CN115925834A - 氨基酸产量相关蛋白编码基因pyrG及其相关菌株、生物材料和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酸产量相关蛋白pyrG及其生物材料和应用，属于生物技术领域。本申请所要解决的问题是调控微生物氨基酸产量，氨基酸具体可为L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑精氨酸和L‑缬氨酸。所述蛋白质为如下任一种蛋白质：A1)氨基酸序列是序列2第450位天冬氨酸替换为为组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸所示序列的蛋白质；A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。调控pyrG蛋白基因表达的物质可用于调控微生物的氨基酸产量或氨基酸产量菌株的育种。

Description

氨基酸产量相关蛋白编码基因pyrG及其相关菌株、生物材料和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域。尤其涉及氨基酸产量相关蛋白pyrG及其相关菌株、生物材料和应用。

背景技术

已经进行了许多尝试来改进使用肠杆菌属菌株生产L-氨基酸的方法。其中之一是重组DNA技术的研究，通过该技术可操纵特定基因以敲低或减弱表达从而生产L-氨基酸。另外，已经进行了这样的研究，即扩增并分析了参与L-氨基酸生物合成的每种基因对L-氨基酸生产的影响，从而修饰生产L-氨基酸的棒状杆菌属菌株。另外，已经尝试引入源自其他细菌的外来基因。

然而，仍然需要开发用于提高有用物质如L-氨基酸的生产潜力的技术。

发明内容

本申请所要解决的技术问题是如何调控或提高微生物的L-氨基酸产量，尤其是L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的产量。

为解决上述技术问题，本发明提供了蛋白质。

本发明所提供的蛋白质如下任一种蛋白质：

A1)蛋白质，所述蛋白质为pyrG蛋白或将所述pyrG蛋白的氨基酸序列的第450位氨基酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的突变蛋白质：

苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、脯氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、赖氨酸残基、谷氨酸残基、半胱氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或甘氨酸残基；所述pyrG蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质；

A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

上文中，所述第450位氨基酸残基为序列2的第450位氨基酸残基。

上述蛋白质中，所述蛋白质为pyrG蛋白或将所述pyrG蛋白的氨基酸序列的第450位氨基酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的突变蛋白质：

所述氨基酸残基为天冬氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或苯丙氨酸残基；所述pyrG蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSU M62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由个543个氨基酸残基组成。

为解决上述技术问题，本发明还提供了生物材料：

本发明所提供的生物材料可为下述任一种：

B1)、编码上述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；

B6)表达B5)所述RNA分子的编码基因；

B7)含有B6)所述基因的表达盒；

B8)含有B6)所述基因的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；

B9)有B6)所述基因的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，B1)所述的核酸分子为下述任一种：

Z1)编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

Z2)编码序列是SEQ ID No.7所示的DNA分子；

Z3)编码序列是SEQ ID No.9所示的DNA分子；

Z4)编码序列是SEQ ID No.11所示的DNA分子；

Z5)编码序列是SEQ ID No.13所示的DNA分子；

Z6)编码序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；

Z7)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

Z8)核苷酸序列是SEQ ID No.7所示的DNA分子；

Z9)核苷酸序列是SEQ ID No.9所示的DNA分子；

Z10)核苷酸序列是SEQ ID No.11所示的DNA分子；

Z11)核苷酸序列是SEQ ID No.13所示的DNA分子；

Z12)核苷酸序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明提供了下述用途：

下述任一种材料在调控微生物氨基酸产量、或制备调控微生物氨基酸产量、或微生物育种中的用途：

C1)上述的蛋白质；

C2)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；

C3)调控所述蛋白质的活性或含量的物质。

上文中，所述C1)所述的蛋白质序列为序列1所示。

上述用途中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：

D1)、编码权上述蛋白质的核酸分子；

D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；

D6)表达D5)所述RNA分子的编码基因；

D7)含有D6)所述基因的表达盒；

D8)含有D6)所述基因的重组载体、或含有D7)所述表达盒的重组载体；

D9)有D6)所述基因的重组微生物、或含有D7)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物。

D1)所述的编码蛋白可为序列1所述的蛋白质。

B1)或D1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质pyrG的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质TaHsfC2aL的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质pyrG且具有蛋白质pyrG功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda rati o分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述生物材料中，B1)或D1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质的序列如序列6所示。其编码序列如序列5所示。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质的序列如序列8所示。其编码序列如序列7所示。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质的序列如序列10所示。其编码序列如序列9所示。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质的序列如序列14所示。其编码序列如序列13所示。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质的序列如序列12所示。其编码序列如序列所示。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质的序列如序列16所示。其编码序列如序列15所示。

本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pEASY-Blunt和/或pCAMBIA-139；

上述生物材料中，B2)或D2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beach y等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

上述B3)或D3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用TaHsfC2aL构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

上述生物材料中，B5)或D5)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

B5)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质pyrG的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质pyrG的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质pyrG且具有蛋白质pyrG功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda rati o分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

为解决上述技术问题，本申请还提供了一种调控微生物氨基酸产量的方法。

本申请所提供的的调控微生物氨基酸产量的方法包括通过调控目的微生物中上述蛋白质的编码基因的表达或调控所述上述蛋白质的活性或含量，来调控目的微生物氨基酸产量。

为解决上述技术问题，本申请还提供了一种重组微生物的方法。

本申请所提供的的重组微生物的方法包括通过调控目的微生物中上述蛋白质的编码基因的表达或调控所述上述蛋白质的活性或含量，来调控微生物氨基酸产量，得到氨基酸产量变化的微生物，所述氨基酸产量变化的微生物的氨基酸产量高于或低于目的微生物。

