CN115873814A

CN115873814A - 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶编码基因folD在L-氨基酸合成中的应用

Info

Publication number: CN115873814A
Application number: CN202211127753.XA
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 魏爱英; 杨立鹏; 赵春光; 田斌; 杨飞
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明公开了双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶编码基因folD在L‑氨基酸合成中的应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质及其编码基因。本发明构建了包含点突变(T‑A)的基因工程菌、基因组上和质粒上过表达folD基因或folD^T107A基因的工程菌，以及基因组上缺失folD基因的工程菌，经发酵实验表明，folD基因及folD^T107A基因参与了L‑氨基酸的生物合成，对folD基因编码区进行点突变(T‑A)或在生产菌中过表达folD基因或folD^T107A基因，有助于L‑氨基酸产量及转化率的提高，可以培育符合工业化生产的高产高质量菌种，对L‑氨基酸的工业化生产具有重要的意义。

Description

双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶编码基因folD在L-氨基酸合成中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶编码基因folD在L-氨基酸合成中的应用。

背景技术

氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称，是构成蛋白质大分子的基础结构，几乎一切生命活动都与之相关，是人体必不可少的物质，有些则直接用作药物。虽然存在于自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸(除甘氨酸外)。近年来，L-氨基酸在食品工业、医药、农业、畜牧业、以及人类健康、保健、化妆品行业等方面，发挥了越来越广泛的作用。我国是氨基酸生产和消费大国，无论是在工业总产量还是在年产值方面，都居于世界前列，在我国国民经济发展中扮演着重要角色，但仍然存在着主要生产技术指标落后、能源消耗大、生产成本较高、发酵产率和转化率低等问题。传统的氨基酸生产方法有提取法、化学合成法、酶法以及微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本较高、污染环境，难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-氨基酸最主要的方法，目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。微生物发酵，就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物，积累特定的氨基酸，这些方法成立的一个重要原因是使用选育的氨基酸生物合成高能力的菌株。

优良的生产菌种是提高氨基酸产量和质量的保障。随着重组DNA技术的发展和相关微生物基因组信息的获得，基于代谢工程原理的基因工程育种技术逐渐成为主流。对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造，人为改变菌种的代谢调控机制，使微生物体内的代谢流按照所要求的方向进行，过量积累氨基酸、大幅提高氨基酸的产量、降低成本，对加快L-氨基酸产业化的进程具有重要的意义。

亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD)，又称为亚甲基四氢叶酸环水解酶，是一种具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶及环化水解酶双重活性的双功能酶(由folD基因编码)，其在叶酸代谢中起着至关重要的作用。目前尚没有关于MTHFD在L-氨基酸生产中的功能研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何通过基因的遗传改造提高微生物L-氨基酸的产量，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为folD^L36Q，所述蛋白质folD^L36Q可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本发明还提供了核酸分子，名称为folD^T107A，所述核酸分子folD^T107A可为下述任一种：

B1)编码所述蛋白质folD^L36Q的核酸分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

B3)核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子。

SEQ ID No.4所示的DNA分子即为本发明所述突变型folD^T107A基因。

SEQ ID No.4所示的DNA分子(folD^T107A基因)编码SEQ ID No.5所示的突变蛋白质folD^L36Q。

所述folD^T107A基因的核苷酸序列(SEQ ID No.4)中第107位腺嘌呤(A)由胸腺嘧啶(T)突变而来，所述蛋白质folD^L36Q氨基酸序列(SEQ ID No.5)中的第36位谷氨酰胺(Q)是由亮氨酸(L)突变而来。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

C1)含有所述核酸分子folD^T107A的表达盒；

C2)含有所述核酸分子folD^T107A的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有所述核酸分子folD^T107A的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；

C4)含有权利要求2所述核酸分子的重组细胞、或含有C1)所述表达盒的重组细胞、或含有C2)所述重组载体的重组细胞。

本发明还提供了D1)-D10)中任一项在构建产L-氨基酸的基因工程菌中的应用，和/或，在制备L-氨基酸中的应用，和/或，在调控微生物L-氨基酸的产量中的应用，其中所述D1)-D10)为：

D1)所述蛋白质folD^L36Q；

D2)所述核酸分子folD^T107A；

D3)所述生物材料；

D4)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

D5)编码SEQ ID No.2所示蛋白质的DNA分子；

D6)核苷酸序列或编码序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D7)含有D5)或D6)中所述DNA分子的表达盒；

D8)含有D5)或D6)中所述DNA分子的重组载体、或含有D7)所述表达盒的重组载体；

D9)含有D5)或D6)中所述DNA分子的重组微生物、或含有D7)所述表达盒的重组微生物、或含有D8)所述重组载体的重组微生物；

D10)含有D5)或D6)中所述DNA分子的重组细胞、或含有D7)所述表达盒的重组细胞、或含有D8)所述重组载体的重组细胞。

SEQ ID No.1所示的DNA分子也为本发明所述folD基因。

SEQ ID No.1所示的DNA分子(folD基因)编码SEQ ID No.2所示的蛋白质pfolD。

进一步地，本发明还提供了重组菌W3110-pET28(a)-L36Q(W3110-folD突变株2)在发酵法生产L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和/或L-缬氨酸中的应用。

本发明还提供了重组菌YPThr-folD-001、YPThr-folD-002、YPThr-folD-003、YPThr-folD-004、YPThr-folD-005和/或YPThr-folD-006在发酵法生产L-苏氨酸中的应用。

本发明还提供了重组菌YPtrp-folD-001、YPtrp-folD-002、YPtrp-folD-003、YPtrp-folD-004、YPtrp-folD-005和/或YPtrp-folD-006在发酵法生产L-色氨酸中的应用。

本发明还提供了重组菌YPR-folD-001、YPR-folD-002、YPR-folD-003、YPR-folD-004、YPR-folD-005和/或YPR-folD-006在发酵法生产L-精氨酸中的应用。

本发明还提供了重组菌YPV-folD-001、YPV-folD-002、YPV-folD-003、YPV-folD-004、YPV-folD-005和/或YPV-folD-006在发酵法生产L-缬氨酸中的应用。

本文中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所述调控微生物L-氨基酸的产量可为提高(上调)或降低(下调)微生物中L-氨基酸的积累量(即促进或抑制L-氨基酸的生物合成)。

本发明还提供了一种提高微生物L-氨基酸的产量的方法，所述方法可包括下述任一种：

E1)提高目的微生物中的所述核酸分子folD^T107A的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2)提高目的微生物中的D5)或D6)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第36位的亮氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

上述方法中，所述E1)可通过如下任一方法实现：(1)增加目的微生物中folD^T107A基因的拷贝数(如将单拷贝或多拷贝的folD^T107A基因导入目的微生物)；(2)通过表达调控序列增强folD^T107A基因的表达(如修饰folD^T107A基因的表达调控序列)。

所述E2)可通过如下任一方法实现：(1)增加目的微生物中folD基因的拷贝数(如将单拷贝或多拷贝的folD基因导入目的微生物)；(2)通过表达调控序列增强folD基因的表达(如修饰folD基因的表达调控序列)。

所述表达调控序列可为启动子、增强子或沉默子序列。

上述方法中，所述突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第36位的亮氨酸残基(L)突变为谷氨酰胺残基(Q)。

