CN109777763B - 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型高效γ‑谷氨酰甲胺合成酶以及一株无质粒用于L‑茶氨酸生产的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成L‑茶氨酸的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，通过在其基因组上整合三拷贝的γ‑谷氨酰甲胺合成酶基因gmas‑Mu；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA获得。通过系统代谢改造后，工程菌能够以葡萄糖为原料从头合成L‑茶氨酸，发酵产量和糖酸转化率均为现有报道的最高值，5L发酵罐发酵中L‑茶氨酸的最高产量可达60g/L，糖酸转化率可达40％。

Description

一株用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型高效γ-谷氨酰甲胺合成酶以及一株无质粒用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

L-茶氨酸(N-乙基-L-谷氨酰胺)属于酰胺类化合物，是茶叶中特有的，也是含量最丰富的游离氨基酸，占总游离氨基酸含量的50％以上。它是茶叶香味和口感的主要成分，因此它的含量多少对茶叶的风味和品质起到关键性的作用。大量研究结果表明L-茶氨酸具有多种重要的生理功能，如促进大脑的学习和记忆功能，预防心血管疾病，抑制脂肪积累等，因而被广泛应用于食品、保健品及医药行业中。

现有L-茶氨酸的主要制备途径包括提取分离法、化学合成法和酶促合成法。提取法(ZL201510578407.7、ZL201210341844.3、ZL 201510304960.1、ZL 200310109053.9)存在一定的缺点，从植物中提取茶氨酸步骤繁琐、周期长、成本昂贵、提取量少，不能满足大规模生产需求。化学合成法(ZL201110225339.8、ZL 200510122360.X、ZL201310485626.1)方法简单且成本低廉，是目前工业化生产的主要途径之一，但合成的茶氨酸易存在消旋体、提取困难、污染能耗大且难于在食品领域中应用。酶促合成法(ZL201310302347.7、ZL201410325370.2、201510973289.X、ZL201210235889.2)则普遍存在表达效率低、酶分离成本高、产率低以及催化反应成本高等缺点。

γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS)是一种能够催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，该反应需要消耗ATP。研究表明，有些GMAS可以将乙胺结合到L-谷氨酸的γ-氨基上形成L-茶氨酸。1992年，Kimura等首次从噬甲基菌株(Methylophaga sp.)AA-30中纯化出GMAS，该酶在pH 7.5和40℃条件下有最大活性，表现出较宽的底物特异性范围，并能以乙胺和L-谷氨酸为底物催化合成L-茶氨酸，但未进行深入研究(Biosci.Biotechnol.Biochem.,56(5),708–711,1992)。2007年，Yamamoto等从200多种甲胺和甲醇同化细菌中发现，来源于Methylovorus mays No.9的GMAS在中性pH值范围具有较高的催化活性(Biosci.Biotechnol.Biochem.,71(2),545–552,2007)。随后该课题组将Methylovorus mays No.9中GMAS的编码基因在大肠杆菌中进行了重组表达，结果表明重组菌的产酶能力可比原始Methylovorus mays No.9高23倍，而重组GMAS的酶学性质与天然GMAS无明显不同，这使得大量生产GMAS用于工业催化制备L-茶氨酸成为可能(Biosci.Biotechnol.Biochem.,72(1),101–109,2008)。2016年，祝俊等以重组GMAS作为催化剂，研究了偶联基于磷酸激酶(polyphosphate kinase，PPK)的ATP再生系统的酶法L-茶氨酸合成路线(Process Biochemistry,51,1458–1463,2016)。但是，酶催化法合成L-茶氨酸包括产酶菌株的培养和酶促反应制备L-茶氨酸两个过程，且需要使用价格较高的谷氨酸盐和ATP为原料，因此生产成本与提取法和化学法相比并无优势。

与现有技术相比，微生物发酵法具有培养条件简单、周期短、操作简便、绿色环保、原料及生产成本低廉等优点，具有更加良好的工业应用价值。本课题组在前期的研究中，构建了一株用于L-茶氨酸生产的基因工程菌，该菌株是在大肠杆菌基因组上单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，该基因由木糖启动子控制；双拷贝来源于Methylovorusmays No.9的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，该基因由T7启动子控制；敲除木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。使用该基因工程菌可以以葡萄糖为碳源直接发酵得到L-茶氨酸，产量可达40g/L，糖酸转化率可达到25％(201811215068.6)。

