CN115975957A

CN115975957A - 大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI及其突变体在L-氨基酸生产中的应用

Info

Publication number: CN115975957A
Application number: CN202211212414.1A
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 贾慧萍; 赵春光; 魏爱英; 苏厚波; 杨飞
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2022-09-29
Filing date: 2022-09-29
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明公开了大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI及其突变体在L‑氨基酸生产中的应用。本发明公开的基因fliI的序列为SEQ ID No.1，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质，fliI突变体的序列为SEQ ID No.4，编码SEQ ID No.5所示的蛋白质。实验证明，本发明的基因fliI及其突变体与相关生物材料可提高L‑氨基酸，尤其是L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑精氨酸和L‑缬氨酸的产量，可用于生产L‑氨基酸，具有很好的应用前景。

Description

大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI及其突变体在L-氨基酸生产中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI及其突变体在L-氨基酸生产中的应用。

背景技术

生命结构与生命活动的基本单位是细胞，细胞中和呼吸密切相关的膜蛋白复合物ATP合成酶，是生物体能量转化的核心酶，是一种典型的旋转分子马达，它们不断地旋转来合成ATP，维持细胞新陈代谢需要的大量能量。

另一种典型的旋转分子马达是细菌鞭毛，细菌鞭毛是一个精巧复杂的机器、是从细菌内部长出的又细又长的丝状物，是自然界分子进化的杰作。

因此研究细菌鞭毛和ATP合成酶对细胞的生物进化和产能具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以用于制备L-氨基酸的蛋白质。

本发明提供的蛋白质名称为fliI，fliI为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)SEQ ID No.2所示的蛋白质，或将SEQ ID No.2的第171位苏氨酸残基突变为异亮氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基、甲硫氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基或缬氨酸残基得到的突变蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质除第171位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

A1)中的突变蛋白质可为SEQ ID No.5所示的蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID No.5或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的蛋白质，为与A1)蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.4或SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.4和SEQID No.1所示的DNA分子分别编码SEQ ID No.5和SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明还提供了与fliI相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码fliI的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码fliI的DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码fliI的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码fliI蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的fliI蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码fliI蛋白质且具有fliI蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.5或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码fliI蛋白质的核酸分子的表达盒(fliI基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达fliI蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动fliI基因转录的启动子，还可包括终止fliI基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，B2)所述表达盒可为SEQ ID No.3的第37-1624位所示的DNA分子，或将SEQ ID No.3的第37-1624位中第762位由C突变为T得到的DNA分子。

可用现有的表达载体构建含有所述fliI基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a(+)载体。

B3)所述重组载体可为重组载体pET28(a)-fliI或pET28(a)-T171I；

pET28(a)-fliI为在pET-28a(+)载体的多克隆位点间插入序列3的第37-1624位所示的fliI基因表达盒得到的重组载体。

pET28(a)-T171I为将pET28(a)-fliI中SEQ ID No.1所示的DNA片段替换为SEQ IDNo.4所示的DNA片段得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。其中，细菌可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、乳酸发酵短杆菌、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌、泛菌(Pantoea)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、短杆菌(Bacillusbrevis)、乳酸短杆菌或黄色短杆菌。所述酵母可为酿酒酵母或毕赤酵母。

在本发明的一个实施例中，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP0158(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.25404)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP006D(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.25403)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP004-8(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.25402)或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP045(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22721)。

B4)所述重组微生物为将含有SEQ ID No.1所示的fliI基因的微生物中的fliI基因替换为SEQ ID No.4所示DNA分子得到的重组微生物，或向微生物中导入SEQ ID No.4或SEQ ID No.1所示DNA分子并使其得到表达得到的重组微生物。

在本发明的实施例中，所述重组微生物为W3110-pET28(a)-T171I、YPThr11、YPTrp001、YPR-061、YPV-099、YPThr12、YPTrp002、YPR-062、YPV-100、YPThr13、YPTrp003、YPR-063、YPV-101、YPThr15、YPThr16、YPTrp005、YPTrp006、YPR-065、YPR-066、YPV-103或YPV-104；

W3110-pET28(a)-T171I为将pET28(a)-T171I导入大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)W3110中得到的重组菌；

YPThr11为将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404(大肠埃希氏菌YP0158)的SEQ ID No.1所示的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的DNA片段得到的重组菌；

YPTrp001为将L-色氨酸生产菌CGMCC25403(大肠埃希氏菌YP006D)的SEQ ID No.1所示的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的DNA片段得到的重组菌；

YPR-061为将L-精氨酸生产菌CGMCC25402(大肠埃希氏菌YP004-8)的SEQ ID No.1所示的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的DNA片段得到的重组菌；

YPV-099为将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721(大肠埃希氏菌YP045)的SEQ ID No.1所示的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的DNA片段得到的重组菌；

YPThr12、YPTrp002、YPR-062和YPV-100分别是将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为fliI基因及其启动子(SEQ ID No.3)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌；

YPThr13、YPTrp003、YPR-063和YPV-101是将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为突变型fliI^T171I基因及其启动子(其序列为将SEQ ID No.3的762位的C替换为T得到的序列)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌；

YPThr15、YPTrp005、YPR-065和YPV-103分别为向L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721中导入pET28(a)-fliI得到的重组菌；

YPThr16、YPTrp006、YPR-066和YPV-104分别为向L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721中导入pET28(a)-fliI^T171I得到的重组菌。

本发明还提供了一种制备L-氨基酸的方法，所述方法包括：使受体生物细胞中表达fliI，或提高受体生物细胞中fliI的含量或活性，或提高受体生物细胞中fliI的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-氨基酸。