上述方法中，所述突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子中第107位的核苷酸T突变为A。

进一步地，所述突变可通过基因编辑技术或定点突变方法进行。

进一步地，所述突变可为点突变(point mutation)，即单个核苷酸的突变。

本文所述点突变可为单碱基置换、单碱基插入或单碱基缺失，具体地可为单碱基置换。所述单碱基置换可为等位基因置换。

本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为载体pET28(a)、pGRB克隆载体和/或pREDCas9质粒。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacteria sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、沙门氏菌属(Salmonellasp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)等但不限于此。

进一步地，所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes，产氨短杆菌)、钝齿棒状杆菌(Corynebacteriumcrenatum)或泛菌(Pantoea)。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌(Escherichiacoli)，具体为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌W3110、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25404、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25403、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25402和/或大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC22721。

本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞。所述细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。

本文所述重组载体可为pET28(a)-folD、重组载体pET28(a)-L36Q、重组载体pGRB-sgRNA-1和/或pGRB-sgRNA-2。

重组载体pET28(a)-folD是将带有载体pET28(a)同源臂的野生型folD基因片段(SEQ ID No.3)与载体pET28(a)通过同源重组的方法进行连接，得到的重组表达载体，重组载体pET28(a)-folD含有SEQ ID No.1所示的folD基因。

重组载体pET28(a)-L36Q是将带有载体pET28(a)同源臂的突变型folD基因片段(即SEQ ID No.3的第143位突变为A)与载体pET28(a)通过同源重组的方法进行连接，得到的重组表达载体，重组载体pET28(a)-L36Q含有SEQ ID No.4所示的folD^T107A基因。

重组载体pGRB-sgRNA-1含有folD基因编辑靶点(5’-cacaaatatagacctgaag-3’)，在导入受体菌后，转录出向导RNA与Cas9蛋白(由pREDCas9质粒表达)形成复合体，并通过碱基互补配对和PAM序列识别folD基因靶点，Cas9蛋白会使folD基因上下游的DNA双链断裂，在此基础上为受体菌引入一个修复的模板(供体DNA分子，在本发明中为SEQ ID No.11所示的DNA分子)，受体菌就会按照提供的模板，利用自身存在的DNA损伤修复应答机制，在修复过程中引入定点突变，实现folD基因的点突变，即将folD基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第107位胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)。

重组载体pGRB-sgRNA-2含有假基因yaiT编辑靶点(5’-ggcaactatgtaaactatag-3’)，在导入受体菌后，转录出向导RNA与Cas9蛋白(由pREDCas9质粒表达)形成复合体，并通过碱基互补配对和PAM序列识别yaiT基因靶点，Cas9蛋白会使yaiT基因上下游的DNA双链断裂，在此基础上为受体菌引入一个修复的模板(供体DNA分子，在本发明中为SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示的DNA分子)，受体菌就会按照提供的模板，利用自身存在的DNA损伤修复应答机制，在修复过程中引入DNA片段的插入，实现基因的替换，即将yaiT基因的部分编码区替换为folD基因或folD^T107A基因。

本文所述重组微生物是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物后得到的重组微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物。本发明所述重组微生物可为通过对目的微生物的基因进行操作和修饰得到的L-氨基酸产量提高的重组微生物。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组微生物为重组菌DH5α/pET28(a)-folD、重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPThr-folD-001、YPTrp-folD-001、YPR-folD-001、YPV-folD-001、YPThr-folD-002、YPTrp-folD-002、YPR-folD-002、YPV-folD-002、YPThr-folD-003、YPTrp-folD-003、YPR-folD-003、YPV-folD-003、YPThr-folD-005、YPTrp-folD-005、YPR-folD-005、YPV-folD-005、YPThr-folD-006、YPTrp-folD-006、YPR-folD-006和/或YPV-folD-006。

重组菌DH5α/pET28(a)-folD是将重组载体pET28(a)-folD导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。重组菌DH5α/pET28(a)-folD含有SEQ ID No.1所示的folD基因。

重组菌W3110-pET28(a)-L36Q是将重组载体pET28(a)-L36Q导入大肠杆菌W3110得到的重组菌。重组菌W3110-pET28(a)-L36Q含有SEQ ID No.4所示的folD^T107A基因。

重组菌YPThr-folD-001、YPTrp-folD-001、YPR-folD-001和YPV-folD-001均含有SEQ ID No.4所示的folD^T107A基因。

重组菌YPThr-folD-002、YPTrp-folD-002、YPR-folD-002和YPV-folD-002含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的folD基因；具体地，重组菌YPThr-folD-002、YPTrp-folD-002、YPR-folD-002和YPV-folD-002是将大肠杆菌(Escherichia coli)L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT基因的部分编码区替换为folD基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝folD基因的重组菌可以显著和稳定地提高folD基因的表达量。

重组菌YPThr-folD-003、YPTrp-folD-003、YPR-folD-003和YPV-folD-003含有SEQID No.4所示的突变的folD^T107A基因；具体地，重组菌YPThr-folD-003、YPTrp-folD-003、YPR-folD-003和YPV-folD-003是将大肠杆菌(Escherichia coli)L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT基因的部分编码区替换为突变型folD^T107A基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。导入了突变型folD^T107A基因的重组菌为在基因组上过表达folD^T107A基因的工程菌株(重组菌)。

重组菌YPThr-folD-005、YPTrp-folD-005、YPR-folD-005和YPV-folD-005含有SEQID No.1所示的folD基因，为在质粒上过表达野生型folD基因的工程菌，即由质粒pET28(a)-folD携带外源基因folD在染色体外进行过表达。

重组菌YPThr-folD-006、YPTrp-folD-006、YPR-folD-006和YPV-folD-006含有SEQID No.4所示的突变型folD^T107A基因，为在质粒上过表达突变型folD^T107A基因的工程菌，即由质粒pET28(a)-L36Q携带外源基因folD^T107A在染色体外进行过表达。

上述重组菌中，重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPThr-folD-001、YPTrp-folD-001、YPR-folD-001、YPV-folD-001、YPThr-folD-003、YPTrp-folD-003、YPR-folD-003、YPV-folD-003、YPThr-folD-006、YPTrp-folD-006、YPR-folD-006和YPV-folD-006均在本发明的保护范围内。

上述重组菌中，重组菌DH5α/pET28(a)-folD、YPThr-folD-002、YPTrp-folD-002、YPR-folD-002、YPV-folD-002、YPThr-folD-005、YPTrp-folD-005、YPR-folD-005、YPV-folD-005在制备L-氨基酸中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了一种构建所述重组微生物的方法，所述方法可包括至少下述任一种：

F1)将所述核酸分子folD^T107A导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F2)将D5)或D6)所述DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3)使目的微生物中SEQ ID No.2所示蛋白质的第36位的亮氨酸残基突变为谷氨酰胺残基，得到所述重组微生物；

F4)利用基因编辑手段对目的微生物中SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.4所示的DNA分子。