为了获得更高产的茶氨酸发酵生产菌株，本专利筛选获得了一种新型高效的γ-谷氨酰甲胺合成酶，该酶来源于Methyloversatilis universalis(ATCC BAA1314)，其具有较高的催化L-茶氨酸合成的酶活力。同时，采用新的代谢工程改造策略，构建出一株L-茶氨酸产量和糖酸转化率显著提高的大肠杆菌基因工程菌。

发明内容：

针对上述存在问题，本发明目的是通过筛选获得一种新型高效γ-谷氨酰甲胺合成酶并且提供一株高产L-茶氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，并制定了相应的发酵过程控制方案，具有很好的工业应用前景。

本发明技术方案概述如下：

本发明提供了一种新型高效的γ-谷氨酰甲胺合成酶GMAS，来源于Methyloversatilis universalis(ATCC BAA1314)，其编码基因gmas-Mu的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

本发明还提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成L-茶氨酸的基因工程菌，具体为大肠杆菌(Escherichia coli)THE。大肠杆菌(Escherichia coli)THE是以大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 27325(E.coli W3110)为宿主，通过以下改造获得：在其基因组上整合三拷贝的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu，该基因由trc启动子控制；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079，该基因由trc启动子控制；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689，该基因由trc启动子控制；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制；

优选地，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu来源于Methyloversatilisuniversalis(ATCC BAA1314)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述丙酮酸羧化酶基因Cgl0689来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述柠檬酸合酶基因gltA来源于大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC27325(E.coli W3110)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

上述基因工程菌的构建方法如下：

本发明中采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向改造，具体包括如下步骤：

(1)为了引入并增强L-茶氨酸的合成代谢，在大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC27325基因组上的yghX，yeeP及yjiT位点三拷贝来源于Methyloversatilis universalisATCC BAA1314的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu(SEQ ID NO.1所示)，该基因经过密码子优化并由trc启动子控制；

(2)为了加强前体物L-谷氨酸的合成代谢，在大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC27325基因组上的yjiV位点单拷贝来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079(SEQ ID NO.2所示)，该基因由trc启动子控制；

(3)为了引入并增强丙酮酸到草酰乙酸的代谢，在大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 27325基因组上的yghE位点单拷贝来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032的丙酮酸羧化酶基因Cgl0689(SEQ ID NO.3所示)，该基因由trc启动子控制；

(4)为了加强柠檬酸到草酰乙酸的代谢，在大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC27325基因组上ylbE位点单拷贝来源于大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 27325的柠檬酸合酶基因gltA(SEQ ID NO.4所示)，该基因由trc启动子控制；

其中，步骤(1)-(4)的构建顺序不分先后，可根据需求进行调整。

本发明还提供上述基因工程菌在生产L-茶氨酸中的应用。

本发明还提供了利用上述基因工程菌发酵生产L-茶氨酸的方法，具体如下：

发酵培养：将种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在36-38℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD₆₀₀＝15-25时开始以35-40mL/h的流速流加2.5-2.8mol/L的乙胺溶液，流加量为160-180mL/L培养基，发酵周期18-20h；

发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

其中，5L发酵罐发酵18-20h后L-茶氨酸的产量可达55-60g/L，糖酸转化率36-40％。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过筛选获得了来源于Methyloversatilis universalis ATCCBAA1314的γ-谷氨酰甲胺合成酶，该酶具有催化L-茶氨酸合成的活性，且酶活力优于现有报道中普遍使用的来源于Methylovorus mays No.9的γ-谷氨酰甲胺合成酶。

(2)大肠杆菌自身并没有L-茶氨酸合成代谢途径。为了得到能够直接发酵生产L-茶氨酸的菌株，我们将Methyloversatilis universalis来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶整合到野生型大肠杆菌的基因组上，通过拷贝数的优化使更多的碳代谢流向L-茶氨酸的合成。此外，我们使用trc启动子调控γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的表达，与现有技术(201811215068.6)中使用噬菌体来源的T7启动子调控相比，基因表达量更为稳定。

(3)大肠杆菌自身并没有丙酮酸羧化形成草酰乙酸的代谢途径。为了增加L-茶氨酸合成前体物L-谷氨酸的积累，我们将谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因整合到大肠杆菌的基因组上，构建出丙酮酸到草酰乙酸的代谢，同时通过引入谷氨酸棒杆菌来源的谷氨酸脱氢酶基因和大肠杆菌内源的柠檬酸合酶基因，大幅度提高了丙酮酸向前体物L-谷氨酸的代谢流量，使得有更多的L-谷氨酸能够用于L-茶氨酸的合成。