上文中，所述调控可为上调或增强或提高，或，下调或减弱或降低。

上文中，所述上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因的表达或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量能够上调或增强或提高微生物氨基酸产量。

上文中，所述下调或减弱或降低所述蛋白质的编码基因的表达或下调或减弱或降低所述蛋白质的活性或含量能够下调或减弱或降低微生物氨基酸产量。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述方法中，所述调控目的为生物中上述蛋白质的编码基因的表达或调控所述蛋白质的活性或含量的方法为下述任一种：

E1)向所述目的微生物中导入上述的蛋白质的编码基因；

E2)向所述目的微生物中导入下述任一种蛋白质的编码基因：

M1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

M2)将M1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与M1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

M3)在M1)或M2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

E3)敲除或下调或减弱或降低所述目的微生物pyrG基因的表达；

E4)将所述目的微生物的基因组中编码序列2蛋白基因发生改变，使其编码的氨基酸序列的第450位天冬氨酸变为组氨酸；

所述序列2蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是序列2所示序列的蛋白质；

A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

上文中，向所述目的微生物中导入上述或序列2蛋白质的编码基因可为将其插入染色体，作为染色体一部分被遗传。所述和插入的位点具体可为yaiT编码区。还可作为染色体外的遗传因子存在。所述染色体外的遗传因子可以质粒形式存在。所述质粒可为pET28(a)。

上文中，所述以质粒形式存在的编码基因可为序列1、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13和序列15中的至少一种。

本申请中，E1)所述编码蛋白可为序列2蛋白、序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质或序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质的序列可为序列6所示。所述序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质的序列可为序列8所示。所述序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质的序列可为序列10所示。所述序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质的序列可为序列14所示。所述序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质的序列可为序列12所示。所述序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质的序列可为序列16所示。

上文中，所述导入何为以染色体形式整合或以染色体外的遗传因子存在。所述染色体外的遗传因子可为质粒。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-谷氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸产量升高，且，L-缬氨酸、L-蛋氨酸产量降低。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-精氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸产量升高，且，L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸产量下降。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中其目的微生物中产量升高，L-谷氨酸、L-精氨酸和L-苏氨酸，且，L-赖氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸产量下降。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中其目的微生物中L-精氨酸和L-苏氨酸产量升高，且，L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸和L-蛋氨酸产量下降。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-谷氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和L-半胱氨酸产量下降。

上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-精氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸产量提升，且，L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸产量下降。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质、序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质或序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质可以染色体外的遗传因子存在。所述染色体外的遗传因子可为质粒。所述质粒可为pET28(a)。

上文中，所述序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质可为以染以染色体形式整合存在。所述染色体形式整合形式的位点可为yaiT基因区域。所述以染色体外的遗传因子可为质粒。所述质粒可为pET28(a)。

上述中，所述微生物可为如下任一种：C1)细菌界；C2)肠杆菌科；C3)埃希氏菌属；C4)大肠杆菌。所述大肠杆菌可为W3110。

上文中，所述序列2蛋白质的序列可为序列2所示。

上文中，所述导入序列为序列2蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量产量提升。

上文中，所述导入可为染色体形式整合或以染色体外的遗传因子存在。所述染色体形式整合形式的位点可为yaiT基因区域。所述以染色体外的遗传因子可为质粒。所述质粒可为pET28(a)。

上文中，所述微生物可为如下任一种：苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGM CC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721。

上文中，所述E2)敲除或下调或减弱或降低所述目的微生物pyrG基因的表达可通过为基因敲除或基因沉默等方法。

上文中，所述基因敲除基因是指：敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术，它可改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽。

上文中，基因沉默是指：基因沉默(Gene Silencing),又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。

上文中，所述E3)发生改变的方法可为通过基因工程定点突变得到上述蛋白。

上文中，所述编码序列2蛋白区域的核苷酸可为序列1所示的核苷酸。所述编码的氨基酸序列的第450位天冬氨酸变为组氨酸可为将序列1所示的第1348位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)。

10.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物可为下述任一种：

K1)所述重组微生物含有内源性pyrG基因外，还含有外源性权利要求1或2所述蛋白的编码基因或序列2蛋白的编码基因；

K2)所述重组微生物的内源性pyrG基因编码蛋白质的第450位天冬氨酸变为组氨酸。

上文中，K1)所述含有外源性权利要求1或2所述蛋白的编码基因可为上文中所述的序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)蛋白质的编码基因、序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)蛋白质的编码基因、序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)蛋白质的编码基因、序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)蛋白质的编码基因、序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)蛋白质的编码基因。序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)蛋白质的编码基因或序列2蛋白的编码基因。存在方式可如上文所述。

为解决上述技术问题，本申请提供了一种制备L-氨基酸的方法。

本申请提供的制备L-氨基酸的方法，包括利用上述的蛋白质或上述的生物材料或上述的重组微生物生产L-氨基酸。

上述的蛋白质、生物材料、用途、方法或重组微生物中，所述微生物为如下任一种：

C1)细菌界；

C2)肠杆菌科；

C3)埃希氏菌属；

C4)大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为W3110、苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402或L-缬氨酸生产菌。

本申请中，所述氨基酸可为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸中的至少一种。

上述重组微生物可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸、谷氨酸与缬氨酸，所生产的产物还可为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。

本发明还提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括：上述生物材料导入能合成目的氨基酸的生物细胞中，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到目的氨基酸。

上述方法中，所述生物细胞可为能合成目的氨基酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。所述生物细胞为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。所述细菌可为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(Pantoea)。

