CN117264924B - Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 - Google Patents
Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264924B CN117264924B CN202311554175.2A CN202311554175A CN117264924B CN 117264924 B CN117264924 B CN 117264924B CN 202311554175 A CN202311554175 A CN 202311554175A CN 117264924 B CN117264924 B CN 117264924B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bbd29
- protein
- corynebacterium glutamicum
- nucleic acid
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 73
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 claims 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 2
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 2
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000424760 Corynebacterium crenatum Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 108010021382 Gluconokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
- C12P13/18—Glutamic acid; Glutamine using biotin or its derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01012—Gluconokinase (2.7.1.12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/265—Micrococcus
- C12R2001/28—Micrococcus glutamicus ; Corynebacterium glutamicum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了BBD29_11900基因突变体及其在制备L‑谷氨酸中的应用。本发明提供了BBD29_11900蛋白突变体，是将BBD29_11900蛋白（SEQ ID No.3）的第104位氨基酸残基由L替换为P后得到的蛋白质。本发明在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_11900基因编码区进行点突变BBD29_11900 T311C（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_11900基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列），可以显著提高L‑谷氨酸产量。本发明对提高L‑谷氨酸产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及BBD29_11900基因突变体及其在制备L-谷氨酸中的应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径由糖开始经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸经氧化脱羧径生成乙酰CoA，或经过羧化支路生产草酰乙酸，再经过三羧酸循环途径生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶的催化生产谷氨酸。
生产谷氨酸的菌株棒杆菌属和短杆菌属细菌都具有如下的生理特性：α-酮戊二酸再氧化能力微弱或缺失、谷氨酸脱氢酶活性高、缺乏再NADPH氧化能力。因此，在谷氨酸生产菌中，TCA循环到α-酮戊二酸氧化阶段几乎变成被切断状态，所以可以认为循环没有起到末端氧化体系的作用。
葡萄糖酸激酶是将ATP末端的磷酸基转移到葡萄糖酸上生成6-磷酸葡糖酸的酶。在葡萄糖代谢中间体的生成上发挥重要的作用。
因糖代谢在α-酮戊二酸处被堵塞，导致代谢向谷氨酸方向进行，这显然具有很大意义，它成为谷氨酸发酵得以建立的重要原因。但这也对丙酮酸等重要的中间产物的产率或产量有直接或间接影响，这些影响仍然影响谷氨酸的生产效率。
目前，对于突变的BBD29_11900基因编码的葡萄糖酸激酶在谷氨酸发酵过程中提高L-谷氨酸产量方面还未见报道。
发明内容
为提高参与谷氨酸棒杆菌合成谷氨酸需要的诸如糖和能量及中间体，本发明将编码葡萄糖酸激酶的基因BBD29_11900进行定点突变，用于调节谷氨酸棒杆菌优化糖酵解途径蛋白，对谷氨酸棒杆菌的细胞完成必要代谢过程和其它细胞功能，从而更高产谷氨酸。
第一方面，本发明要求保护BBD29_11900蛋白突变体。
本发明所要求保护的BBD29_11900蛋白突变体是将BBD29_11900蛋白的第104位氨基酸残基由L替换为P后得到的蛋白质；
所述BBD29_11900蛋白包含（或为）如下任何一：
（A1）如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
即所述BBD29_11900蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面中所述BBD29_11900蛋白突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子可包含（或为）如下任一：
（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（B2）与（B1）限定的DNA序列具有95 %以上同一性且编码所述BBD29_11900蛋白突变体的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95 ％以上同一性具体可为96 ％以上同一性或97 ％以上同一性或98 ％以上同 一性或99 ％以上同一性。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物（如重组菌）。
进一步地，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
进一步地，所述表达盒由启动子、由所述启动子启动表达的所述核酸分子，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述核酸分子连接，且所述核酸分子与所述转录终止序列连接。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子。
进一步地，所述重组微生物（如重组菌）为含有所述表达盒或所述重组载体的重组微生物（如重组菌）。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌（brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌（Pantoea）。进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。更进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
进一步地，所述重组菌为重组细菌，如重组谷氨酸棒杆菌。
更进一步地，所述重组菌为将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后得到的重组菌。
其中，编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子可包含（或为）如下任一：
（C1）SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（C2）与（C1）限定的DNA序列具有95 %以上同一性且编码所述BBD29_11900蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95 ％以上同一性具体可为96 ％以上同一性或97 ％以上同一性或98 ％以上同 一性或99 ％以上同一性。