(4)通过系统代谢改造策略，工程菌大肠杆菌(Escherichia coli)THE能够以葡萄糖为原料从头合成L-茶氨酸，发酵产量和糖酸转化率均为现有报道的最高值，5L发酵罐发酵中L-茶氨酸的最高产量可达60g/L，糖酸转化率可达40％。

附图说明：

图1 yghX::P_trc-gmas-Mu整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图2 yeeP::P_trc-gmas-Mu整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图3 yjiT::P_trc-gmas-Mu整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图4 yjiV::P_trc-Cgl2079整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图5 yghE::P_trc-Cgl0689整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图6 ylbE::P_trc-gltA整合DNA电泳图

其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；

图7实施例2发酵过程图；

图8实施例3发酵过程图；

图9本发明在大肠杆菌中构建的L-茶氨酸合成代谢途径。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成L-茶氨酸的基因工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)THE。大肠杆菌(Escherichia coli)THE是以大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 27325为宿主，在其基因组上整合三拷贝的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu，该基因由trc启动子控制；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079，该基因由trc启动子控制；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689，该基因由trc启动子控制；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制。大肠杆菌(Escherichia coli)THE以葡萄糖为底物从头合成L-茶氨酸的代谢流程图如图9所示。

本发明采用大肠杆菌(Escherichia coli)THE发酵罐发酵生产L-茶氨酸的方法具体如下：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；

发酵培养：将种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，装液量为60％(v培养基/v发酵罐)，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在36-38℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD₆₀₀＝15-25时开始以35-40mL/h的流速流加2.5-2.8mol/L的乙胺溶液，流加量为160-180mL/L培养基，发酵周期18-20h；

斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-25g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物5-10g/L，胰蛋白胨5-10g/L，KH₂PO₄5-15g/L，MgSO₄·7H₂O 2-5g/L，FeSO₄·7H₂O 5-15mg/L，MnSO₄·H₂O 5-15mg/L，V_B1 1-3mg/L，V_H 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

5L发酵罐发酵18-20h后L-茶氨酸的产量可达55-60g/L，糖酸转化率36-40％。

以下将结合具体实施例对本发明做进一步解释说明。

实施例1：基因工程菌株大肠杆菌(Escherichia coli)THE的构建：

1基因编辑的方法

本发明中采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑方法参照文献(MetabolicEngineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒分别为pGRB与pREDCas9。其中pREDCas9携带gRNA质粒消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB质粒，以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。

2菌株构建的具体过程

2.1将P_trc-gmas-Mu(含有gmas-Mu基因和trc启动子的片段)整合在假基因yghX位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其yghX基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yghX-S(SEQ ID NO.5)、UP-yghX-A(SEQ ID NO.6)和下游同源臂引物DN-yghX-S(SEQ ID NO.7)、DN-yghX-A(SEQ ID NO.8)，并PCR扩增其上、下游同源臂片段；根据gmas-Mu基因设计引物gmas-Mu-S(SEQ ID NO.9)、gmas-Mu-A(SEQ ID NO.10)，并扩增gmas-Mu基因片段(SEQ ID NO.1)。启动子P_trc则设计在上游同源臂的下游引物和gmas-Mu基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas-Mu基因的整合片段(yghX基因上游同源臂-P_trc-gmas-Mu-yghX基因下游同源臂)，构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghX-S(SEQ ID NO.11)和gRNA-yghX-A(SEQ ID NO.12)的退火制得,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yghX。将整合片段和pGRB-yghX电转化至含有pREDCas9的E.coli ATCC27325感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghX，最终获得菌株E.coli THE1。

P_trc-gmas-Mu片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。其中上游同源臂长度为658bp，gmas-Mu基因片段长度为1447bp，下游同源臂长度为619bp，重叠片段的长度为2653bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为2653bp，原菌扩增出来的片段长度应为1765bp。

2.2将P_trc-gmas-Mu整合在假基因yeeP位点处

以E.coli(ATCC27325)基因组为模板，根据其yeeP基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(SEQ ID NO.13)、UP-yeeP-A(SEQ ID NO.14)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(SEQ ID NO.15)、DN-yeeP-A(SEQ ID NO.16)，并扩增yeeP基因的上、下游同源臂；根据gmas-Mu基因设计引物gmas-Mu-S1(SEQ ID NO.17)、gmas-Mu-A1(SEQ ID NO.18)，并扩增gmas-Mu基因片段(SEQ ID NO.1)。启动子P_trc则设计在yeeP基因上游同源臂的下游引物和gmas-Mu基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas-Mu基因的整合片段(yeeP基因上游同源臂-P_trc-gmas-Mu-yeeP基因下游同源臂)，构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S(SEQ ID NO.19)和gRNA-yeeP-A(SEQ ID NO.20)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体的E.coli THE1感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP，最终获得菌株E.coli THE2。