有益效果：

本申请构建了质粒表达载体pET28(a)-pyrG^D450H、pET28(a)-pyrG^D450S、pET28(a)-pyrG^D450G、pET28(a)-pyrG^D450V、pET28(a)-pyrG^D450A和pET28(a)-pyrG^D450F将其分别导入W3110中，结果表明将导入pET28(a)-pyrG^D450H质粒后，重组菌株的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量显著改变。具体为上文中，所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为组氨酸(H)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-谷氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸产量升高，且，L-缬氨酸、L-蛋氨酸产量降低。所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为丝氨酸(S)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-精氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸产量升高，且，L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸产量下降。所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为甘氨酸(G)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中其目的微生物中产量升高，L-谷氨酸、L-精氨酸和L-苏氨酸，且，L-赖氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸产量下降。所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为丙氨酸(A)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中其目的微生物中L-精氨酸和L-苏氨酸产量升高，且，L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸和L-蛋氨酸产量下降。所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为缬氨酸(V)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-谷氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和L-半胱氨酸产量下降。所述导入序列为序列2第450位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(F)的蛋白质的编码基因，其目的微生物中L-精氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸产量提升，且，L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸产量下降。

进一步，利用基因敲除技术将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404(高产L-苏氨酸)、L-色氨酸生产菌CGMCC25403(高产L-色氨酸)、L-精氨酸生产菌CGMCC25402(高产L-精氨酸)和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721(高产L-缬氨酸)中的pyrG基因替换为pyrG^D450H基因。结果表明，pyrG基因替换为pyrG^D450H基因的上述高产菌株的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量显著提升。

进一步，构建了pyrG基因和pyrG^D450H基因的基因组过表达载体，将pyrG基因和pyrG^D450H基因插入上述高产菌株yaiT基因区域，获得pyrG基因组过表达菌株。结果表明：以染色整合的方式过表达将pyrG基因和pyrG^D450H基因可使上述高产菌株的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量显著提高。

进一步，构建了pyrG基因敲除载体，导入L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸高产菌株中(L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721)。结果表明：敲除pyrG基因的上述高产菌株的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量显著下降。

进一步，构建了pyrG基因和pyrG^D450H基因的质粒过表达载体，将pyrG基因和pyrG^D450H基因整合进pET28(a)并导入L-苏氨酸生产菌CGMCC25404(高产L-苏氨酸)、L-色氨酸生产菌CGMCC25403(高产L-色氨酸)、L-精氨酸生产菌CGMCC25402(高产L-精氨酸)和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721(高产L-缬氨酸)，获得pyrG质粒过表达菌株和pyrG^D450H基因组过表达菌株。结果表明：以质粒的方式过表达将pyrG基因和pyrG^D450H基因可使上述高产菌株的L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量显著提高。

结果表明L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量明显提升。如上所述，无论对于高产L-氨基酸菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的编码氨基酸序列(序列2所示)第450位天冬氨酸替换为组氨酸后，有助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-氨基酸菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于其产量的提高。

保藏说明

1.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichiacoli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)

菌株编号：YP045

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2021年6月15日。

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.22721。

2.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichiacoli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)

菌株编号：YP004-8

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2022年7月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.25402。

3.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichiacoli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)

菌株编号：YP006D

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2022年7月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.25403。

4.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichiacoli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)

菌株编号：YP0158

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2022年7月25日。

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.24504。

具体实施方式

下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

实施例1、构建pyrG基因突变型W3110菌株

一、pyrG基因突变型质粒的构建

为了研究方便，首先将野生型pyrG基因(序列如SEQ ID No.1)及其启动子克隆到表达载体pET28(a)中。以NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列为模板，分别以引物pET28-PF/pET28-PR PCR扩增，获得野生型pyrG基因片段。回收后与经EcoRI/Hind III酶切回收的表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养，获得含pyrG基因的pET28(a)转化子pET28(a)-pyrG(序列如SEQ ID No.3)。对培养长出的单克隆用引物T7-F/T7-R和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1933bp(序列如SEQ ID No.4)片段的为含pyrG基因的pET28(a)阳性转化子pE T28(a)-pyrG。

为了获得编码胞苷三磷酸合成酶基因pyrG的突变体，使用随机诱变试剂盒(Agilent Technologies,USA)制备了pyrG突变型基因质粒。以质粒pET28(a)-pyrG为模板，分别以引物pET28-PF/pET28-PR PCR扩增，获得了包含随机点突变的pyrG基因片段1638bp含pyrG基因的pET28(a)阳性转化子pET28(a)-pyrG-MT(序列如SEQ ID No.3，但pyrG编码区存在随机点突变)。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL.

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

回收的DNA片段与经EcoR I/Hind III酶切回收的表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7-F/T7-R和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1933bp(序列如SEQ ID No.4，但pyrG编码区存在随机点突变)片段的为含pyrG随机突变的pET28(a)阳性转化子。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O至总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

pET28-PF:5'-TAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCatgacaacgaactatatttttgtga-3'(带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列)，

pET28-PR:5'-CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCttacttcgcctgacgtttctg-3'(带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列)。

T7-R:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

T7-F:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

二、pyrG基因突变型菌株的构建

为了鉴定步骤一中构建的突变载体的L-氨基酸生产性能，具体地，将步骤一中构建的pyrG随机突变质粒转化到大肠杆菌W3110菌株(其基因组序列如genebank：AP009048.1所示)中(转化和鉴定同步骤一)，将阳性转化子在卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有丰富培养基30mL的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导CTP合成酶过表达，摇瓶发酵24h后结束。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析L-氨基酸的浓度，如表1所示。挑选具有比W3110对照的各L-氨基酸生产能力优越的菌株，即为W3110-pET-28a-pyrG突变株。

丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖30g/L，(NH4)₂SO₄2g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，甜菜碱0.5g/L，柠檬酸2g/L，VH 20mg/L，VB₁1.5mg/L，VB₃1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，氢氧化钠调节pH7.0.