上述方法中，所述生物细胞可为能合成L-氨基酸和/或含有fliI编码基因的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。

所述生物细胞为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。

进一步，所述细菌可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌、泛菌(Pantoea)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、短杆菌(Bacillus brevis)、乳酸短杆菌或黄色短杆菌。所述酵母可为酿酒酵母或毕赤酵母。

上述方法中，所述方法可通过向所述受体生物细胞中导入fliI的编码基因并使其得到表达实现，或增加所述受体生物细胞中fliI的编码基因的拷贝数实现；

或，所述受体生物细胞中含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，所述方法通过将所述受体生物细胞中SEQ ID No.1所示的DNA分子替换为SEQ ID No.4所示的DNA分子实现。

上述方法中，培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的培养基进行；

和/或，培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的条件进行。

所述培养基可为丰富培养基，所述丰富培养基的溶剂是水，溶质及其在所述丰富培养基中的浓度为：葡萄糖30g/L，(NH4)₂SO₄2g/L，H₃PO₄ 0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，甜菜碱0.5g/L，柠檬酸2g/L，VH(维生素H)20mg/L，VB₁ 1.5mg/L，VB₃ 1.5mg/L VB₁₂1.5g/L，氢氧化钠调节pH至7.0。

所述L-氨基酸为L-苏氨酸，所述培养基为L-苏氨酸发酵培养基，所述L-苏氨酸发酵培养基的溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/L，(NH4)₂SO₄ 1g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，通氨调节pH7.0。

所述L-氨基酸为L-苏氨酸，所述培养基为L-色氨酸发酵培养基，所述L-色氨酸发酵培养基的溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖7g/L,FM902酵母粉1g/L,(NH4)₂SO₄ 1.2g/L,柠檬酸1.2g/L,MgSO₄·7H₂O 1.5g/L,K₂HPO₄·3H₂O 5.5g/L,消泡剂0.2mL/L,通氨调pH7.0.

所述L-氨基酸为L-苏氨酸，所述培养基为L-精氨酸氨酸发酵培养基，所述L-精氨酸氨酸发酵培养基的溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖8g/L,FM902酵母粉3g/L,K₂HPO₄·3H₂O 6g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，甜菜碱0.5g/L，VB₁₂ 0.005g/L，消泡剂0.3mL/L，硫酸铵3g/L，pH7.2.

所述L-氨基酸为L-苏氨酸，所述培养基为L-缬氨酸氨酸发酵培养基，所述L-缬氨酸氨酸发酵培养基的溶剂是水，溶质及其浓度为酵母浸粉4g/L，玉米浆干粉2g/L，蛋白胨4g/L，蛋氨酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CoCl₂ 20mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，柠檬酸2g/L，FeSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·7H₂O 30mg/L，VH 20mg/L，VB₁ 1.5mg/L，VB₃1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，消泡剂0.3mL/L，(NH4)₂SO₄ 3g/L，pH值7.0。

本发明还提供了一种用于制备L-氨基酸的产品，所述产品含有(或其活性成分为)含有fliI或所述生物材料。

本发明中，所述L-氨基酸可为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸或L-缬氨酸。

本发明中，大肠埃希氏菌鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI的过表达及点突变能提高大肠埃希氏菌L-氨基酸的产量。

本发明的fliI或所述生物材料可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸或L-缬氨酸，所生产的产物还可为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。

将fliI基因启动子进行突变，所得突变启动子在制备L-氨基酸中的应用，也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明的fliI及其相关生物材料可提高L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的产量，可用于生产L-氨基酸，具有很好的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

生物材料保藏说明。

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

菌株编号：YP0158。

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。

保藏日期：2022年07月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25404。

生物材料保藏说明。

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

菌株编号：YP006D。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏日期：2022年07月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25403。

生物材料保藏说明。

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

菌株编号：YP004-8。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏日期：2022年07月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25402。

生物材料保藏说明。

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

菌株编号：YP045。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏日期：2021年06月15日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22721。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中，L-苏氨酸生产菌CGMCC25404为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP0158，该菌株已于2022年07月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25404。

下述实施例中，L-色氨酸生产菌CGMCC25403为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP006D，该菌株已于2022年07月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25403。

下述实施例中，L-精氨酸生产菌CGMCC25402为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP004-8，该菌株已于2022年07月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25402。

下述实施例中，L-缬氨酸生产菌CGMCC22721为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)YP045，该菌株已于2021年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22721。

实施例1、构建包含鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变型W3110菌株

一、具有鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变型质粒的构建

为了研究方便，首先将野生型fliI基因(序列如SEQ ID No.1，编码SEQ ID No.2所示的fliI蛋白质)及其启动子克隆到表达载体pET-28a(+)中。以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列为模板，分别以引物pET28-PF/fliI-PF、fliI-PR/pET28-PR进行PCR扩增，获得野生型fliI基因及其启动片段。将所得两种PCR产物回收后与pET-28a(+)(TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)经EcoR I/Hind III酶切回收的表达载体骨架用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养，获得含fliI基因及其启动子的序列正确的pET-28a(+)转化子pET28(a)-fliI(fliI基因及其启动子的序列如SEQ ID No.3)。对培养长出的单克隆用引物T7t/T7和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1874bp片段的为含fliI及其启动子的pET-28a(+)阳性转化子pET28(a)-fliI。

SEQ ID No.3中，第37-250位为fliI基因启动子的序列，第251-1624位为fliI基因的序列。

为了获得编码鞭毛特异性ATP合成酶基因fliI的突变体，使用随机诱变试剂盒(Agilent Technologies,USA)制备了fliI突变型基因质粒。以质粒pET28(a)-fliI为模板，分别以引物pET28-PF/pET28-PR进行PCR扩增，获得了包含随机点突变的fliI基因片段1660bp含fliI及其启动子的pET-28a(+)阳性转化子pET28(a)-fliI(序列如SEQ ID No.3，但fliI编码区存在随机点突变)。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL.