所述导入可为通过化学转化法(如Ca²⁺诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

本发明还提供了一种制备L-氨基酸的方法，所述方法可包括利用本文中任一所述的重组微生物生产L-氨基酸。

上述方法中，所述方法可为发酵法制备L-氨基酸，所述重组微生物可为重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPThr-folD-001、YPTrp-folD-001、YPR-folD-001、YPV-folD-001、YPThr-folD-002、YPTrp-folD-002、YPR-folD-002、YPV-folD-002、YPThr-folD-003、YPTrp-folD-003、YPR-folD-003、YPV-folD-003、YPThr-folD-005、YPTrp-folD-005、YPR-folD-005、YPV-folD-005、YPThr-folD-006、YPTrp-folD-006、YPR-folD-006和/或YPV-folD-006。其中，重组菌YPThr-folD-001、YPThr-folD-002、YPThr-folD-003、YPThr-folD-005和YPThr-folD-006可用于发酵法生产L-苏氨酸；重组菌YPtrp-folD-001、YPtrp-folD-002、YPtrp-folD-003、YPtrp-folD-005和YPtrp-folD-006可用于发酵法生产L-色氨酸；重组菌YPR-folD-001、YPR-folD-002、YPR-folD-003、YPR-folD-005和YPR-folD-006可用于发酵法生产L-精氨酸；重组菌YPV-folD-001、YPV-folD-002、YPV-folD-003、YPV-folD-005和YPV-folD-006可用于发酵法生产L-缬氨酸。

本文中，所述L-氨基酸可为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸和/或L-组氨酸。

本文中，所述L-氨基酸可为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和/或L-缬氨酸。

本文中，所述微生物(目的微生物)可为细菌。

进一步地，所述细菌可来自于埃希氏菌属(Escherichia sp.)。

进一步地，所述细菌可为大肠杆菌。

具体地，所述大肠杆菌可为大肠杆菌W3110、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25404、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25403、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25402或大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC22721。

本发明还提供了制备L-苏基酸的方法，所述方法可包括如下步骤：

M1)在培养基中培养重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPThr-folD-001、YPThr-folD-002、YPThr-folD-003、YPThr-folD-005和/或YPThr-folD-006；

M2)从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-苏基酸。

本发明还提供了制备L-色基酸的方法，所述方法可包括如下步骤：

N1)在培养基中培养重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPtrp-folD-001、YPtrp-folD-002、YPtrp-folD-003、YPtrp-folD-005和/或YPtrp-folD-006；

N2)从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-色基酸。

本发明还提供了制备L-精基酸的方法，所述方法可包括如下步骤：

P1)在培养基中培养重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPR-folD-001、YPR-folD-002、YPR-folD-003、YPR-folD-005和/或YPR-folD-006；

P2)从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-精基酸。

本发明还提供了制备L-缬基酸的方法，所述方法可包括如下步骤：

Q1)在培养基中培养重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、重组菌YPV-folD-001、YPV-folD-002、YPV-folD-003、YPV-folD-005和YPV-folD-006；

Q2)从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-缬基酸。

所述培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

本发明还提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括：将所述folD基因或其变体基因(如folD^T107A基因)导入能合成目的氨基酸的生物细胞中，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到目的氨基酸。

上述方法中，所述生物细胞可为能合成目的氨基酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。所述生物细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)或泛菌(Pantoea)。

利用本发明所述folD基因或其变体(如folD^T107A基因)构建的重组微生物或重组细胞可用于生产多种产物，包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、α酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和/或瓜氨酸。

本发明首先利用通过易错PCR扩增得到的包含随机点突变的folD基因片段构建了随机突变质粒，进一步转化大肠杆菌W3110获得具有不同突变的folD基因突变型W3110菌株，对获得的突变菌株发酵培养后采用HPLC分析L-氨基酸的浓度(含量)，筛选出一支W3110-folD突变株2，其产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力比野生型W3110菌株和其他突变菌株更优越。对W3110-folD突变株2中的folD基因进行测序结果表明：folD基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第107位胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)，相应地，其编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID No.2)中的第36位亮氨酸(L)突变为谷氨酰胺(Q)(突变后的基因命名为folD^T107A基因)。随后通过构建SEQ ID No.2第36位氨基酸(L)用不同氨基酸取代的突变体进一步验证了本发明W3110-folD突变株2的优异效果，表明folD基因编码的蛋白质pfolD氨基酸序列(SEQ ID No.2)中第36位氨基酸(L)突变为谷氨酰胺(Q)可以显著提高L-氨基酸的产量。为了更深入研究folD基因及folD^T107A基因对生产菌L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响，本发明分别构建了：1、在四种生产菌的folD基因编码区第107位引入点突变(T-A)的folD基因突变型工程菌株；2、基因组上过表达folD基因或folD^T107A基因的工程菌株；3、基因组上缺失folD基因的工程菌株；4、质粒上过表达folD基因或folD^T107A基因的工程菌株。将构建的工程菌株进行发酵实验，结果表明，folD基因及其变体folD^T107A基因参与了L-氨基酸的生物合成，通过对folD基因进行过表达或敲除、或定点突变可以调控L-氨基酸在微生物内的积累量。对folD基因编码区进行点突变(T-A)或在生产菌中过表达folD基因或folD^T107A基因，有助于L-氨基酸产量及转化率的提高，而对folD基因进行敲除或弱化，不利于L-氨基酸的积累。可利用folD基因及其变体(如folD^T107A基因)来构建生产L-氨基酸的基因工程菌种，以促进L-氨基酸产量提高。

保藏说明

1、菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

菌株编号：YP0158

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年7月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25404

2、菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

菌株编号：YP006D

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年7月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25403

3.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

菌株编号：YP004-8

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年7月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25402

4.菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

菌株编号：YP045

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年6月15日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22721

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大肠杆菌W3110为美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)的菌株，保藏编号为：ATCC27325。

下述实施例中的KAPA HiFi HotStart为高保真热启动DNA聚合酶(KAPABIOSYSTEMS公司产品)。

下述实施例中的pGRB克隆载体和pREDCas9质粒为addgene公司产品。

下述实施例中的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404为大肠杆菌(Escherichia coli)YP0158CGMCC No.25404，也称为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25404。

下述实施例中的L-色氨酸生产菌CGMCC25403为大肠杆菌(Escherichia coli)YP006DCGMCC No.25403，也称为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25403。

下述实施例中的L-精氨酸生产菌CGMCC25402为大肠杆菌(Escherichia coli)YP004-8CGMCC No.25402，也称为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25402。

下述实施例中的L-缬氨酸生产菌CGMCC22721为大肠杆菌(Escherichia coli)YP045CGMCC No.22721，也称为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC22721。

实施例1、构建双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶folD基因突变型W3110菌株

一、具有双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性的folD基因突变型表达质粒的构建

为了研究方便，首先将野生型folD基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)克隆到表达载体pET28(a)中。以NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列为模板，以pET28-PF和pET28-PR为引物进行PCR扩增，获得的扩增产物为带有载体pET28(a)同源臂的野生型folD基因片段(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)。扩增产物回收后与经EcoR I/Hind III酶切回收的线性化表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养，获得含folD基因及其启动子的pET28(a)转化子(转化后在含有卡那霉素的平板上长出的菌落即为转化子)。对培养长出的单克隆菌落用引物T7F、引物T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1147bp片段的菌落为阳性克隆，即含有folD基因(SEQ ID No.1)的阳性转化子(重组菌)DH5α/pET28(a)-folD，提取质粒后命名为pET28(a)-folD。