最终，获得5株候选菌株，分别命名为突变株1、突变株2、突变株3、突变株4和突变株5(具体如表1所示)，本公开的大肠杆菌W3110-pyrG突变株具有产部分L-氨基酸的能力，其中W3110-pyrG突变株2产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力更优越。表明pyrG突变株2有合成L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的活性。

表1 W3110-pyrG突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

通过从W3110-pyrG突变株2提取质粒对pyrG基因进行测序的结果，确认了pyrG突变体核苷酸序列的第1348位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)，其突变型蛋白质pyrG氨基酸序列中的第450位天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)，此质粒即为pET28(a)-pyrG^D450H(序列如SEQ IDNo.3所示，其第1348位突变为C。其中，SEQ ID No.1所示的DNA序列为野生型pyrG基因，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.2(所述蛋白质名称为野生型pyrG蛋白质)；SEQ ID No.5所示的DNA序列为突变型pyrG^D450H基因，所述突变型pyrG^D450H基因序列(SEQ ID No.5)中第1348位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.6(所述突变蛋白质名称为突变型pyrG^D450H蛋白质)，所述突变型蛋白质pyrG^D450H基酸序列(SEQ ID No.6)中的第450位组氨酸(H)由天门冬氨酸(D)突变而来。

三、pyrG基因突变体质粒的构建

以随机突变的方式利用野生型大肠杆菌W3110获得了W3110-pyrG突变株2。为了获得更多pyrG突变株以提高其L-氨基酸的生产能力，构建以上述pyrG突变位置的氨基酸用不同氨基酸取代的突变体。具体地，以步骤二中测序的质粒为模板，构建了其中在pyrG第450位氨基酸用不同氨基酸取代的5种突变体。突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如表2。

表2 pyrG突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

S-PR:5'-atcgCTaaccaactggcactgctgtgcgccgagacgcatg-3'，

S-PF:5'-catgcgtctcggcgcacagcagtgccagttggttAGcgat-3'，

G-PR:5'-atcCCcaaccaactggcactgctgtgcgccgagacgcatg-3'，

G-PF:5'-catgcgtctcggcgcacagcagtgccagttggttgGGgat-3'，

V-PR:5'-atcAAcaaccaactggcactgctgtgcgccgagacgcatg-3'，

V-PF:5'-catgcgtctcggcgcacagcagtgccagttggttgTTgat-3'，

A-PR:5'-atcgGcaaccaactggcactgctgtgcgccgagacgcatg-3'，

A-PF:5'-catgcgtctcggcgcacagcagtgccagttggttgCcgat-3'，

F-PR:5'-atcgAAaaccaactggcactgctgtgcgccgagacgcatg-3'，

F-PF:5'-catgcgtctcggcgcacagcagtgccagttggttTTcgat-3'，

以步骤二中测序的质粒pET28(a)-pyrG^D450H为模板，分别以表2中的引物和KAPAHiFi HotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有pyrG突变碱基的Up DNA片段1417bp和DownDNA片段393bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收Up和Down DNA片段。回收后的DNA片段与经EcoR I/Hind III酶切回收的表达载体pET28(a)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7-F/T7-R PCR鉴定，用r Taq PCR扩增出含有大小1933bp片段的为pyrG突变pET28(a)的阳性转化子，其中在第450位的苏氨酸用表2中的各氨基酸取代的5种pyrG突变载体如表2中所列的名称进行命名。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

四、CTP合成酶突变型菌株的构建

为了鉴定步骤三中构建的突变载体对L-氨基酸的生产性能，具体地，将步骤三中构建的质粒转化到大肠杆菌W3110菌株中(转化和鉴定同步骤一)，将阳性转化子分别在卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30mL丰富培养基的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导胞苷三磷酸合成酶CTP过表达。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析L-氨基酸的浓度，如表3所示。突变株W3110-pET28(a)-D450H产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-D450S、W3110-pET28(a)-D450G、W3110-pET28(a)-D450A、W3110-pET28(a)-D450V和W3110-pET28(a)-D450F更优越。

表3 W3110-pyrG突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

实施例2、构建基因组pyrG^D450H突变型的工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对L-氨基酸高产菌株pyrG基因进行点突变，以此在高产菌株中更深入研究pyrG基因及突变型pyrG^D450H基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

在pyrG基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将pyrG基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第1348位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)得到SEQ ID No.5所示的DNA分子(突变型pyrG基因，名称为突变型pyrG^D450H基因)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.2(所述蛋白质名称为野生型pyrG蛋白质)。SEQ ID No.5所示的DNA分子编码蛋白质氨基酸序列为SEQID No.6(所述突变蛋白质名称为突变型pyrG^D450H蛋白质)，所述突变型蛋白质pyrG^D450H氨基酸序列(SEQ ID No.6)中的第450位组氨酸(H)由天门冬氨酸(D)突变而来。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-1F 10μL，sgRNA-1R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒并用Spe I酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒(addgene网站#71539)自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化克隆载体2μL，sgRNA 0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-1。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的碱基为sgRNA序列：

sgRNA-1F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTcggcgcacagcagtg

ccagtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'

sgRNA-1R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACactggcactgc

tgtgcgccg ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'’

sgRNA-PF:5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'

sgRNA-PR:5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'