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

回收的DNA片段与pET-28a(+)(TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)经EcoR I/HindIII酶切回收的表达载体骨架用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7t/T7和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1874bp(fliI编码区存在随机点突变)片段的为含fliI随机突变的pET-28a(+)阳性转化子。

PCR扩增体系：2×PremixrTaq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O至总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

pET28-PF:5'-CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCTCTCGTCTCCCGGATAATTT-3'(带下划线的核苷酸序列为pET-28a(+)同源臂序列)，

fliI-PF:5'-CGAGTCAGGC GCGTGGTCATCGCGCACCTC GTGGCTGATT-3'，

fliI-PR:5'-AATCAGCCAC GAGGTGCGCGATGACCACGC GCCTGACTCG-3'，

pET28-PR:5'-TAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATC TTATGACACTGTCGGGAAAA-3'(带下划线的核苷酸序列为pET-28a(+)同源臂序列)，

T7t：5’-GCTAGTTATT GCTCAGCGG-3’，

T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’。

二、具有鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变型菌株的构建

为了鉴定步骤一中构建的突变载体的L-氨基酸生产性能，具体地，将步骤一中构建的fliI随机突变质粒导入到大肠埃希氏菌W3110菌株中(鉴定同步骤一)，将阳性转化子在卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30mL丰富培养基的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导鞭毛特异性ATP合成酶过表达，发酵结束得到发酵液。以大肠埃希氏菌W3110作为对照。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析发酵液中L-氨基酸的浓度，如表1所示。挑选具有比W3110对照的各L-氨基酸生产能力优越的菌株，即为W3110-fliI突变株。

丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为：葡萄糖30g/L，(NH4)₂SO₄2g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·H₂00.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，甜菜碱0.5g/L，柠檬酸2g/L，VH(维生素H)20mg/L，VB₁ 1.5mg/L，VB₃ 1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，氢氧化钠调节pH至7.0。

表1 W3110-fliI突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

如表1中所示，所得大肠埃希氏菌W3110-fliI突变株具有产部分L-氨基酸的能力，其中W3110-fliI突变株2产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力更优越。表明fliI突变株2有合成L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的活性。

通过从W3110-fliI突变株2提取质粒对fliI基因进行测序的结果，确认了fliI突变体核苷酸序列的第512位胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，其突变型蛋白质fliI氨基酸序列中的第171位苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)，此质粒即为pET28(a)-T171I(含有序列如SEQ ID No.3的第762位突变为为T的DNA片段)，将W3110-fliI突变株2记为W3110-pET28(a)-T171I。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA序列为野生型fliI基因，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.2(蛋白质名称记为野生型fliI蛋白质)；SEQ ID No.4所示的DNA序列为突变型fliI^T171I基因，突变型fliI^T171I基因序列(SEQ ID No.4)中第512位胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)突变而来，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.5(突变蛋白质名称为突变型fliI^T171I蛋白质)，突变型蛋白质fliI^T171I氨基酸序列(SEQ ID No.5)中的第171位异亮氨酸(I)由苏氨酸(T)突变而来。

三、具有鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变体质粒的构建

以随机突变的方式利用野生型大肠埃希氏菌W3110获得了W3110-fliI突变株2。为了获得更多fliI突变株以提高其L-氨基酸的生产能力，构建以上述fliI突变位置的氨基酸用不同氨基酸取代的突变体。具体地，以步骤二中测序的质粒(即pET28(a)-T171I)为模板，构建了其中在fliI第171位氨基酸用不同氨基酸取代的5种突变体。突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如表2。

表2、fliI突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

N-PR:5'-CCAACGtTAA GCAGGGCATT GATTGGGCGC ACGC-3'，

N-PF:5'-GCGTGCGCCC AATCAATGCC CTGCTTAaCG TTGG-3'，

S-PR:5'-CCAACGcTAA GCAGGGCATT GATTGGGCGC ACGC-3'，

S-PF:5'-GCGTGCGCCC AATCAATGCC CTGCTTAgCG TTGG-3'，

A-PR:5'-CCAACGgcAA GCAGGGCATT GATTGGGCGC ACGC-3'，

A-PF:5'-GCGTGCGCCC AATCAATGCC CTGCTTgcCG TTGG-3'，

M-PR:5'-CCAACcaTAA GCAGGGCATT GATTGGGCGC ACGC-3'，

M-PF:5'-GCGTGCGCCC AATCAATGCC CTGCTTAtgG TTGG-3'，

P-PR:5'-CCAACGggAA GCAGGGCATT GATTGGGCGC ACGC-3'，

P-PF:5'-GCGTGCGCCC AATCAATGCC CTGCTTccCG TTGG-3'。

以步骤二中测序的质粒pET28(a)-T171I为模板，分别以表2中的引物和KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有fliI突变核苷酸的Up DNA片段768bp和Down DNA片段926bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收Up和Down DNA片段。回收后的DNA片段与pET-28a(+)经EcoR I/Hind III酶切回收的表达载体骨架用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7t/T7PCR鉴定，用rTaqPCR扩增出含有大小1874bp片段的为fliI突变pET-28a(+)的阳性转化子，其中在第171位的苏氨酸用表2中的各氨基酸取代的5种fliI突变载体如表2中所列的名称进行命名。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPAHiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