质粒pET28(a)-folD(重组载体pET28(a)-folD)是将带有载体pET28(a)同源臂的野生型folD基因片段(SEQ ID No.3)与载体pET28(a)通过同源重组的方法进行连接，得到的重组表达载体，重组载体pET28(a)-folD含有SEQ ID No.1所示的folD基因。

为了获得编码双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶的基因folD的突变体，使用随机诱变试剂盒(Agilent Technologies，USA)制备了folD突变型基因质粒。具体方法如下：

以质粒pET28(a)-folD为模板，以pET28-PF和pET28-PR为引物，使用随机诱变试剂盒进行易错PCR扩增，获得的扩增产物为包含随机点突变的folD基因片段939bp，命名为DNA片段1(DNA片段1是在SEQ ID No.3所示的DNA分子中的folD基因编码区发生了随机点突变)。

PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

回收的DNA片段1与经EcoR I/Hind III酶切回收的线性化表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养，获得含rmfolD基因的转化子。rmfolD基因是编码区(SEQ ID No.1)存在随机点突变的folD基因。对培养长出的单克隆菌落用引物T7F、引物T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1147bp片段的菌落为阳性克隆，即含有rmfolD基因的阳性转化子DH5α/pET28(a)-rmfolD，提取质粒后命名为pET28(a)-rmfolD。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O至总体积25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

引物序列如下所示(上海invitrogen公司合成)：

引物pET28-PF：

5'-ACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGCAGCAAAGATTATTGAC-3'(带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列)，

引物pET28-PR：

5'-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTACTCATCCTGTGGATCATG-3'(带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列)。

引物T7F：5'-CAGCAGCCATCATCATCATC-3'，

引物T7R：5'-ATCCGGATATAGTTCCTCC-3'。

二、具有双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性的folD基因突变型菌株的构建

为了鉴定步骤一中构建的突变载体的L-氨基酸生产性能，将步骤一中构建的folD随机突变质粒(pET28(a)-rmfolD)转化到大肠杆菌W3110菌株中(转化和鉴定同步骤一)，得到阳性转化子W3110/pET28(a)-rmfolD，将阳性转化子W3110/pET28(a)-rmfolD在含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有丰富培养基30mL的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶过表达。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析L-氨基酸的浓度(含量)，如表1所示。挑选具有比W3110对照的各L-氨基酸生产能力优越的菌株，即为W3110-folD突变株，W3110-folD突变株是将不同的folD随机突变质粒(pET28(a)-rmfolD)转化到大肠杆菌W3110菌株获得的突变株总称。

丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖30g/L，(NH4)₂SO₄ 2g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，甜菜碱0.5g/L，柠檬酸2g/L，VH 20mg/L，VB₁1.5mg/L，VB₃ 1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，氢氧化钠调节pH 7.0。

表1 W3110-folD突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

如表1中所示，本发明的大肠杆菌W3110-folD突变株具有产部分L-氨基酸的能力，其中W3110-folD突变株2产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力更优越。表明W3110-folD突变株2具有合成L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的活性。

进一步从W3110-folD突变株2提取质粒对folD基因进行测序，结果表明，W3110-folD突变株2中含有folD基因突变体，该folD基因突变体是编码区(SEQ ID No.1)存在点突变的folD基因。所述点突变为将folD基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第107位胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.4所示的DNA分子，命名为folD^T107A基因。相应地，SEQ ID No.4所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的突变蛋白质，该突变蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID No.5)中的第36位谷氨酰胺(Q)由亮氨酸(L)突变而来，命名为蛋白质folD^L36Q。

从W3110-folD突变株2提取的质粒为在folD随机突变质粒(pET28(a)-rmfolD)中产生点突变(T-A)的突变质粒，命名为重组载体pET28(a)-L36Q。

重组载体pET28(a)-L36Q是将带有载体pET28(a)同源臂的突变型folD基因片段(即SEQ ID No.3的第143位突变为A，其它核苷酸序列不变)与载体pET28(a)通过同源重组的方法进行连接，得到的重组表达载体，重组载体pET28(a)-L36Q含有SEQ ID No.4所示的folD^T107A基因。

W3110-folD突变株2是将重组载体pET28(a)-L36Q导入大肠杆菌W3110得到的重组菌W3110-pET28(a)-L36Q。W3110-folD突变株2(即重组菌W3110-pET28(a)-L36Q)含有SEQID No.4所示的folD^T107A基因。

野生型folD基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，其编码蛋白质(名称为pfolD)的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

突变型folD^T107A基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4，其编码突变蛋白质(名称为folD^L36Q)的氨基酸序列为SEQ ID No.5。突变型folD^T107A基因的核苷酸序列(SEQ ID No.4)中第107位腺嘌呤(A)由胸腺嘧啶(T)突变而来。突变蛋白质folD^L36Q的氨基酸序列(SEQ IDNo.5)中的第36位谷氨酰胺(Q)由亮氨酸(L)突变而来。

三、具有双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性的folD突变体质粒的构建

步骤一和二以随机突变的方式利用野生型大肠杆菌W3110获得了W3110-folD突变株2。为了获得更多folD突变株以提高其L-氨基酸的生产能力，构建以上述folD突变位置(SEQ ID No.2的第36位)的氨基酸(L)用不同氨基酸取代的突变体。具体地，以步骤二中测序的质粒(pET28(a)-L36Q)为模板，构建了其中在野生型folD基因第36位氨基酸用不同氨基酸取代的5种突变体。突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如表2。

表2 folD突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P-PR：5'-CAGCACAACGGCCGGTCCTGGTGCCCGCAGTCCGGCTGCA-3'，

P-PF：5'-TGCAGCCGGACTGCGGGCACCAGGACCGGCCGTTGTGCTG-3'，

R-PR：5'-CAGCACAACGGCCCGTCCTGGTGCCCGCAGTCCGGCTGCA-3'，

R-PF：5'-TGCAGCCGGACTGCGGGCACCAGGACGGGCCGTTGTGCTG-3'，

S-PR：5'-CAGCACAACGGCCGATCCTGGTGCCCGCAGTCCGGCTGCA-3'，

S-PF：5'-TGCAGCCGGACTGCGGGCACCAGGATCGGCCGTTGTGCTG-3'，

W-PR：5'-CAGCACAACGGCCCATCCTGGTGCCCGCAGTCCGGCTGCA-3'，

W-PF：5'-TGCAGCCGGACTGCGGGCACCAGGATGGGCCGTTGTGCTG-3'，

F-PR：5'-CAGCACAACGGCGAATCCTGGTGCCCGCAGTCCGGCTGCA-3'，

F-PF：5'-TGCAGCCGGACTGCGGGCACCAGGATTCGCCGTTGTGCTG-3'，

以步骤二中测序的质粒pET28(a)-L36Q为模板，分别以表2中的引物和KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有folD突变碱基的Up DNA片段156bp和Down DNA片段797bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收UpDNA片段和Down DNA片段。回收后的两条DNA片段与经EcoR I/Hind III酶切回收的线性化表达载体pET28(a)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆菌落用引物T7F、引物T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1147bp片段的菌落为阳性克隆，即含有folD突变基因的阳性转化子，提取质粒后分别命名为：重组载体pET28(a)-L36P、pET28(a)-L36R、pET28(a)-L36S、pET28(a)-L36W和pET28(a)-L36F，即表2中的folD突变载体。