二、基因突变型pyrG^D450H DNA的扩增

以W3110基因组DNA为模板，分别以引物P1/P2，P3/P4和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基大小分别为563bp(pyrG^D450H Up)和310bp(pyrG^D450HDown)的pyrG^D450H DNA片段。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收pyrG^D450H Up和pyrG^D450H Down。回收后的DNA以引物P1/P4 overlap PCR获得点突变整合同源臂DNA片段Up-pyrG^D450H-Down(SEQ ID No.17)853bp。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，下划线加粗字体的碱基为突变位置：

P1:5'-ACGATTCAGCTTAAACTGCCCG-3'，

P2:5'-CTGGCGAACCAGGCTATCGTGAACCAACTGGCACTGCTGT-3'，

P3:5'-ACAGCAGTGCCAGTTGGTTCACGATAGCCTGGTTCGCCAG-3'，

P4:5'-TTACTTCGCCTGACGTTTCTGGAA-3'，

三、感受态的制备及转化

提取pREDCas9质粒(addgene公司，货号#7154，含有壮观霉素抗性基因)，分别转化到L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素(100mg/L)的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR用r Taq PCR鉴定，获得943bp(SEQ ID No.18)的为含有pREDCas9质粒的L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9转化子。

制备L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并转化pGRB-sgRNA-1质粒和点突变重组DNA片段Up-pyrG^D450H-Down，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。用引物P5/P6和r Taq对转化子进行PCR鉴定，将得到的933bp(SEQ ID No.19)PCR产物通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以Up-pyrG^D450H-Down扩增PCR片段为阳性对照，W3110扩增PCR片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此PCR片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P5:5'-CCGGGCCTGTTGAAATCTCA-3'，

P6:5'-TACCCAGGGTACGCGTTGC-3'，

pRedCas9-PF:5'-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3'

pRedCas9-PR:5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

SSCP电泳PAGE的制备及电泳条件：40％丙烯酰胺8mL、甘油4mL、10×TBE 2mL、TEMED40μL、10％APS 600μL、ddH₂O 26mL；将电泳槽置入冰中，电压120V在1×TBE缓冲液中电泳10h。

将点突变成功的转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-1，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P3/P4 PCR扩增点突变序列测序鉴定，测序结果与W3110基因组序列进行比对，确定pyrG基因第1350位碱基C突变为碱基G的为基因突变型pyrG^D450H阳性转化子。将基因突变型pyrG^D450H的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr-pyrG001、YPTrp-pyrG001、YPR-pyrG001和YPV-pyrG001。

实施例3、构建基因组上过表达pyrG基因和pyrG^D450H基因的工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721 yaiT基因编码区内(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的yaiT和pyrG基因)分别整合野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H基因，以此在高产菌株中更深入研究pyrG基因及突变型pyrG^D450H基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸合成量的影响。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-2F 10μL，sgRNA-2R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒并用Spe I酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，SpeⅠ2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，pGRB质粒DNA1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化克隆载体2μL，sgRNA 0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-2。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写突出字体的碱基为sgRNA序列：

sgRNA-2F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTggcaactatg taaactatagG TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'

sgRNA-2R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctatagttta catagttgccA CTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'’

sgRNA-PF:5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'

sgRNA-PR:5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'

二、PCR扩增基因组过表达的DNA序列

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及pyrG或pyrG^D450H基因编码区及启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式在L-氨基酸生产菌yaiT编码区内分别引入pyrG基因或pyrG^D450H基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'-AAGAGAATGG AAGAGAGGCC-3'，

P8:5'-CGCTTGACCGCGTAATTCCCCCCAATCAAGTGCTGTAACG-3'，

P9:5'-CGTTACAGCACTTGATTGGGGGGAATTACGCGGTCAAGCG-3'，

P10:5'-TCACAAAAATATAGTTCGTTGTCATGCTGAACCTGAGAAGTTAGGTTGA-3'，

P11:5'-TCAACCTAACTTCTCAGGTTCAGCATGACAACGAACTATATTTTTGTGA-3'，

P12:5'-CGGTAGTGTAGGTTTCGTTGTAGGTTTTCCTCAAGTCACTAGTTA-3'，

P13:5'-TAACTAGTGACTTGAGGAAAACCTACAACGAAACCTACACTACCG-3'，

P14:5'-CGACCTGTAG TATCCCATTC-3'。

以W3110基因组DNA为模板，以引物P7/P8和P13/P14及KAPA HiFi HotStart PCR扩增，获得上同源臂590bp(SEQ ID No.201-590位)和下同源臂片段610bp(SEQ IDNo.202498-3107位)；以W3110基因组DNA为模板，以引物P9/P10和KAPA HiFi HotStart PCR扩增pyrG启动子片段227bp(SEQ ID No.20571-797位)；分别以W3110基因组DNA和质粒pET28(a)-pyrG^D450H为模板，以引物P11/P12和KAPA HiFi HotStart分别PCR扩增pyrG(SEQID No.20774-2542位)和pyrG^D450H基因(SEQ ID No.21774-2542位)1769bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P7和P14overlap PCR分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-pyrG-Down(SEQ ID No.20)和Up-pyrG^D450H-Down(SEQ ID No.21)3107bp。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

三、感受态的制备及转化

当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-sgRNA-2质粒和基因组过表达DNA片段Up-pyrG-Down和Up-pyrG^D450H-Down，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P15/P16用r TaqPCR鉴定，PCR扩增出含有大小1282bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.22所示，含点突变序列第210位为C，其余如SEQ ID No.22)的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，通过引物P17/P18用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小2371bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.23所示，含点突变序列第2225位为C，其余如SEQ ID No.23)的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组过表达的野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H基因分别命名为YPThr-pyrG002(不含突变点)和YPThr-pyrG003(含突变点)、YPTrp-pyrG002(不含突变点)和YPTrp-pyrG003(含突变点)、YPR-pyrG002(不含突变点)和YPR-pyrG003(含突变点)、YPV-pyrG002(不含突变点)和YPV-pyrG003(含突变点)。