其中，pET28(a)-T171N与pET28(a)-fliI的区别在于，pET28(a)-T171N为将pET28(a)-fliI中的野生型fliI基因替换为突变型fliI^T171N基因序列得到的重组载体，pET28(a)-T171N能表达fliI^T171N突变蛋白质；野生型fliI基因与突变型fliI^T171N基因的区别仅在于，野生型fliI基因的第511-513位为ACC，突变型fliI^T171N基因的第511-513位为AAC；野生型fliI蛋白质与fliI^T171N突变蛋白质的区别仅在于，野生型fliI蛋白质的第171位为苏氨酸残基T，fliI^T171N突变蛋白质的第171位为天冬酰胺残基N；

pET28(a)-T171S与pET28(a)-fliI的区别在于，pET28(a)-T171S为将pET28(a)-fliI中的野生型fliI基因替换为突变型fliI^T171S基因序列得到的重组载体，pET28(a)-T171S能表达fliI^T171S突变蛋白质；野生型fliI基因与突变型fliI^T171S基因的区别仅在于，野生型fliI基因的第511-513位为ACC，突变型fliI^T171S基因的第511-513位为AGC；野生型fliI蛋白质与fliI^T171S突变蛋白质的区别仅在于，野生型fliI蛋白质的第171位为苏氨酸残基T，fliI^T171S突变蛋白质的第171位为丝氨酸残基S；

pET28(a)-T171A与pET28(a)-fliI的区别在于，pET28(a)-T171A为将pET28(a)-fliI中的野生型fliI基因替换为突变型fliI^T171A基因序列得到的重组载体，pET28(a)-T171A能表达fliI^T171A突变蛋白质；野生型fliI基因与突变型fliI^T171A基因的区别仅在于，野生型fliI基因的第511-513位为ACC，突变型fliI^T171A基因的第511-513位为GCC；野生型fliI蛋白质与fliI^T171A突变蛋白质的区别仅在于，野生型fliI蛋白质的第171位为苏氨酸残基T，fliI^T171A突变蛋白质的第171位为丙氨酸残基A；

pET28(a)-T171M与pET28(a)-fliI的区别在于，pET28(a)-T171M为将pET28(a)-fliI中的野生型fliI基因替换为突变型fliI^T171M基因序列得到的重组载体，pET28(a)-T171M能表达fliI^T171M突变蛋白质；野生型fliI基因与突变型fliI^T171M基因的区别仅在于，野生型fliI基因的第511-513位为ACC，突变型fliI^T171M基因的第511-513位为ATG；野生型fliI蛋白质与fliI^T171M突变蛋白质的区别仅在于，野生型fliI蛋白质的第171位为苏氨酸残基T，fliI^T171M突变蛋白质的第171位为甲硫氨酸残基M；

pET28(a)-T171P与pET28(a)-fliI的区别在于，pET28(a)-T171P为将pET28(a)-fliI中的野生型fliI基因替换为突变型fliI^T171P基因序列得到的重组载体，pET28(a)-T171P能表达fliI^T171P突变蛋白质；野生型fliI基因与突变型fliI^T171P基因的区别仅在于，野生型fliI基因的第511-513位为ACC，突变型fliI^T171P基因的第511-513位为CCC；野生型fliI蛋白质与fliI^T171P突变蛋白质的区别仅在于，野生型fliI蛋白质的第171位为苏氨酸残基T，fliI^T171P突变蛋白质的第171位为脯氨酸残基P。

四、具有鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变体菌株的构建

为了鉴定步骤三中构建的突变载体对L-氨基酸的生产性能，具体地，将步骤三中构建的质粒导入到大肠埃希氏菌W3110菌株中(鉴定同步骤一)，将阳性转化子分别在卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30mL丰富培养基的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导鞭毛特异性ATP合成酶过表达。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析发酵液中L-氨基酸的浓度，如表3所示。突变株W3110-pET28(a)-T171I产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-T171N、W3110-pET28(a)-T171S、W3110-pET28(a)-T171A、W3110-pET28(a)-T171M和W3110-pET28(a)-T171P更优越。

表3 W3110-fliI突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

实施例2、构建包含鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI突变型工程菌株

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑方法对L-氨基酸高产菌株fliI基因进行点突变，以此在高产菌株中更深入研究fliI基因及突变型fliI^T171I基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

在fliI基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，该点突变为将fliI基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第512位胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)得到SEQ ID No.4所示的DNA分子(突变型fliI基因，名称为突变型fliI^T171I基因)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2(野生型fliI蛋白质)。SEQ ID No.4所示的DNA分子编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.5(突变蛋白质名称为突变型fliI^T171I蛋白质)，突变型蛋白质fliI^T171I氨基酸序列(SEQ IDNo.5)中的第171位异亮氨酸(I)由苏氨酸(T)突变而来。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPR RGEN Tools(http：//www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5’和3’最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-1F 10μL，sgRNA-1R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段(即sgRNA)，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒(Addgene)并用SpeI酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性pGRB质粒2μL，sgRNA0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-1。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-1F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTtcgttggctt taacggtcaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'，

sgRNA-1R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACttgaccgtta aagccaacgaA CTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'，

sgRNA-PF:5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

sgRNA-PR:5’-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、基因突变型fliI^T171I DNA的扩增

以W3110基因组DNA为模板，分别以引物P1/P2，P3/P4和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有突变核苷酸大小分别为607bp和697bp的fliI^T171IDNA片段(fliI^T171IUp和fliI^T171IDown)。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收fliI^T171IUp和fliI^T171IDown。回收后的DNA以引物P1/P4 overlap PCR获得点突变整合同源臂DNA片段Up-fliI^T171I-Down(SEQ ID No.6)1270bp。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，小写加粗字体的核苷酸为突变位置：