重组载体pET28(a)-L36P含有SEQ ID No.6所示的folD^T107C基因；重组载体pET28(a)-L36R含有SEQ ID No.7所示的folD^T107G基因；重组载体pET28(a)-L36S含有SEQ ID No.8所示的folD^CT106-107TC基因；重组载体pET28(a)-L36W含有SEQ ID No.9所示的folD^CT106-107TG基因；重组载体pET28(a)-L36F含有SEQ ID No.10所示的folD^C106T/G108C基因。

突变型folD^T107C基因的核苷酸序列(SEQ ID No.6)中第107位胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)突变而来。folD^T107C基因编码的突变蛋白质(名称为folD^L36P)的氨基酸序列是在SEQID No.2的基础上，将第36位亮氨酸(L)突变成脯氨酸(P)。

突变型folD^T107G基因的核苷酸序列(SEQ ID No.7)中第107位鸟嘌呤(G)由胸腺嘧啶(T)突变而来。folD^T107G基因编码的突变蛋白质(名称为folD^L36R)的氨基酸序列是在SEQID No.2的基础上，将第36位亮氨酸(L)突变成精氨酸(R)。

突变型folD^CT106-107TC基因的核苷酸序列(SEQ ID No.8)中第106-107位胸腺嘧啶胞嘧啶(TC)由胞嘧啶胸腺嘧啶(CT)突变而来。folD^CT106-107TC基因编码的突变蛋白质(名称为folD^L36S)的氨基酸序列是在SEQ ID No.2的基础上，将第36位亮氨酸(L)突变成丝氨酸(S)。

突变型folD^CT106-107TG基因的核苷酸序列(SEQ ID No.9)中第106-107位胸腺嘧啶鸟嘌呤(TG)由胞嘧啶胸腺嘧啶(CT)突变而来。folD^CT106-107TG基因编码的突变蛋白质(名称为folD^L36W)的氨基酸序列是在SEQ ID No.2的基础上，将第36位亮氨酸(L)突变成色氨酸(W)。

突变型folD^C106T/G108C基因的核苷酸序列(SEQ ID No.10)中第106位的胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)突变而来，第108位的胞嘧啶(C)由鸟嘌呤(G)突变而来。folD^C106T/G108C基因编码的突变蛋白质(名称为folD^L36F)的氨基酸序列是在SEQ ID No.2的基础上，将第36位亮氨酸(L)突变成苯丙氨酸(F)。

PCR鉴定的扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

PCR鉴定的扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

四、具有双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性的folD基因突变体菌株的构建

为了鉴定步骤三中构建的突变载体对L-氨基酸的生产性能，将步骤三中构建的质粒(pET28(a)-L36P、pET28(a)-L36R、pET28(a)-L36S、pET28(a)-L36W和pET28(a)-L36F)分别转化到大肠杆菌W3110菌株中(转化和鉴定同步骤一)，得到阳性转化子即为W3110-folD突变株W3110-pET28(a)-L36P、W3110-pET28(a)-L36R、W3110-pET28(a)-L36S、W3110-pET28(a)-L36W和W3110-pET28(a)-L36F，将阳性转化子分别在含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30mL丰富培养基的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至OD₆₀₀＝0.2时加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶过表达。

发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析L-氨基酸的浓度(含量)，如表3所示。突变株W3110-pET28(a)-L36Q产L-苏氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-L36P、W3110-pET28(a)-L36R、W3110-pET28(a)-L36S、W3110-pET28(a)-L36W和W3110-pET28(a)-L36F更强。

表3 W3110-folD突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果

实施例2、构建双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶folD基因突变型工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对L-氨基酸高产菌株folD基因进行点突变，以此在高产菌株中更深入研究folD基因及突变型folD^T107A基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

在folD基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将folD基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第107位胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.4所示的DNA分子(名称为folD^T107A基因)。相应地，SEQ ID No.4所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的突变蛋白质folD^L36Q，该突变蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID No.5)中的第36位谷氨酰胺(Q)由亮氨酸(L)突变而来，命名为蛋白质folD^L36Q。

一、sgRNA质粒的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增含有sgRNA靶序列的DNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-1F 10μL，sgRNA-1R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段(含有sgRNA靶序列的DNA片段)，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

pGRB质粒用Spe I酶切得到线性化pGRB质粒后进行去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10×Buffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10×Buffer5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP(小牛肠碱性磷酸酶)2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性化pGRB质粒。

将含有sgRNA靶序列的DNA片段与线性化pGRB质粒利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行同源重组连接。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化pGRB质粒2μL，含有sgRNA靶序列的DNA片段0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的sgRNA质粒命名为pGRB-sgRNA-1。

本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的碱基为sgRNA靶序列：

引物sgRNA-1F：

5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTcacaaatatagacctgaagGTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'；

引物sgRNA-1R：

5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcttcaggtctatatttgtgCTAGTATTATAC CTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'；

引物sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'；

引物sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、突变型folD^T107A基因片段的扩增

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，分别以引物P1/P2，P3/P4和KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基大小分别为860bp和740bp的folD^T107ADNA片段(folD^T107A Up和folD^T107A Down)。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收folD^T107A Up和folD^T107A Down。以回收后的两条DNA片段为模板，以引物P1/P4进行overlap PCR扩增，获得点突变整合同源臂DNA片段(即突变型folD^T107A基因片段)Up-folD^T107A-Down(SEQ ID No.11)1560bp。SEQ ID No.11所示的DNA片段中，第737-1560位为含有点突变的folD^T107A基因片段(对应SEQ ID No.4的第1-824位)。

DNA片段Up-folD^T107A-Down(SEQ ID No.11)含有突变位点，用于在受体菌folD基因编码区(SEQ ID No.1)的第107位引入核酸改造，具体为将SEQ ID No.1的第107位的胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白pfolD(SEQ ID No.2)的第36位亮氨酸(L)突变为谷氨酰胺(Q)。

上述PCR扩增和overlap PCR扩增体系：5×HiFi with Mg²⁺Buffer 10μL，dNTPMixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH₂O至总体积50μL。

上述PCR扩增和overlap PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，小写加粗字体的碱基为突变位置：

P1：

P2：

P3：

P4：5'-GTGTTTTCAATCAGCGTGGC-3'。

三、感受态细胞的制备及转化

pREDCas9质粒(含有壮观霉素抗性基因)分别转化到L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素(100mg/L)的单菌落用引物pRedCas9-PF、引物pRedCas9-PR和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，获得943bp的菌落为含有pREDCas9质粒的阳性转化子(即重组菌L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、重组菌L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、重组菌L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和重组菌L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9)。

制备重组菌L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备得到4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞。