重组菌YPThr-pyrG002、YPTrp-pyrG002、YPR-pyrG002和YPV-pyrG002含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的pyrG基因；具体地，重组菌YPThr-pyrG002、YPTrp-pyrG002、YPR-pyrG002和YPV-pyrG002是将Escherichia coli L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为pyrG基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝pyrG基因的重组菌可以显著和稳定地提高pyrG基因的表达量。

重组菌YPThr-pyrG003、YPTrp-pyrG003、YPR-pyrG003和YPV-PYRG003含有SEQ IDNo.3所示的突变的pyrG^D450H基因；具体地，重组菌YPThr-pyrG003、YPTrp-pyrG003、YPR-pyrG003和YPV-pyrG003是将Escherichia coli L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为突变型pyrG^D450H基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝pyrG^D450H基因的重组菌可以显著和稳定地提高pyrG基因的表达量。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P15:5'-TGGGTATGCAGGTGGCGT-3'，

P16:5'-CAATGTTCAGCGAAGAACCGTTAG-3'，

P17:5'-GATGTTTGTGGAATCGAGGG-3'，

P18:5'-GACCAACTGATCATCCCCGG3'。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

实施例4、构建基因组缺失pyrG基因的工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的pyrG基因)pyrG基因，以此在高产菌株中更深入研究大肠杆菌pyrG基因对合成L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸的影响。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-3F 10μL，sgRNA-3R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

提取pGRB质粒并用Spe I酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行sgRNA和pGRB质粒的重组。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化克隆载体2μL，sgRNA 0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的质粒命名为pGRB-sgRNA-3。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写突出字体的碱基为sgRNA序列：

sgRNA-3F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTagcttcggtctgaaagctgtGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'

sgRNA-3R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACacagctttcagaccgaagct A CTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'’

sgRNA-PF:5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'

sgRNA-PR:5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'

二、PCR扩增基因组上缺失的DNA重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成两对扩增上下游同源臂序列的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式敲除L-氨基酸生产菌pyrG基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19:5'-AATGACAAGCGCTTGATTTGCG-3'，

P20:5'-TGACGTTCTGCGTAAAGAACGCCCAACATGGAGAACGCCAACTCT-3'，

P21:5'-AGAGTTGGCGTTCTCCATGTTGGGCGTTCTTTACGCAGAACGTCA-3'，

P22:5'-ACAACGCGTACCCAGGGTACGCG-3'。

以W3110基因组DNA为模板，以引物P19/P20、P21/P22和KAPA HiFi HotStart PCR扩增，获得大小分别为523bp和524bp的上同源臂和下同源臂片段；PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P19/P22overlap PCR获得基因组上缺失pyrG的重组DNA片段ΔpyrG-Up-Dwon(SEQ ID No.24)1022bp。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

三、感受态的制备及转化

制备L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-sgRNA-3质粒和基因组缺失pyrG的重组DNA片段ΔpyrG-Up-Dwon，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P19/P22用r Taq进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1002bp(SEQ IDNo.24)片段的为阳性转化子，扩增出含有大小1870bp片段的为原菌。

将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P19/P22用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1002bp(SEQ ID No.24)的为阳性转化子。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上缺失pyrG基因的阳性转化子分别命名为YPThr-pyrG004、YPTrp-pyrG004、YPR-pyrG004、YPV-pyrG004。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

实施例5、构建以质粒过表达的pyrG基因和pyrG^D450H基因的工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用大肠杆菌表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)将野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H基因编码区及启动子区导入L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的pyrG基因)，从而在高产菌株中更深入研究多拷贝pyrG基因及突变型pyrG^D450H基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

制备L-苏氨酸CGMCC25404、L-色氨酸CGMCC25403、L-精氨酸CGMCC25402和L-缬氨酸CGMCC22721感受态细胞。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例1构建的质粒pET28(a)-pyrG和pET28(a)-pyrG^D450H，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养产生的单菌落通过引物T7-F/T7-R和r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1874bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.4所示，含点突变的序列第824位为T，其余如SEQ ID No.4)片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721质粒过表达的野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H基因分别命名为YPThr-pyrG005(不含突变点)和YPThr-pyrG006(含突变点)、YPTrp-pyrG005(不含突变点)和YPTrp-pyrG006(含突变点)、YPR-pyrG005(不含突变点)和YPR-pyrG006(含突变点)、YPV-pyrG005(不含突变点)和YPV-pyrG006(含突变点)。

重组菌YPThr-pyrG005、YPTrp-pyrG005、YPR-pyrG005和YPV-pyrG005含有pET28(a)-pyrG过表达的SEQ ID No.1所示的pyrG基因，保持其基因组序列不变得到的重组菌。pET28(a)-pyrG过表达的重组菌可以显著和稳定地提高pyrG基因的表达量。

重组菌YPThr-pyrG006、YPTrp-pyrG006、YPR-pyrG006和YPV-pyrG006含有pET28(a)-pyrG^D450H过表达的SEQ ID No.5所示的突变型pyrG^D450H基因，保持其基因组序列不变得到的重组菌。pET28(a)-pyrG^D450H过表达的重组菌可以显著和稳定地提高pyrG^D450H基因的表达量。

实施例6、发酵实验

一、L-苏氨酸发酵实验

将Escherichia coli W3110菌株、Escherichia coli W3110-pET28(a)-D450H、Escherichia coli CGMCC25404菌株以及pyrG工程菌株YPThr-pyrG001、YPThr-pyrG002、YPThr-pyrG003、YPThr-pyrG004、YPThr-pyrG005和YPThr-pyrG006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-苏氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验(具体如下)，每个菌株重复三次。

其中YPThr-pyrG005和YPThr-pyrG006为含pET28(a)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，发酵培养菌体长至OD_600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG，发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-苏氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表4所示。

L-苏氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/L，(NH4)₂SO₄1g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，通氨调节pH7.0.