P1:5'-AAAGTCTCCG CCGATGAAGG-3'，

P4:5'-AGCTGTTTGA AGGTGCGCAC-3'。

三、感受态的制备及转化

提取pREDCas9质粒(含有壮观霉素抗性基因)(Addgene)，分别转化到L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素(100mg/L)的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR用r Taq PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9转化子。

制备L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并转化pGRB-sgRNA-1质粒和点突变重组DNA片段Up-fliI^T171I-Down，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。用引物P5/P6和r Taq对转化子进行PCR鉴定，将得到的265bp PCR产物通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以Up-fliI^T171I-Down扩增PCR片段为阳性对照，W3110扩增PCR片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此PCR片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P5:5'-GTTATTAGGT CGCGTTCTGG-3'，

P6:5'-GACATCGGCG CGGGTGTAAC-3'，

pRedCas9-PF:5'-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3'，

pRedCas9-PR:5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'。

SSCP电泳PAGE的制备及电泳条件：40％丙烯酰胺8mL、甘油4mL、10×TBE 2mL、TEMED 40μL、10％APS 600μL、ddH₂O 26mL；将电泳槽置入冰中，电压120V在1×TBE缓冲液中电泳10h。

将点突变成功的转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-1，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P5/P6 PCR扩增点突变序列测序鉴定，测序结果与W3110基因组序列进行比对，确定fliI基因第512位核苷酸C突变为核苷酸T的为基因突变型fliI^T171I阳性转化子。将基因突变型fliI^T171I的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr11、YPTrp001、YPR-061和YPV-099。

YPThr11与L-苏氨酸生产菌CGMCC25404的区别仅在于fliI基因第512位核苷酸的不同，该位点在L-苏氨酸生产菌CGMCC25404中为C，在YPThr11中为T；

YPTrp001与L-色氨酸生产菌CGMCC25403的区别仅在于fliI基因第512位核苷酸的不同，该位点在L-色氨酸生产菌CGMCC25403中为C，在YPTrp001中为T；

YPR-061与L-精氨酸生产菌CGMCC25402的区别仅在于fliI基因第512位核苷酸的不同，该位点在L-精氨酸生产菌CGMCC25402中为C，在YPR-061中为T；

YPV-099与L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的区别仅在于fliI基因第512位核苷酸的不同，该位点在L-缬氨酸生产菌CGMCC22721中为C，在YPV-099中为T。

实施例3、构建包含基因组上过表达的鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI和fliI^T171I的工程菌株

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721 yaiT基因编码区内(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的yaiT和fliI基因)分别整合野生型fliI基因和突变型fliI^T171I基因，以此在高产菌株中更深入研究fliI基因及突变型fliI^T171I基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸合成量的影响。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-2F 10μL，sgRNA-2R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒并用SpeI酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，pGRB质粒DNA1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化克隆载体2μL，sgRNA 0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-2。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，小写突出字体的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-2F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTggcaactatgtaaactatagGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'，

sgRNA-2R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctatagtttacatagttgccAC TAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'，

sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、PCR扩增基因组过表达的DNA序列

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及fliI或fliI^T171I基因编码区及启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式在L-氨基酸生产菌yaiT编码区内分别引入fliI基因或fliI^T171I基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'-AAGAGAATGG AAGAGAGGCC-3'，

P8:5'-AAATTATCCG GGAGACGAGACCCAATCAAG TGCTGTAACG-3'，

P9:5'-CGTTACAGCA CTTGATTGGGTCTCGTCTCC CGGATAATTT-3'，

P10:5'-CGAGTCAGGC GCGTGGTCATCGCGCACCTC GTGGCTGATT-3'，

P11:5'-AATCAGCCAC GAGGTGCGCGATGACCACGC GCCTGACTCG-3'，

P12:5'-CGGTAGTGTA GGTTTCGTTGTTATGACACT GTCGGGAAAA-3'，

P13:5'-TTTTCCCGAC AGTGTCATAACAACGAAACC TACACTACCG-3'，

P14:5'-CGACCTGTAG TATCCCATTC-3'。

以W3110基因组DNA为模板，以引物P7/P8和P13/P14及KAPA HiFi HotStartPCR扩增，获得上同源臂590bp(SEQ ID No.7的第1-590位)和下同源臂片段605bp(SEQ ID No.7的第2139-2743位)；以W3110基因组DNA为模板，以引物P9/P10和KAPA HiFi HotStartPCR扩增fliI启动子片段254bp(SEQ ID No.7的第551-804位)；分别以W3110基因组DNA和质粒pET28(a)-fliI^T171I为模板，以引物P11/P12和KAPA HiFi HotStart分别PCR扩增fliI(SEQ IDNo.7的第765-2178位)和fliI^T171I基因(SEQ ID No.8的第765-2178位)1414bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P7和P14 overlap PCR分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-fliI-Down(SEQ ID No.7)和Up-fliI^T171I-Down(SEQ ID No.8)2743bp。

三、感受态的制备及转化

制备L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-sgRNA-2质粒和基因组过表达DNA片段Up-fliI-Down或Up-fliI^T171I-Down，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P15/P16用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1482bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.9所示，含点突变序列第1408位为T，其余如SEQ ID No.9)的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，通过引物P17/P18用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1958bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.10所示，含点突变序列第320位为T，其余如SEQ ID No.10)的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组过表达的野生型fliI基因和突变型fliI^T171I基因分别命名为YPThr12(不含突变点)和YPThr13(含突变点)、YPTrp002(不含突变点)和YPTrp003(含突变点)、YPR-062(不含突变点)和YPR-063(含突变点)、YPV-100(不含突变点)和YPV-101(含突变点)。