具体地，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中SEQID No.4的第311位由T突变为C（其他核苷酸序列不变）实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_11900T311C实现的。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第一方面中所述的BBD29_11900蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸（如L-谷氨酸）中的应用；
P2、前文第一方面中所述的BBD29_11900蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量中的应用；
P3、前文第一方面中所述的BBD29_11900蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株中的应用。
第五方面，本发明要求保护一种提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的方法。
本发明要求保护的提高细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的方法，可包括如下步骤：将细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，实现细菌（如谷氨酸棒杆菌）的L-氨基酸（如L-谷氨酸）产量的提高。
第六方面，本发明要求保护一种构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株的方法，可包括如下步骤：将细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，得到所述产L-氨基酸（如L-谷氨酸）工程菌株。
在第五方面和第六方面中，编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子可包含（或为）如下任一：
（C1）SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（C2）与（C1）限定的DNA序列具有95 %以上同一性且编码所述BBD29_11900蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95 ％以上同一性具体可为96 ％以上同一性或97 ％以上同一性或98 ％以上同 一性或99 ％以上同一性。
具体地，将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）的基因组中SEQ ID No.4的第311位由T突变为C（其他核苷酸序列不变）实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_11900T311C实现的。
进一步地，在所述方法中，将所述细菌（如谷氨酸棒杆菌）基因组中的编码所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后还包括对所得重组细菌（如谷氨酸棒杆菌）进行发酵培养的步骤。从发酵培养产物中可以获得L-氨基酸（如L-谷氨酸）。
在进行所述发酵培养的过程中，可以调节培养物的pH（如控制pH为6.8-7.0）。在培养中，培养物的温度可以是30至40 ℃。在进行所述发酵培养的过程中，可以控制流加糖浓度（如控制为50-55 %，即100 mL液体中含糖的质量是50-55 g），控制发酵体系残糖（如控制为0.5-1.0 %，即100 mL液体中含糖的质量是0.5-1.0 g）。
在本发明的具体实施方式中，进行所述发酵培养时采用的培养基的配方见表2，余量为水。进行所述发酵培养时，发酵控制工艺见表3。
在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
相应地，前文第三方面中所要求保护的重组菌具体为重组菌YPG-11900或重组菌G11900。
所述重组菌YPG-11900与所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220的区别仅在于：所述重组菌YPG-11900为将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220基因组中BBD29_11900基因（SEQ IDNo.4）替换为突变后BBD29_11900基因序列（SEQ ID No.2）（具体可通过将SEQ ID No.4的第311位由T突变为C实现），并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌G11900与所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的区别在于：所述重组菌G11900为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869基因组中BBD29_11900基因（SEQ ID No.4）替换为突变后BBD29_11900基因序列（SEQ ID No.2）（具体可通过将SEQ IDNo.4的第311位由T突变为C实现），并保持其他序列不变得到的菌株。
在上述各方面中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
本发明的BBD29_11900蛋白突变体可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的谷氨酸，所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明BBD29_11900蛋白突变体的编码基因置于目的产物合成途径中，并对合成途径中的基因进行表达，即可实现目的产物的生产。
实验证明：本发明在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_11900基因编码区进行点突变BBD29_11900T311C（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_11900基因编码区野生型序列替换为SEQID No.2所示的突变序列），可以显著提高L-谷氨酸产量（P<0.01）。本发明对提高L-谷氨酸产量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。下文简称谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。保藏人宁夏伊品生物科技股份有限公司已经授权内蒙古伊品生物科技有限公司使用该菌株。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869为ATCC中编号为13869的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。下文简称谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
实施例1、构建包含点突变的BBD29_11900基因编码区片段的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869基因组序列，设计并合成两对扩增BBD29_11900基因编码区及其上下游序列的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_11900基因）及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_11900基因编码区中引入点突变，所述点突变为将BBD29_11900基因编码区的野生型核苷酸序列（SEQ ID No.4）的第311位胸腺嘧啶T突变为胞嘧啶C，其他序列不变，得到SEQID No.2所示的BBD29_11900基因突变序列。SEQ ID No.4编码SEQ ID No.3所示的BBD29_11900野生蛋白；上述点突变导致BBD29_11900野生蛋白的第104位的亮氨酸（L）突变为脯氨酸（P），即得到SEQ ID No.1所示BBD29_11900突变蛋白。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示的BBD29_11900突变蛋白。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下（上海invitrogen公司合成），加粗字体的碱基为突变位置：