将本实施例步骤一制备的含有靶序列的sgRNA质粒(pGRB-sgRNA-1)和步骤二制备的点突变重组DNA片段(Up-folD^T107A-Down，SEQ ID No.11)分别转化至上述4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养得到转化子。用引物P5、引物P6和r Taq聚合酶对转化子进行PCR鉴定，将得到的420bp PCR产物通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以Up-folD^T107A-Down扩增PCR片段为阳性对照，W3110扩增PCR片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此PCR片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株(即阳性重组子)。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P5：5'-CAGCGACGGTGCGCCTCACC-3'，

P6：5'-ATGCCATCGATGGTGTTGTC-3'，

pRedCas9-PF：5'-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3'，

pRedCas9-PR：5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'。

PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH₂O总体积25μL。

SSCP电泳PAGE的制备及电泳条件：40％丙烯酰胺8mL、甘油4mL、10×TBE 2mL、TEMED 40μL、10％APS 600μL、ddH₂O 26mL；将电泳槽置入冰中，电压120V在1×TBE缓冲液中电泳10h。

将点突变成功的转化子(阳性重组子)分别接种于含壮观霉素(100mg/L)的2-YT培养基和含有终浓度为0.2％的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-1，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上生长而在含氨苄霉素(100mg/L)培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-1的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上不生长而在无抗的2-YT培养基上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。

对消除质粒后的阳性重组子再次通过引物P5/P6 PCR扩增含有点突变的序列并进行测序鉴定，测序结果与大肠杆菌W3110基因组序列进行比对，确定folD基因第107位碱基T突变为碱基A的为基因突变型folD^T107A阳性转化子。将基因突变型folD^T107A的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为重组菌YPThr-folD-001、重组菌YPTrp-folD-001、重组菌YPR-folD-001和重组菌YPV-folD-001。

本实施例中的sgRNA质粒(即重组载体pGRB-sgRNA-1)含有folD基因编辑靶点(5’-cacaaatatagacctgaag-3’)，在导入受体菌后，转录出向导RNA与Cas9蛋白(由pREDCas9质粒表达)形成复合体，并通过碱基互补配对和PAM序列识别folD基因靶点，Cas9蛋白会使folD基因上下游的DNA双链断裂，在此基础上为受体菌引入一个修复的模板(供体DNA分子，在本发明中为SEQ ID No.11所示的DNA分子)，受体菌就会按照提供的模板，利用自身存在的DNA损伤修复应答机制，在修复过程中引入定点突变，实现folD基因的点突变，即将folD基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第107位胸腺嘧啶(T)突变为腺嘌呤(A)。

实施例3、构建基因组上过表达双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶folD基因或folD^T107A基因的工程菌株

为进一步研究验证在生产菌中过表达folD基因或folD^T107A基因对L-氨基酸产量的影响，本实施例以大肠杆菌W3110基因组上假基因yaiT为外源基因的整合位点(该位点的整合不改变大肠杆菌的生物学性能)构建了基因组上过表达folD基因或folD^T107A基因的工程菌株(重组菌)。

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的yaiT基因编码区内(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的yaiT基因和folD基因)分别整合野生型folD基因和突变型folD^T107A基因，以此在高产菌株中更深入研究folD基因及突变型folD^T107A基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸合成量的影响。

一、sgRNA质粒的构建

扩增含有sgRNA靶序列的DNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-2F 10μL，sgRNA-2R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段(含有sgRNA靶序列的DNA片段)，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

pGRB质粒用Spe I酶切得到线性化pGRB质粒后进行去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10×Buffer 5μL，SpeⅠ2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10×Buffer5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性化pGRB质粒。

将含有sgRNA靶序列的DNA片段与线性化pGRB质粒利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行同源重组连接。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化pGRB质粒2μL，含有sgRNA靶序列的DNA片段0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的sgRNA质粒命名为pGRB-sgRNA-2。

引物sgRNA-2F：

5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTggcaactatgtaaactatagGTTTTAGAGCT AGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'，

引物sgRNA-2R：

5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctatagtttacatagttgccACTAGTATTAT ACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'，

引物sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

引物sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、PCR扩增基因组过表达的DNA序列

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及folD或folD^T107A基因编码区及启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式在L-氨基酸生产菌yaiT基因编码区内分别引入folD基因或folD^T107A基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7：5'-AAGAGAATGGAAGAGAGGCC-3'，

P8：5'-TATAAAAAGAATTTTCAGCCCCCAATCAAGTGCTGTAACG-3'，

P9：5'-CGTTACAGCACTTGATTGGGGGCTGAAAATTCTTTTTATA-3'，

P10：5'-ACCGTCAATAATCTTTGCTGCCATCAGAGAGAGGATTCCA-3'，

P11：5'-TGGAATCCTCTCTCTGATGGCAGCAAAGATTATTGACGGT-3'，

P12：5'-CGGTAGTGTAGGTTTCGTTGTTACTCATCCTGTGGATCATG-3'，

P13：5'-CATGATCCACAGGATGAGTAACAACGAAACCTACACTACCG-3'，

P14：5'-CGACCTGTAGTATCCCATTC-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，分别以引物P7/P8和P13/P14与KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得上游同源臂片段590bp(SEQ ID No.12的第1-590位)和下游同源臂片段606bp(SEQ ID No.12的第1673-2278位)；以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P9/P10和KAPA HiFi HotStart PCR扩增folD基因启动子片段300bp(SEQ ID No.12的第551-850位)；分别以大肠杆菌W3110基因组DNA和实施例1中构建的质粒pET28(a)-L36Q为模板，以引物P11/P12和KAPA HiFi HotStart分别PCR扩增folD基因(扩增产物序列为SEQID No.12的第811-1713位)和folD^T107A基因(扩增产物序列为SEQ ID No.13的第811-1713位)903bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以P7和P14为引物进行overlap PCR扩增，分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-folD-Down(SEQ ID No.12)和Up-folD^T107A-Down(SEQ ID No.13)2278bp。

三、感受态细胞的制备及转化

制备含有pREDCas9质粒的重组菌L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备得到4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞。

将本实施例步骤一制备的含有靶序列的sgRNA质粒(pGRB-sgRNA-2)和步骤二制备的基因组过表达的DNA重组片段Up-folD-Down(SEQ ID No.12)分别转化至上述4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞中，以及将pGRB-sgRNA-2和Up-folD^T107A-Down(SEQ ID No.13)分别转化至上述4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P15、引物P16和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1312bp片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将阳性转化子分别接种于含壮观霉素(100mg/L)的2-YT培养基和含有终浓度为0.2％的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上生长而在含氨苄霉素(100mg/L)培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-2的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上不生长而在无抗的2-YT培养基上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。

对消除质粒后的重组菌通过引物P17/P18和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1749bp片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将上述构建的基因组上过表达folD基因的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr-folD-002(不含突变点)、YPTrp-folD-002(不含突变点)、YPR-folD-002(不含突变点)和YPV-folD-002(不含突变点)；

将上述构建的基因组上过表达folD^T107A基因的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr-folD-003(含突变点)、YPTrp-folD-003(含突变点)、YPR-folD-003(含突变点)和YPV-folD-003(含突变点)。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P15：5'-GGGCGTTGGATTAAGTCTGT-3'，