重组菌YPThr12、YPTrp002、YPR-062和YPV-100含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的fliI基因；具体地，重组菌YPThr12、YPTrp002、YPR-062和YPV-100是将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为fliI基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝fliI基因的重组菌可以显著和稳定地提高fliI基因的表达量。

重组菌YPThr13、YPTrp003、YPR-063和YPV-101含有SEQ ID No.3所示的突变的fliI^T171I基因；具体地，重组菌YPThr13、YPTrp003、YPR-063和YPV-101是将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为突变型fliI^T171I基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。这些重组菌均含有fliI基因及其启动子，也含有fliI^T171I基因及其启动子。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P15:5'-GGGCGTTGGA TTAAGTCTGT-3'，

P16:5'-CCATCATCCC CAGCAGCACA-3'，

P17:5'-GTAGAAAGCG AAGTCGTTGG-3'，

P18:5'-CCCACCCAGT AGATTCGGTC-3'。

实施例4、构建基因组上缺失鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI的工程菌株

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的fliI基因)fliI基因，以此在高产菌株中更深入研究大肠埃希氏菌fliI基因对合成L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸的影响。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-3F 10μL，sgRNA-3R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒并用SpeI酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化克隆载体2μL，sgRNA 0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-3。

sgRNA-3F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTcaaaatggcgcagttgcctgGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'，

sgRNA-3R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcaggcaactgcgccattttgAC TAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'，

sgRNA-PF:5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

sgRNA-PR:5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、PCR扩增基因组上缺失的DNA重组片段

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成两对扩增上下游同源臂序列的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式敲除L-氨基酸生产菌fliI基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19:5'-GCGGCGAGGA TACCTATGTC-3'，

P20:5'-ATCTGCCGTT ATCTCCTGGG TACACCACTC CTGGTGCTGC-3'，

P21:5'-GCAGCACCAG GAGTGGTGTA CCCAGGAGAT AACGGCAGAT-3'，

P22:5'-GCGCGTCGGA AACAATATCG-3'。

以W3110基因组DNA为模板，以引物P19/P20、P21/P22和KAPA HiFi HotStartPCR扩增，获得大小分别为721bp和695bp的上同源臂和下同源臂片段；PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P19/P22 overlapPCR获得基因组上缺失fliI的重组DNA片段ΔfliI-Up-Dwon(SEQ ID No.11)1376bp。

三、感受态的制备及转化

制备L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-sgRNA-3质粒和基因组缺失fliI的重组DNA片段ΔfliI-Up-Dwon，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P19/P22用r Taq进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1376bp(SEQ IDNo.11)片段的为阳性转化子，扩增出含有大小2750bp片段的为原菌。

将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P19/P22用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1376bp(SEQ ID No.11)的为阳性转化子。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上缺失fliI基因的阳性转化子分别命名为YPThr14、YPTrp004、YPR-064、YPV-102。

实施例5、构建包含质粒上过表达的鞭毛特异性ATP合成酶活性的fliI和fliI^T171I的工程菌株

依据NCBI公布的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用大肠埃希氏菌表达载体pET-28a(+)(TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)将野生型fliI基因和突变型fliI^T171I基因编码区及启动子区导入L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的fliI基因)，从而在高产菌株中更深入研究多拷贝fliI基因及突变型fliI^T171I基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

制备L-苏氨酸CGMCC25404、L-色氨酸CGMCC25403、L-精氨酸CGMCC25402和L-缬氨酸CGMCC22721感受态细胞。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例1构建的质粒pET28(a)-fliI和pET28(a)-fliI^T171I，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养产生的单菌落通过引物T7t/T7和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1874bp(含点突变的序列第824位为T)片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721质粒过表达的野生型fliI基因和突变型fliI^T171I基因分别命名为YPThr15(不含突变点)和YPThr16(含突变点)、YPTrp005(不含突变点)和YPTrp006(含突变点)、YPR-065(不含突变点)和YPR-066(含突变点)、YPV-103(不含突变点)和YPV-104(含突变点)。

重组菌YPThr15、YPTrp005、YPR-065和YPV-103分别为向L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721中导入pET28(a)-fliI得到的重组菌。pET28(a)-fliI过表达的重组菌可以显著和稳定地提高fliI基因的表达量。

重组菌YPThr16、YPTrp006、YPR-066和YPV-104分别为向L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721中导入pET28(a)-fliI^T171I得到的重组菌。pET28(a)-fliI^T171I过表达的重组菌可以显著和稳定地提高fliI^T171I基因的表达量。

实施例6、发酵实验

一、L-苏氨酸发酵实验

将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110菌株、实施例1的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110-pET28(a)-T171I、L-苏氨酸生产菌CGMCC25404菌株以及上述实施例所得fliI工程菌株YPThr11、YPThr12、YPThr13、YPThr14、YPThr15和YPThr16分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-苏氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中W3110-pET28(a)-T171I、YPThr15和YPThr16为含pET-28a(+)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1(即发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的IPTG)。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-苏氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表4所示。

L-苏氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/L，(NH4)₂SO₄ 1g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，通氨调节pH7.0。

L-苏氨酸发酵培养条件：

校正DO 100％：温度37℃、风量5L/min、转速800rpm、罐压0Mpa，5min后标定；

接种量10％；

初始条件：pH7.0、培养温度37℃、罐压0Mpa、风量0.5L/min、转速400rpm；

全程控制：1、溶氧＜30％时，依次提转速500rpm→600rpm→风量1L/min→700rpm→800rpm；2、发酵8h提罐压0.01Mpa；12h提罐压0.02Mpa→0.03Mpa→0.04Mpa→0.05Mpa；