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGACCTGTGGTTGGAACTCTC-3'，
P2：5'-GATCGTAGTCGCCGTGGGGGTGGACGAAGACGGTTCCTGG-3'，
P3：5'-CCAGGAACCGTCTTCGTCCACCCCCACGGCGACTACGATC-3'，
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGACAGGGTGGAGGATTGG-3'。
注：P1和P4上下划线部分是pK18mobsacB载体上自带的序列。
具体操作如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物对P1/P2和引物对P3/P4进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为823 bp和819bp的BBD29_11900基因编码区及其上/下游的DNA片段，分别命名为BBD29_11900Up（引物对P1/P2的扩增产物）和BBD29_11900 Down（引物对P3/P4的扩增产物）。
PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg2+（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL；
PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s）30个循环；72 ℃过度延伸10 min。
将上述两条DNA片段（BBD29_11900Up和BBD29_11900 Down）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切（Xba I/BamHI）后纯化的pK18mobsacB质粒（BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆经M13引物（M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’）PCR鉴定获得阳性重组载体，命名为pK18-BBD29_11900T311C。
将酶切正确的重组质粒pK18-BBD29_11900T311C送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变（G-A）的重组载体pK18-BBD29_11900T311C 保存备用。
重组载体pK18-BBD29_11900T311C的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点Xba I/BamHI之间的小片段替换为SEQ ID No.5的第37-1564位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
重组载体pK18-BBD29_11900T311C中含有完整的SEQ ID No.5。SEQ ID No.5的第1-36位和第1565-1602位为pK18mobsacB质粒上自身序列；第37-495位为谷氨酸棒杆菌基因组上BBD29_11900基因编码区上游序列；第496-999位为BBD29_11900基因编码区序列，第1000-1564位为BBD29_11900基因编码区下游序列。其中，SEQ ID No.5的第806位为突变位点，该突变位点使得谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中BBD29_11900基因编码区的第311位的胸腺嘧啶（T）突变为胞嘧啶（C）（对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第311位）。
实施例2、构建包含基因BBD29_11900 T311C的工程菌株
构建方法：将实施例1构建得到的等位替换质粒（pK18-BBD29_11900T311C）通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R（5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’）进行鉴定，能扩增出1609bp（序列如SEQ ID No.6所示）大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，各选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的十六株菌株（即与基因组发生同源重组阳性的菌株）进一步采用P1和P4引物（序列参见实施例1）扩增后，将PCR产物进行测序，通过序列比对，均获得BBD29_11900基因编码区的第311位碱基序列发生突变（T-C）（对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第311位）的菌株，即为等位替换成功的阳性菌株，分别命名为YPG-11900、G11900。
重组菌YPG-11900和G11900含有SEQ ID No.5的第37-1564位所示的包括BBD29_11900T311C突变基因的片段。
重组菌YPG-11900与谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCCNo.21220的区别仅在于：YPG-11900为将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220的BBD29_11900基因编码区的野生型序列（SEQ ID No.4）替换为突变序列（即SEQ ID No.2），并保持其他序列不变得到的菌株。
重组菌G11900与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869的区别在于：G11900为将ATCC13869的BBD29_11900基因编码区的野生型序列（SEQ ID No.4）替换为突变序列（即SEQID No.2），并保持其他序列不变得到的菌株。
实施例3、L-谷氨酸发酵实验
将上述实施例2构建的重组菌株YPG-11900、G11900，以及对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）中以表2所示的培养基和表3所示的控制工艺进行发酵实验。发酵结束采用SBA生物传感仪器（SBA-40E）检测L-谷氨酸产量与OD(562nm)。每个菌株重复三次，结果如表4和表5所示。
如表4和表5所示，在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_11900基因编码区进行点突变BBD29_11900T311C（即将SEQ ID No.4所示的BBD29_11900基因编码区野生型序列替换为SEQID No.2所示的突变序列），可以显著提高L-谷氨酸产量（p<0.01）。
上述实施例L-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析，实验结果P<0.05(*)表示具有显著性差异，P<0.01(**)表示具有极显著性差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1. BBD29_11900蛋白突变体，其特征在于：所述BBD29_11900蛋白突变体是将BBD29_11900蛋白的第104位氨基酸残基由L替换为P后得到的蛋白质；
所述BBD29_11900蛋白为如下任一：
（A1）如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.编码权利要求1所述BBD29_11900蛋白突变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（B2）与（B1）限定的DNA序列具有95%以上同一性且编码所述BBD29_11900蛋白突变体的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌；
所述重组菌为谷氨酸棒杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子后得到的重组菌。
6.权利要求1所述的BBD29_11900蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌在生产L-谷氨酸中的应用。