P_trc-gmas-Mu整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中，上游同源臂的长度应为568bp，gmas-Mu基因片段长度应为1452bp，下游同源臂的长度应为576bp，整合片段的总长应为2515bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2515bp，原菌PCR扩增片段长度应为1396bp。

2.3将P_trc-gmas-Mu整合在假基因yjiT位点处

以E.coli(ATCC27325)基因组为模板，根据其yjiT基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yjiT-S(SEQ ID NO.21)、UP-yjiT-A(SEQ ID NO.22)和下游同源臂引物DN-yjiT-S(SEQ ID NO.23)、DN-yjiT-A(SEQ ID NO.24)，并扩展yjiT基因的上、下游同源臂；根据gmas-Mu基因设计引物gmas-Mu-S(SEQ ID NO.9)、gmas-Mu-A(SEQ ID NO.10)，并扩增gmas-Mu基因片段(SEQ ID NO.1)。启动子P_trc则设计在yjiT基因上游同源臂的下游引物和gmas-Mu基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas-Mu基因的整合片段(yjiT基因上游同源臂-P_trc-gmas-Mu-yjiT基因下游同源臂)，构建pGRB-yjiT使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjiT-S(SEQ ID NO.25)和gRNA-yjiT-A(SEQ ID NO.26)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yjiT。将整合片段和pGRB-yjiT电转化至含有pREDCas9载体的E.coli THE2感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yjiT，最终获得菌株E.coli THE3。

P_trc-gmas-Mu整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中，上游同源臂的长度应为372bp，gmas-Mu基因片段长度应为1447bp，下游同源臂的长度应为525bp，整合片段的总长应为2273bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2273bp，原菌PCR扩增片段长度应为1873bp。

2.4将P_trc-Cgl2079(含有Cgl2079基因和trc启动子的片段)整合在假基因yjiV位点处

以E.coli(ATCC27325)基因组为模板，根据其yjiV基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yjiV-S(SEQ ID NO.27)、UP-yjiV-A(SEQ ID NO.28)和下游同源臂引物DN-yjiV-S(SEQ ID NO.29)、DN-yjiV-A(SEQ ID NO.30)，并扩展yjiV基因的上、下游同源臂；根据Cgl2079基因设计引物Cgl2079-S(SEQ ID NO.31)、Cgl2079-A(SEQ ID NO.32)，并扩增Cgl2079基因片段(SEQ ID NO.2)。启动子P_trc则设计在yjiV基因上游同源臂的下游引物和Cgl2079基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得Cgl2079基因的整合片段(yjiV基因上游同源臂-P_trc-Cgl2079-yjiV基因下游同源臂)，构建pGRB-yjiV使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjiV-S(SEQ ID NO.33)和gRNA-yjiV-A(SEQ ID NO.34)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yjiV。将整合片段和pGRB-yjiV电转化至含有pREDCas9载体的E.coli THE3感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yjiV，最终获得菌株E.coli THE4。

P_trc-Cgl2079整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中，上游同源臂的长度应为603bp，Cgl2079基因片段长度应为1462bp，下游同源臂的长度应为679bp，整合片段的总长应为2673bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2673bp，原菌PCR扩增片段长度应为2641bp，进一步通过测序验证为正确。

2.5将P_trc-Cgl0689(含有Cgl0689基因和trc启动子的片段)整合在假基因yghE位点处

以E.coli(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghE基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yghE-S(SEQ ID NO.35)、UP-yghE-A(SEQ ID NO.36)和下游同源臂引物DN-yghE-S(SEQ ID NO.37)、DN-yghE-A(SEQ ID NO.38)，并扩增yghE基因的上、下游同源臂；根据Cgl0689基因设计引物Cgl0689-S(SEQ ID NO.39)、Cgl0689-A(SEQ ID NO.40)，并扩增Cgl0689基因片段(SEQ ID NO.3)。启动子P_trc则设计在yghE基因上游同源臂的下游引物和Cgl0689基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得Cgl0689基因的整合片段(yghE基因上游同源臂-P_trc-Cgl0689-yghE基因下游同源臂)，构建pGRB-yghE使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghE-S(SEQ ID NO.41)和gRNA-yghE-A(SEQ ID NO.42)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yghE。将整合片段和pGRB-yghE电转化至含有pREDCas9载体的E.coli THE4感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghE，最终获得菌株E.coli THE5。