L-苏氨酸发酵培养条件：

校正DO 100％：温度37℃、风量5L/min、转速800rpm、罐压0Mpa，5min后标定；

接种量10％；

初始条件：pH7.0、培养温度37℃、罐压0Mpa、风量0.5L/min、转速400rpm；

全程控制：1、溶氧＜30％时，依次提转速500rpm→600rpm→风量1L/min→700rpm→800rpm；2、发酵8h提罐压0.01Mpa；12h提罐压0.02Mpa→0.03Mpa→0.04Mpa→0.05Mpa；

残糖控制：F12h前0.1-0.5％；F12h后结合DO要求控制残糖0.1-0.3％；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

IPTG添加：发酵培养菌体长至OD600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG；

发酵周期：30h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-苏氨酸的菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的氨基酸序列第450位天冬氨酸被组氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高；对于高产L-苏氨酸的菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-苏氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于L-苏氨酸产量的提高。

二、L-色氨酸发酵实验

将Escherichia coli W3110菌株、Escherichia coli W3110-pET28(a)-D450H、Escherichia coli CGMCC25403菌株以及突变菌株YPTrp-pyrG001、YPTrp-pyrG002、YPTrp-pyrG003、YP trp004、YPTrp-pyrG005和YPTrp-pyrG006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-色氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPTrp-pyrG005和YPTrp-pyrG006为含pET28(a)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，发酵培养菌体长至OD_600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-色氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表5所示。

L-色氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖7g/L,FM902酵母粉1g/L,(NH4)₂SO₄ 1.2g/L,柠檬酸1.2g/L,MgSO₄·7H₂O 1.5g/L,K₂HPO₄·3H₂O 5.5g/L,消泡剂0.2mL/L,通氨调pH7.0.

L-色氨酸培养条件：

校正DO 100％：温度35℃，转速800rpm，风量5L/min，罐压0.00Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH7.0，风量1.0L/min，转速350rpm；

全程控制：底糖耗完前溶氧≤20％时，依次提→400rpm→450rpm；底糖耗完，补糖控制溶氧15-30％；pH F24h前7.0、F24h后6.7；

残糖控制：F12h前0.1-0.5％；F12h后结合DO要求控制残糖0.1-0.3％；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

IPTG添加：发酵培养菌体长至OD_600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG；

发酵周期：34h左右,控制过程以溶氧15-30％做提降风量标准。

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-色氨酸的菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的氨基酸序列第450位天冬氨酸被组氨酸取代后，都有助于L-色氨酸产量的提高；对于高产L-色氨酸菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-色氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于L-色氨酸产量的提高。

三、L-精氨酸发酵实验

将Escherichia coli W3110菌株、Escherichia coli W3110-pET28(a)-D450H、Escherichia coli CGMCC25402菌株以及pyrG工程菌株YPR-pyrG001、YPR-pyrG003、YPR-pyrG003、YPR-pyrG004、YPR-pyrG005和YPR-pyrG006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPR-pyrG005和YPR-pyrG006为含pET28(a)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-精氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表6所示。

L-精氨酸氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖8g/L,FM902酵母粉3g/L,K₂HPO₄·3H₂O 6g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，甜菜碱0.5g/L，VB₁₂0.005g/L，消泡剂0.3mL/L，硫酸铵3g/L，pH7.2.

L-精氨酸发酵培养条件：校正DO 100％：温度35℃，pH7.2，转速100rpm，风量6L/min，罐压0.01Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH7.2，罐压0.01mpa、风量1.5L/min，转速350rpm；

全程控制：控制DO在20-30％；溶氧≤25％时，每次提转速300rpm→400rpm→2.0L/min→500rpm→0.02Mpa→600rpm→3.0L/min→0.03Mpa→700rpm→3.5L/min→0.04Mpa→800rpm→900rpm→4.0L/min→0.05Mpa→1000rpm；

残糖控制：全程控制残糖0.05-0.1％；

流加物料：25％氨水、80％浓糖、10％泡敌；

IPTG添加：发酵培养菌体长至OD_600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG；

发酵周期：50h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-精氨酸菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的氨基酸序列第450位天冬氨酸被组氨

+酸取代后，都有助于L-精氨酸产量的提高；对于高产L-精氨酸菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-精氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于L-精氨酸产量的提高。

四、L-缬氨酸发酵实验

将Escherichia coli W3110菌株、Escherichia coli W3110-pET28(a)-D450H、scherichia coli CGMCC22721菌株以及pyrG工程菌株YPV-pyrG001、YPV-pyrG002、YPV-pyrG003、YPV-pyrG004、YPV-pyrG005和YPV-pyrG006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPV-pyrG005和YPV-pyrG006为含pET28(a)过表达的菌株，发酵过程中需要IPTG诱导。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-缬氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表7所示。

L-缬氨酸氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为酵母浸粉4g/L，玉米浆干粉2g/L，蛋白胨4g/L，蛋氨酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CoCl₂ 20mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，柠檬酸2g/L，FeSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·7H₂O 30mg/L，VH 20mg/L，VB₁1.5mg/L，VB₃1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，消泡剂0.3mL/L，(NH4)₂SO₄ 3g/L，pH值7.0。