残糖控制：F12h前0.1-0.5％；F12h后结合DO要求控制残糖0.1-0.3％；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：30h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。

表4、fliI工程菌株的L-苏氨酸产量

菌株	L-苏氨酸浓度(g/L)
		W3110	0.008
W3110-pET28(a)-T171I	0.522
		Escherichia coli CGMCC25404	98.400
YPThr11	99.860
		YPThr12	100.256
YPThr13	101.670
		YPThr14	94.850
YPThr15	100.480
		YPThr16	102.320

由以上发酵结果所示，与W3110相比，W3110-pET28(a)-T171I的L-苏氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与L-苏氨酸生产菌CGMCC25404菌株(Escherichia coliCGMCC25404)相比，YPThr11、YPThr12、YPThr13、YPThr15和YPThr16的L-苏氨酸产量均显著提高(p值<0.01)，YPThr14的L-苏氨酸产量显著下降(p值<0.01)；与YPThr12相比，YPThr13的L-苏氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与YPThr15相比，YPThr16的L-苏氨酸产量显著提高(p值<0.01)；。说明，无论对于高产L-苏氨酸的菌株还是模式菌株W3110，fliI基因的氨基酸序列第171位苏氨酸被异亮氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高；对于高产L-苏氨酸的菌株，野生型fliI基因和突变型fliI^T171I的过表达都助于L-苏氨酸产量的提高，但突变型fliI^T171I的过表达更有利于L-苏氨酸产量的提高，而敲除fliI基因不利于L-苏氨酸产量的提高，反而会使L-苏氨酸产量下降。

二、L-色氨酸发酵实验

将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110菌株、实施例1的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110-pET28(a)-T171I、L-色氨酸生产菌CGMCC25403菌株以及上述实施例所得fliI工程菌株YPTrp001、YPTrp002、YPTrp003、YPTrp004、YPTrp005和YPTrp006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-色氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中W3110-pET28(a)-T171I、YPTrp005和YPTrp006为含pET-28a(+)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-色氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表5所示。

L-色氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖7g/L,FM902酵母粉1g/L,(NH4)₂SO₄ 1.2g/L,柠檬酸1.2g/L,MgSO₄·7H₂O 1.5g/L,K₂HPO₄·3H₂O 5.5g/L,消泡剂0.2mL/L,通氨调pH7.0。

L-色氨酸培养条件：

校正DO 100％：温度35℃，转速800rpm，风量5L/min，罐压0.00Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH7.0，风量1.0L/min，转速350rpm；

全程控制：底糖耗完前溶氧≤20％时，依次提→400rpm→450rpm；底糖耗完，补糖控制溶氧15-30％；pH F24h前7.0、F24h后6.7；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：34h左右,控制过程以溶氧15-30％做提降风量标准。

表5、工程菌的L-色氨酸产量

菌株	L色氨酸浓度(g/L)
		W3110	0.006
W3110-pET28(a)-T171I	0.136
		L-色氨酸生产菌CGMCC25403	38.630
YPTrp001	39.870
		YPTrp002	38.930
YPTrp003	40.630
		YPTrp004	34.650
YPTrp005	39.570
		YPTrp006	41.370

由以上发酵结果所示，与W3110相比，W3110-pET28(a)-T171I的L-色氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与L-色氨酸生产菌CGMCC25403菌株(Escherichia coliCGMCC25403)相比，YPTrp001、YPTrp002、YPTrp003、YPTrp005和YPTrp006的L-色氨酸产量均显著提高(p值<0.01)，YPTrp004的L-色氨酸产量显著下降(p值<0.01)；与YPTrp002相比，YPTrp003的L-色氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与YPTrp005相比，YPTrp006的L-色氨酸产量显著提高(p值<0.01)。说明，无论对于高产L-色氨酸的菌株还是模式菌株W3110，fliI基因的氨基酸序列第171位苏氨酸被异亮氨酸取代后，都有助于L-色氨酸产量的提高；对于高产L-色氨酸菌株，野生型fliI基因和突变型fliI^T171I的过表达都助于L-色氨酸产量的提高，但突变型fliI^T171I的过表达更有利于L-色氨酸产量的提高，而敲除fliI基因不利于L-色氨酸产量的提高，反而会使L-色氨酸产量下降。

三、L-精氨酸发酵实验

将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110菌株、实施例1的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)W3110-pET28(a)-T171I、L-精氨酸生产菌CGMCC25402菌株以及上述实施例所得fliI工程菌株YPR-061、YPR-062、YPR-063、YPR-064、YPR-065和YPR-066分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中W3110-pET28(a)-T171I、YPR-065和YPR-066为含pET-28a(+)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-精氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表6所示。

L-精氨酸氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖8g/L,FM902酵母粉3g/L,K₂HPO₄·3H₂O 6g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，甜菜碱0.5g/L，VB₁₂0.005g/L，消泡剂0.3mL/L，硫酸铵3g/L，pH7.2。

L-精氨酸发酵培养条件：校正DO 100％：温度35℃，pH7.2，转速100rpm，风量6L/min，罐压0.00Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH7.2，罐压0.01mpa、风量1.5L/min，转速350rpm；

全程控制：控制DO在20-30％；溶氧≤25％时，每次提转速300rpm→400rpm→2.0L/min→500rpm→0.02Mpa→600rpm→3.0L/min→0.03Mpa→700rpm→3.5L/min→0.04Mpa→800rpm→900rpm→4.0L/min→0.05Mpa→1000rpm；

残糖控制：全程控制残糖0.05-0.1％；

流加物料：25％氨水、80％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：50h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。