7.权利要求1所述的BBD29_11900蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体在提高谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量中的应用。
8.权利要求1所述的BBD29_11900蛋白突变体或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体在构建产L-谷氨酸工程菌株中的应用；
所述L-谷氨酸工程菌株为谷氨酸棒杆菌。
9.一种提高谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量的方法，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子，实现谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸产量的提高。
10.一种构建产L-谷氨酸工程菌株的方法，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_11900蛋白的核酸分子替换为权利要求2或3所述核酸分子，得到所述产L-谷氨酸工程菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311554175.2A CN117264924B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311554175.2A CN117264924B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117264924A CN117264924A (zh) | 2023-12-22 |
| CN117264924B true CN117264924B (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89216393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311554175.2A Active CN117264924B (zh) | 2023-11-21 | 2023-11-21 | Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117264924B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110869504A (zh) * | 2017-06-07 | 2020-03-06 | 齐默尔根公司 | 来自谷氨酸棒状杆菌的启动子及其在调节辅助基因表达中的用途 |
| CN111655859A (zh) * | 2017-07-19 | 2020-09-11 | Cj第一制糖株式会社 | 生产腐胺的微生物及利用其生产腐胺的方法 |
-
2023
- 2023-11-21 CN CN202311554175.2A patent/CN117264924B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110869504A (zh) * | 2017-06-07 | 2020-03-06 | 齐默尔根公司 | 来自谷氨酸棒状杆菌的启动子及其在调节辅助基因表达中的用途 |
| CN111655859A (zh) * | 2017-07-19 | 2020-09-11 | Cj第一制糖株式会社 | 生产腐胺的微生物及利用其生产腐胺的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117264924A (zh) | 2023-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2021019596A (ja) | 新規なイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたｌ−ロイシンの生産方法 | |
| CN114835783B (zh) | NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 | |
| US20240294866A1 (en) | Recombinant strain with modified gene bbd29_04920 for producing l-glutamic acid, and method for constructing the same and use thereof | |
| JP2024505808A (ja) | 増強されたｌ－グルタミン酸生産能を有する菌株及びその構築方法と応用 | |
| CN111471693B (zh) | 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN115820706A (zh) | 半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶突变体及其在制备l-赖氨酸中的应用 | |
| CN117264924B (zh) | Bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| CN116063417A (zh) | Bbd29_14255基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| EP4230723A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| US20240076701A1 (en) | Recombinant strain with modified gene bbd29_14900, and method for constructing the same and use thereof | |
| CN117264034B (zh) | Bbd29_09715基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN112522175B (zh) | 一种改造基因bbd29_09525产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| US20240067999A1 (en) | Recombinant strain with modified gene bbd29_11265 for producing l-glutamic acid, and method for constructing the same and use thereof | |
| CN117551181A (zh) | Bbd29_04985基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN117551708A (zh) | 一种制备l-谷氨酸的方法及其相关bbd29_13530基因突变体 | |
| CN117568299A (zh) | Bbd29_06325基因突变体及其应用 | |
| CN114539367B (zh) | Cey17_rs11900基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 | |
| CN114249803B (zh) | 一种高产精氨酸的工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN117535293A (zh) | Bbd29_03870基因启动子突变体及其应用 | |
| CN116463304B (zh) | 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 | |
| CN117535335A (zh) | Bbd29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产l-谷氨酸中的应用 | |
| CN117625605A (zh) | Bbd29_04605基因启动子突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用 | |
| CN116144564A (zh) | 一种谷氨酸生产菌株的构建方法及其在生产谷氨酸中的用途 | |
| KR20230042224A (ko) | L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |