaa ccagtcatga gcgccgaact ctttgaaaac 420
tggctgctca agcgcgcacg cgcagagcac tcccacattg tgctgccaga aggtgacgac 480
gaccgcatct tgatggctgc ccaccagctg cttgatcaag acatctgtga catcacgatc 540
ctgggcgatc cagtaaagat caaggagcgc gctaccgaac ttggcctgca ccttaacact 600
gcatacctgg tcaatccgct gacagatcct cgcctggagg aattcgccga acaattcgcg 660
gagctgcgca agtcaaagag cgtcactatc gatgaagccc gcgaaatcat gaaggatatt 720
tcctacttcg gcaccatgat ggtccacaac ggcgacgccg acggaatggt atccggtgca 780
gcaaacacca ccgcacacac cattaagcca agcttccaga tcatcaaaac tgttccagaa 840
gcatccgtcg tttcttccat cttcctcatg gtgctgcgcg ggcgactgtg ggcattcggc 900
gactgtgctg ttaacccgaa cccaactgct gaacagcttg gtgaaatcgc cgttgtgtca 960
gcaaaaactg cagcacaatt tggcattgat cctcgcgtag ccatcttgtc ctactccact 1020
ggcaactccg gcggaggctc agatgtggat cgcgccatcg acgctcttgc agaagcacgc 1080
cgacttaacc cagaactatg cgtcgatgga ccacttcagt tcgacgccgc cgtcgacccg 1140
ggtgtggcgc gcaagaagat gccagactct gacgtcgctg gccaggcaaa tgtgtttatc 1200
ttccctgacc tggaagccgg aaacatcggc tacaaaactg cacaacgcac cggtcacgcc 1260
ctggcagttg gtccgattct gcagggccta aacaaaccag tcaacgacct ttcccgtggc 1320
gcaacagtcc ctgacatcgt caacacagta gccatcacag caattcaggc aggaggacgc 1380
agctaa 1386
<210> 2
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2657 gene - substituted ATG with TTG
<400> 2
ttgtctgaca caccgacctc agctctgatc accacggtca accgcagctt cgatggattc 60
gatttggaag aagtagcagc agaccttgga gttcggctca cctacctgcc cgacgaagaa 120
ctagaagtat ccaaagttct cgcggcggac ctcctcgctg aggggccagc tctcatcatc 180
ggtgtaggaa acacgttttt cgacgcccag gtcgccgctg ccctcggcgt cccagtgcta 240
ctgctggtag acaagcaagg caagcacgtt gctcttgctc gcacccaggt aaacaatgcc 300
ggcgcagttg ttgcagcagc atttaccgct gaacaagagc caatgccgga taagctgcgc 360
aaggctgtgc gcaaccacag caacctcgaa ccagtcatga gcgccgaact ctttgaaaac 420
tggctgctca agcgcgcacg cgcagagcac tcccacattg tgctgccaga aggtgacgac 480
gaccgcatct tgatggctgc ccaccagctg cttgatcaag acatctgtga catcacgatc 540
ctgggcgatc cagtaaagat caaggagcgc gctaccgaac ttggcctgca ccttaacact 600
gcatacctgg tcaatccgct gacagatcct cgcctggagg aattcgccga acaattcgcg 660
gagctgcgca agtcaaagag cgtcactatc gatgaagccc gcgaaatcat gaaggatatt 720
tcctacttcg gcaccatgat ggtccacaac ggcgacgccg acggaatggt atccggtgca 780
gcaaacacca ccgcacacac cattaagcca agcttccaga tcatcaaaac tgttccagaa 840
gcatccgtcg tttcttccat cttcctcatg gtgctgcgcg ggcgactgtg ggcattcggc 900
gactgtgctg ttaacccgaa cccaactgct gaacagcttg gtgaaatcgc cgttgtgtca 960
gcaaaaactg cagcacaatt tggcattgat cctcgcgtag ccatcttgtc ctactccact 1020
ggcaactccg gcggaggctc agatgtggat cgcgccatcg acgctcttgc agaagcacgc 1080
cgacttaacc cagaactatg cgtcgatgga ccacttcagt tcgacgccgc cgtcgacccg 1140
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agctaa 1386
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 5
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ctatgaccat gattacgcca cagtggagaa cacgatcgcg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 6
<400> 8
caaaacaagt gccaatgcca acatcgcctt tctaatttca 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 7
<400> 9
tgaaattaga aaggcgatgt tggcattggc acttgttttg 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
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<220>
<223> Primer 8
<400> 10
gctcggtacc cggggatcct atcgatgctc atgccagcgg 40
Claims (4)
- NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화된, L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 NCgl2657 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 NCgl2657 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성 약화 또는 불활성화는 NCgl2657 유전자의 전부 또는 일부가 삽입, 치환 또는 결실된 것인 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주.
- a) 청구항 1의 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-시트룰린을 회수하는 단계를 포함하는 L-시트룰린의 생산 방법.
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