L-缬氨酸发酵培养条件：校正DO 100％：温度37℃，pH7.2，转速100rpm，风量6L/min，罐压0.00Mpa；

接种量；10％；

初始条件：温度37℃，pH7.2，罐压0.01mpa、风量1.5L/min，转速350rpm；

好氧阶段：控制DO在20-30％；溶氧≤25％时，每次提转速300rpm→400rpm→2.0L/min→500rpm→0.02Mpa→600rpm→3.0L/min→0.03Mpa→700rpm→3.5L/min→0.04Mpa→800rpm→900rpm→4.0L/min→0.05Mpa→1000rpm；

厌氧阶段：当OD达到50-60时，转速降低到400rpm，风量降低到2L/min

残糖控制：全程控制残糖0.1-0.2％；

流加物料：25％氨水、60％浓糖、10％泡敌；

IPTG添加：在好氧阶段，发酵培养菌体长至OD_600nm＝0.1时加入终浓度0.1mM的IPTG；

发酵周期：50h左右。

L-缬氨酸发酵包含两阶段好氧-限氧发酵，细胞首先被培养在有氧发酵下，前期调整风量转速和补糖速率控制溶氧在25％左右，待OD₆₀₀值至50-60时，转速降至400rpm，风量降至2L/min；并将好氧发酵转为限氧发酵。

上发酵结果所示，无论对于高产L-缬氨酸菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的氨基酸序列第450位天冬氨酸被组氨酸取代后，都有助于L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-缬氨酸菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-缬氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于L-缬氨酸产量的提高。

由以上发酵结果可见，无论对于高产L-氨基酸菌株还是模式菌株W3110，pyrG基因的氨基酸序列第450位天冬氨酸被组氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-氨基酸菌株，野生型pyrG基因和突变型pyrG^D450H的过表达都助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高，而敲除pyrG基因不利于其产量的提高。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (12)

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1)蛋白质，所述蛋白质为pyrG蛋白或将所述pyrG蛋白的氨基酸序列的第450位氨基酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的突变蛋白质：

苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、脯氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、赖氨酸残基、谷氨酸残基、半胱氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或甘氨酸残基；所述pyrG蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质；

A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为pyrG蛋白或将所述pyrG蛋白的氨基酸序列的第450位氨基酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的突变蛋白质：

所述氨基酸残基为天冬氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或苯丙氨酸残基；所述pyrG蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)、编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；

B6)表达B5)所述RNA分子的编码基因；

B7)含有B6)所述基因的表达盒；

B8)含有B6)所述基因的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；

B9)有B6)所述基因的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。

4.如权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1)所述的核酸分子为下述任一种：

Z1)编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

Z2)编码序列是SEQ ID No.7所示的DNA分子；

Z3)编码序列是SEQ ID No.9所示的DNA分子；

Z4)编码序列是SEQ ID No.11所示的DNA分子；

Z5)编码序列是SEQ ID No.13所示的DNA分子；

Z6)编码序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；

Z7)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

Z8)核苷酸序列是SEQ ID No.7所示的DNA分子；

Z9)核苷酸序列是SEQ ID No.9所示的DNA分子；

Z10)核苷酸序列是SEQ ID No.11所示的DNA分子；

Z11)核苷酸序列是SEQ ID No.13所示的DNA分子；

Z12)核苷酸序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子。

5.下述任一种材料在调控微生物氨基酸产量、或制备调控微生物氨基酸产量、或微生物育种中的用途：

C1)权利要求1或2所述的蛋白质；

C2)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；

C3)调控所述蛋白质的活性或含量的物质。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：

D1)、编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)抑制或降低或下调权利要求1或序列2所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；

D6)表达D5)所述RNA分子的编码基因；

D7)含有D6)所述基因的表达盒；

D8)含有D6)所述基因的重组载体、或含有D7)所述表达盒的重组载体；

D9)有D6)所述基因的重组微生物、或含有D7)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物。

7.一种调控微生物氨基酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括通过调控目的微生物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述权利要求1或2所述蛋白质的活性或含量，来调控目的微生物氨基酸产量。

8.一种重组微生物的方法，所述方法包括通过调控目的微生物权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述权利要求1或2所述蛋白质的活性或含量，来调控微生物氨基酸产量，得到氨基酸产量变化的微生物，所述氨基酸产量变化的微生物的氨基酸产量高于或低于目的微生物。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述调控目的为生物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述蛋白质的活性或含量的方法为下述任一种：

E1)向所述目的微生物中导入权利要求1或2所述的蛋白质的编码基因；

E2)向所述目的微生物中导入下述任一种蛋白质的编码基因：

M1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

M2)将M1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与M1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

M3)在M1)或M2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

E3)敲除或下调或减弱或降低所述目的微生物pyrG基因的表达；

E4)将所述目的微生物的基因组中编码序列2蛋白基因发生改变，使其编码的氨基酸序列的第450位天冬氨酸变为组氨酸；

所述序列2蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是序列2所示序列的蛋白质；

A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控微生物氨基酸产量的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

10.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物可为下述任一种：

K1)所述重组微生物含有内源性pyrG基因外，还含有外源性权利要求1或2所述蛋白的编码基因或序列2蛋白的编码基因；

K2)所述重组微生物的内源性pyrG基因编码蛋白质的第450位天冬氨酸变为组氨酸。

11.一种制备L-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的蛋白质或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求3或4所述的重组微生物生产L-氨基酸。

12.如权利要求1或2所述的蛋白质、权利要求3或4所述的生物材料、权利要求5或6所述的用途、权利要求7-9、11任一所述的方法、权利要求10所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为如下任一种：

C1)细菌界；

C2)肠杆菌科；

C3)埃希氏菌属；

C4)大肠杆菌。