表6、工程菌的L-精氨酸产量

菌株	L-色氨酸浓度(g/L)
		W3110	0.001
W3110-pET28(a)-T171I	0.241
		L-精氨酸生产菌CGMCC25402	75.760
YPR-061	78.660
		YPR-062	76.350
YPR-063	79.970
		YPR-064	73.750
YPR-065	77.780
		YPR-066	80.480

由以上发酵结果所示，与W3110相比，W3110-pET28(a)-T171I的L-精氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与L-精氨酸生产菌CGMCC25402菌株(Escherichia coliCGMCC25402)相比，YPR-061、YPR-062、YPR-063、YPR-065和YPR-066的L-精氨酸产量均显著提高(p值<0.01)，YPR-064的L-精氨酸产量显著下降(p值<0.01)；与YPR-062相比，YPR-063的L-精氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与YPR-065相比，YPR-066的L-精氨酸产量显著提高(p值<0.01)。说明，无论对于高产L-精氨酸菌株还是模式菌株W3110，fliI基因的氨基酸序列第171位苏氨酸被异亮氨酸取代后，都有助于L-精氨酸产量的提高；对于高产L-精氨酸菌株，野生型fliI基因和突变型fliI^T171I的过表达都助于L-精氨酸产量的提高，但突变型fliI^T171I的过表达更有利于L-精氨酸产量的提高，而敲除fliI基因不利于L-精氨酸产量的提高，反而会使L-精氨酸产量下降。

四、L-缬氨酸发酵实验

将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110菌株、实施例1的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W3110-pET28(a)-T171I、L-缬氨酸生产菌CGMCC22721菌株以及上述实施例所得fliI工程菌株YPV-099、YPV-100、YPV-101、YPV-102、YPV-103和YPV-104分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中W3110-pET28(a)-T171I、YPV-103和YPV-104为含pET-28a(+)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-缬氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表7所示。

L-缬氨酸氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为酵母浸粉4g/L，玉米浆干粉2g/L，蛋白胨4g/L，蛋氨酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CoCl₂ 20mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，柠檬酸2g/L，FeSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·7H₂O 30mg/L，VH 20mg/L，VB₁1.5mg/L，VB₃ 1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，消泡剂0.3mL/L，(NH4)₂SO₄ 3g/L，pH值7.0。

L-缬氨酸发酵培养条件：溶氧电极标定方法：在饱和亚硫酸钠溶液中标定零点，空气中标定百点；

L-缬氨酸发酵包含两阶段好氧-限氧发酵，细胞首先被培养在有氧发酵下，前期调整风量转速和补糖速率控制溶氧在25％左右，待OD₆₀₀值至50-60时，转速降至400rpm，风量降至2L/min；并将好氧发酵转为限氧发酵。

表7、工程菌的L-缬氨酸产量

菌株	L-缬氨酸浓度(g/L)
		W3110	0.006
W3110-pET28(a)-T171I	0.136
		L-缬氨酸生产菌CGMCC22721	78.420
YPV-099	79.880
		YPV-100	79.420
YPV-101	81.120
		YPV-102	75.430
YPV-103	80.22
		YPV-104	82.470

上发酵结果所示，与W3110相比，W3110-pET28(a)-T171I的L-精氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与L-缬氨酸生产菌CGMCC22721菌株(Escherichia coliCGMCC22721)相比，YPV-099、YPV-100、YPV-101、YPV-103和YPV-104的L-缬氨酸产量均显著提高(p值<0.01)，YPV-102的L-缬氨酸产量显著下降(p值<0.01)；与YPV-100相比，YPV-101的L-缬氨酸产量显著提高(p值<0.01)；与YPV-103相比，YPV-104的L-缬氨酸产量显著提高(p值<0.01)。说明，无论对于高产L-缬氨酸菌株还是模式菌株W3110，fliI基因的氨基酸序列第171位苏氨酸被异亮氨酸取代后，都有助于L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-缬氨酸菌株，野生型fliI基因和突变型fliI^T171I的过表达都助于L-缬氨酸产量的提高，但突变型fliI^T171I的过表达更有利于L-缬氨酸产量的提高，而敲除fliI基因不利于L-缬氨酸产量的提高，反而会使L-缬氨酸产量下降。

由以上发酵结果可见，无论对于高产L-氨基酸菌株还是模式菌株W3110，fliI基因的氨基酸序列第171位苏氨酸被异亮氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-氨基酸菌株，野生型fliI基因和突变型fliI^T171I的过表达都助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高，而敲除fliI基因不利于其产量的提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.蛋白质，为如下A1)-A3)中的任一种：

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：B2)所述表达盒为SEQ ID No.3的第37-1624位所示的DNA分子，或将SEQ ID No.3的第37-1624位中第762位由C突变为T得到的DNA分子；

B4)所述重组微生物为将含有SEQ ID No.1所示的fliI基因的微生物中的fliI基因替换为SEQ ID No.4所示DNA分子得到的重组微生物，或向微生物中导入SEQ ID No.4或SEQID No.1所示DNA分子并使其得到表达得到的重组微生物。

5.一种制备L-氨基酸的方法，包括：使受体生物细胞中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物细胞中权利要求1所述蛋白质的含量或活性，或提高受体生物细胞中权利要求1所述蛋白质的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-氨基酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为能合成L-氨基酸和/或含有权利要求1所述蛋白质编码基因的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞；

进一步，所述细菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述方法通过向所述受体生物细胞中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因并使其得到表达实现，或增加所述受体生物细胞中权利要求1所述蛋白质的编码基因的拷贝数实现；

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的培养基进行；

9.一种用于制备L-氨基酸的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料。

10.根据权利要求5-8中任一所述的方法，或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述L-氨基酸为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸或L-缬氨酸。