P16：5'-GGATGGAAACCGTCCACGTC-3'，

P17：5'-GTCGCTTCACGCGATAAATC-3'，

P18：5'-CCCACCCAGTAGATTCGGTC-3'。

本实施例中的sgRNA质粒(重组载体pGRB-sgRNA-2)含有假基因yaiT编辑靶点(5’-ggcaactatgtaaactatag-3’)，在导入受体菌后，转录出向导RNA与Cas9蛋白(由pREDCas9质粒表达)形成复合体，并通过碱基互补配对和PAM序列识别yaiT基因靶点，Cas9蛋白会使yaiT基因上下游的DNA双链断裂，在此基础上为受体菌引入一个修复的模板(供体DNA分子，在本发明中为SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示的DNA分子)，受体菌就会按照提供的模板，利用自身存在的DNA损伤修复应答机制，在修复过程中引入DNA片段的插入，实现基因的替换，即将yaiT基因的部分编码区替换为folD基因或folD^T107A基因。

实施例4、构建基因组上缺失双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶folD基因的工程菌株

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的folD基因)folD基因，以此在高产菌株中更深入研究大肠杆菌folD基因对合成L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸的影响。

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。

扩增含有sgRNA靶序列的DNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-3F 10μL，sgRNA-3R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段(含有sgRNA靶序列的DNA片段)，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

pGRB质粒用Spe I酶切得到线性化pGRB质粒后进行去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10×Buffer 5μL，Spe I 2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH₂O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10×Buffer5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH₂O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性化pGRB质粒。

将含有sgRNA靶序列的DNA片段与线性化pGRB质粒利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行同源重组连接。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化pGRB质粒2μL，含有sgRNA靶序列的DNA片段0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的sgRNA质粒命名为pGRB-sgRNA-3。

引物sgRNA-3F：

5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTtattcatccggacaaagacgGTTTTAGAGCT AGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'，

引物sgRNA-3R：

5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcgtctttgtccggatgaataACTAGTATTAT ACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'’，

引物sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

引物sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'。

二、PCR扩增基因组上缺失的DNA重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成两对扩增上下游同源臂序列的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式敲除L-氨基酸生产菌中folD基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19：5'-GAAGATGGCCCGCAAGGGAC-3'，

P20：5'-CAGATGGAATCCTCTCTCTGCATGGCGACATTTTCTTTAG-3'，

P21：5'-CTAAAGAAAATGTCGCCATGCAGAGAGAGGATTCCATCTG-3'，

P22：5'-GCGGATGTATTATCAAGTATTTC-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22与KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得大小分别为937bp和876bp的上游同源臂和下游同源臂片段；PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以P19/P22为引物进行overlap PCR扩增，获得基因组上缺失folD基因的重组DNA片段ΔfolD-Up-Dwon(SEQ ID No.14)1773bp。

三、感受态细胞的制备及转化

制备含有pREDCas9质粒的L-苏氨酸CGMCC25404-Cas9、L-色氨酸CGMCC25403-Cas9、L-精氨酸CGMCC25402-Cas9和L-缬氨酸CGMCC22721-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD₆₀₀＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备得到4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞。

将本实施例步骤一制备的含有靶序列的sgRNA质粒(pGRB-sgRNA-3)和步骤二制备的基因组上缺失folD基因的重组DNA片段ΔfolD-Up-Dwon(SEQ ID No.14)分别转化至上述4种含有pREDCas9质粒的感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P19、引物P22和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1773bp(SEQ ID No.14)片段的为阳性转化子，扩增出含有大小2640bp片段的为原菌。

将阳性转化子分别接种于含壮观霉素(100mg/L)的2-YT培养基和含有终浓度为0.2％阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上生长而在含氨苄霉素(100mg/L)培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-3的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素(100mg/L)培养基上不生长而在无抗的2-YT培养基上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。

对消除质粒后的重组菌再次通过引物P19/P22和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1773bp(SEQ ID No.14)的为阳性转化子。

将上述构建的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上缺失folD基因的阳性转化子分别命名为YPThr-folD-004、YPTrp-folD-004、YPR-folD-004和YPV-folD-004。

实施例5、构建质粒上过表达双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶folD基因或folD^T107A基因的工程菌株

本实施例将携带外源基因的质粒在染色体外表达构建了质粒上过表达folD基因或folD^T107A基因的工程菌株(重组菌)。

依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用大肠杆菌表达载体pET28(a)(购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性)分别将野生型folD基因和突变型folD^T107A基因编码区及启动子区导入L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC 22721(经测序确认这些氨基酸生产菌株染色体上保留有野生型的folD基因)，从而在高产菌株中更深入研究多拷贝folD基因及突变型folD^T107A基因对L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-精氨酸等L-氨基酸产量的影响。

制备L-苏氨酸CGMCC25404、L-色氨酸CGMCC25403、L-精氨酸CGMCC25402和L-缬氨酸CGMCC22721感受态细胞。当OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体制备得到4种感受态细胞。

分别将实施例1步骤一中构建的质粒pET28(a)-folD和实施例1步骤二中构建的质粒pET28(a)-L36Q转化至上述4种感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养产生的单菌落通过引物T7F/T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1147bp片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。

将上述构建的质粒上过表达folD基因的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr-folD-005(不含突变点)、YPTrp-folD-005(不含突变点)、YPR-folD-005(不含突变点)和YPV-folD-005(不含突变点)；

将上述构建的质粒上过表达folD^T107A基因的L-苏氨酸生产菌CGMCC25404、L-色氨酸生产菌CGMCC25403、L-精氨酸生产菌CGMCC25402和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721分别命名为YPThr-folD-006(含突变点)、YPTrp-folD-006(含突变点)、YPR-folD-006(含突变点)和YPV-folD-006(含突变点)。

实施例6、L-氨基酸发酵实验

一、L-苏氨酸发酵实验

将大肠杆菌(Escherichia coli)W3110菌株、重组菌W3110-pET28(a)-L36Q(即实施例1步骤二中通过随机突变筛选出来的W3110-folD突变株2)、大肠杆菌(Escherichiacoli)CGMCC25404菌株以及重组菌YPThr-folD-001、YPThr-folD-002、YPThr-folD-003、YPThr-folD-004、YPThr-folD-005和YPThr-folD-006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-苏氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPThr-folD-005和YPThr-folD-006为质粒上过表达的工程菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-苏氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表4所示。

L-苏氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/L，(NH4)₂SO₄ 1g/L，H₃PO₄0.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，通氨调节pH7.0。

L-苏氨酸发酵培养条件：

校正DO 100％：温度37℃、风量5L/min、转速800rpm、罐压0Mpa，5min后标定；

接种量10％；

初始条件：pH 7.0、培养温度37℃、罐压0Mpa、风量0.5L/min、转速400rpm；

全程控制：1、溶氧＜30％时，依次提转速500rpm→600rpm→风量1L/min→700rpm→800rpm；2、发酵8h提罐压0.01Mpa；12h提罐压0.02Mpa→0.03Mpa→0.04Mpa→0.05Mpa；

残糖控制：F12h前0.1％-0.5％；F12h后结合DO要求控制残糖0.1％-0.3％；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：30h左右，控制过程以溶氧20％-30％做提降风量标准。

表4 folD基因工程菌株的L-苏基酸产量

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-苏氨酸的菌株还是模式菌株W3110，folD基因的氨基酸序列第36位亮氨酸被谷氨酰胺取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高；对于高产L-苏氨酸的菌株，野生型folD基因和突变型folD^T107A基因的过表达都有助于L-苏氨酸产量的提高，而敲除folD基因不利于L-苏氨酸产量的提高。

二、L-色氨酸发酵实验

将大肠杆菌(Escherichia coli)W3110菌株、重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25403菌株以及重组菌YPtrp-folD-001、YPtrp-folD-002、YPtrp-folD-003、YPtrp-folD-004、YPtrp-folD-005和YPtrp-folD-006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-色氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPtrp-folD-005和YPtrp-folD-006为质粒上过表达的工程菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-色氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表5所示。

L-色氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖7g/L，FM902酵母粉1g/L，(NH4)₂SO₄ 1.2g/L，柠檬酸1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 5.5g/L，消泡剂0.2mL/L，通氨调pH7.0。

L-色氨酸培养条件：

校正DO 100％：温度35℃，转速800rpm，风量5L/min，罐压0.00Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH 7.0，风量1.0L/min，转速350rpm；

全程控制：底糖耗完前溶氧≤20％时，依次提转速→400rpm→450rpm；底糖耗完，补糖控制溶氧15％-30％；pH值在F24 h前为7.0、在F24 h后为6.7；

流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：34h左右，控制过程以溶氧15％-30％做提降风量标准。

表5 folD基因工程菌株的L-色氨酸产量

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-色氨酸的菌株还是模式菌株W3110，folD基因的氨基酸序列第36位亮氨酸被谷氨酰胺取代后，都有助于L-色氨酸产量的提高；对于高产L-色氨酸菌株，野生型folD基因和突变型folD^T107A基因的过表达都有助于L-色氨酸产量的提高，而敲除folD基因不利于L-色氨酸产量的提高。

三、L-精氨酸发酵实验

将大肠杆菌(Escherichia coli)W3110菌株、重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC25402菌株以及重组菌YPR-folD-001、YPR-folD-002、YPR-folD-003、YPR-folD-004、YPR-folD-005和YPR-folD-006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPR-folD-005和YPR-folD-006为质粒上过表达的工程菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-精氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表6所示。

L-精氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖8g/L，FM902酵母粉3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，甜菜碱0.5g/L，VB₁₂ 0.005g/L，消泡剂0.3mL/L，硫酸铵3g/L，pH 7.2。

L-精氨酸发酵培养条件：校正DO 100％：温度35℃，pH 7.2，转速100rpm，风量6L/min，罐压0.00Mpa；

接种量10％；

初始条件：温度35℃，pH 7.2，罐压0.01mpa、风量1.5L/min，转速350rpm；

全程控制：控制DO在20％-30％；溶氧≤25％时，每次提转速300rpm→400rpm→2.0L/min→500rpm→0.02Mpa→600rpm→3.0L/min→0.03Mpa→700rpm→3.5L/min→0.04Mpa→800rpm→900rpm→4.0L/min→0.05Mpa→1000rpm；

残糖控制：全程控制残糖0.05％-0.1％；

流加物料：25％氨水、80％浓糖、10％泡敌；

发酵周期：50h左右，控制过程以溶氧20％-30％做提降风量标准。

表6 folD基因工程菌株的L-精氨酸产量

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-精氨酸菌株还是模式菌株W3110，folD基因的氨基酸序列第36位亮氨酸被谷氨酰胺取代后，都有助于L-精氨酸产量的提高；对于高产L-精氨酸菌株，野生型folD基因和突变型folD^T107A基因的过表达都有助于L-精氨酸产量的提高，而敲除folD基因不利于L-精氨酸产量的提高。

四、L-缬氨酸发酵实验

将大肠杆菌(Escherichia coli)W3110菌株、重组菌W3110-pET28(a)-L36Q、大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC22721菌株以及重组菌YPV-folD-001、YPV-folD-002、YPV-folD-003、YPV-folD-004、YPV-folD-005和YPV-folD-006分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-精氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。其中YPV-folD-005和YPV-folD-006为质粒上过表达的工程菌株，发酵过程中需要IPTG诱导，具体诱导方法见实施例1。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-缬氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表7所示。

L-缬氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为酵母浸粉4g/L，玉米浆干粉2g/L，蛋白胨4g/L，蛋氨酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CoCl₂ 20mg/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，柠檬酸2g/L，FeSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·7H₂O 30mg/L，VH 20mg/L，VB₁ 1.5mg/L，VB₃ 1.5mg/L VB₁₂ 1.5g/L，消泡剂0.3mL/L，(NH4)₂SO₄ 3g/L，pH值7.0。

L-缬氨酸发酵培养条件：溶氧电极标定方法：在饱和亚硫酸钠溶液中标定零点，空气中标定百点；

L-缬氨酸发酵包含两阶段好氧-限氧发酵，细胞首先被培养在有氧发酵下，前期调整风量转速和补糖速率控制溶氧在25％左右，待OD₆₀₀值至50-60时，转速降至400rpm，风量降至2L/min；并将好氧发酵转为限氧发酵。

表7 folD基因工程菌株的L-缬氨酸产量

由以上发酵结果所示，无论对于高产L-缬氨酸菌株还是模式菌株W3110，folD基因的氨基酸序列第36位亮氨酸被谷氨酰胺取代后，都有助于L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-缬氨酸菌株，野生型folD基因和突变型folD^T107A基因的过表达都有助于L-缬氨酸产量的提高，而敲除folD基因不利于L-缬氨酸产量的提高。

综上，由以上发酵结果可见，无论对于高产L-氨基酸菌株还是模式菌株W3110，folD基因的氨基酸序列第36位亮氨酸被谷氨酰胺取代后，都有助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高；对于高产L-氨基酸菌株，野生型folD基因和突变型folD^T107A基因的过表达都助于L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸产量的提高，而敲除folD基因不利于其产量的提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

B3)核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；

C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；

4.D1)-D10)中任一项在构建产L-氨基酸的基因工程菌中的应用，和/或，在制备L-氨基酸中的应用，和/或，在调控微生物L-氨基酸的产量中的应用，其中所述D1)-D10)为：

D1)权利要求1所述的蛋白质；

D2)权利要求2所述的核酸分子；

D3)权利要求3所述的生物材料；

D4)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

D5)编码SEQ ID No.2所示蛋白质的DNA分子；

D6)核苷酸序列或编码序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D7)含有D5)或D6)中所述DNA分子的表达盒；

5.一种提高微生物L-氨基酸的产量的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

E1)提高目的微生物中的权利要求2所述核酸分子的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2)提高目的微生物中的权利要求4中D5)或D6)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第36位的亮氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第36位的亮氨酸残基突变为谷氨酰胺残基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述突变是将SEQ ID No.1所示DNA分子中第107位的核苷酸T突变为A。

8.一种构建权利要求3或4中所述重组微生物的方法，其特征在于，所述方法包括至少下述任一种：

F1)将权利要求2所述的核酸分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F2)将权利要求4中D5)或D6)所述DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

9.一种制备L-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求3或4中所述的重组微生物生产L-氨基酸。

10.根据权利要求4所述的应用，或权利要求5-7中任一所述的方法，或权利要求9所述的方法，其特征在于，所述L-氨基酸为L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和/或L-缬氨酸。