P_trc-Cgl0689整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中，上游同源臂的长度应为559bp，Cgl0689基因片段长度应为3541bp，下游同源臂的长度应为549bp，整合片段的总长应为4578bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为4578bp，原菌PCR扩增片段长度应为1547bp。

2.6将P_trc-gltA(含有gltA基因和trc启动子的片段)整合在假基因ylbE位点处

以E.coli(ATCC27325)基因组为模板，根据其ylbE基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ylbE-S(SEQ ID NO.43)、UP-ylbE-A(SEQ ID NO.44)和下游同源臂引物DN-ylbE-S(SEQ ID NO.45)、DN-ylbE-A(SEQ ID NO.46)，并扩增ylbE基因的上、下游同源臂；根据gltA基因设计引物gltA-S(SEQ ID NO.47)、gltA-A(SEQ ID NO.48)，并扩增gltA基因片段(SEQ ID NO.4)。启动子P_trc则设计在ylbE基因上游同源臂的下游引物和gltA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gltA基因的整合片段(ylbE基因上游同源臂-P_trc-gltA-ylbE基因下游同源臂)，构建pGRB-ylbE使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ylbE-S(SEQ ID NO.49)和gRNA-ylbE-A(SEQ ID NO.50)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ylbE。将整合片段和pGRB-ylbE电转化至含有pREDCas9载体的E.coli THE5感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ylbE及pREDCas9，最终获得菌株E.coli THE。

P_trc-gltA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中，上游同源臂的长度应为601bp，gltA基因片段长度应为1407bp，下游同源臂的长度应为547bp，整合片段的总长应为2474bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2474bp，原菌PCR扩增片段长度应为2184bp。

3.菌株构建过程中用到的引物

菌株构建过程中所涉及的所有引物见下表：

实施例2：菌株E.coli THE发酵罐发酵生产L-茶氨酸

菌株E.coli THE在5L发酵罐上的发酵实验：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；

发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，装液量为60％(v培养基/v发酵罐)，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD₆₀₀＝25时开始以40mL/h的流速流加2.8mol/L的乙胺溶液，流加量为180mL/L培养基，发酵周期18h；

斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；

种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B1、V_H各1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5g/L，柠檬酸钠1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 80mg/L，MnSO₄·H₂O 80mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

5L发酵罐发酵18h后L-茶氨酸的产量达到了60g/L，糖酸转化率达到40％。发酵过程曲线见附图7。

实施例3：菌株E.coli THE发酵罐发酵生产L-茶氨酸

菌株E.coli THE在5L发酵罐上的发酵实验：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；

发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，装液量为60％(v培养基/v发酵罐)，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD₆₀₀＝15时开始以35mL/h的流速流加2.5mol/L的乙胺溶液，流加量为160mL/L培养基，发酵周期20h；；

斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；

种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B1、V_H各1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5g/L，柠檬酸钠1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 80mg/L，MnSO₄·H₂O 80mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

5L发酵罐发酵20h后L-茶氨酸的产量达到了55g/L，糖酸转化率达到36％。发酵过程曲线见附图8。

实施例4γ-谷氨酰甲胺合成酶活性测定

将现有技术中的Methylovorus mays No.9的γ-谷氨酰甲胺合成酶(GenBank编号:AB333782.1)以及本发明使用的Methyloversatilis universalis(ATCC BAA1314)来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶的氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因合成，连接pET-28a质粒后转化到E.coli BL21感受态细胞中。对上述构建完成菌株进行培养后收集菌体，将细胞破碎后作为粗酶液，加入底物进行酶催化反应测试γ-谷氨酰甲胺合成酶的活性。

按以下成分和终浓度配置酶活测定体系：L-谷氨酸30mM，乙胺30mM，ATP 30mM，硫酸镁30mM，磷酸缓冲液(pH8.0)50mM，粗酶液(蛋白浓度)1g/L。

以30℃，每分钟催化形成1μM L-茶氨酸定义为1个酶活力单位。测定结果如表1所示。

表1不用来源γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活力比较

实验结果表明，来源于Methyloversatilis universalis(ATCC BAA1314)的γ-谷氨酰甲胺合成酶具有催化L-茶氨酸合成的活性。该酶的比酶活是来源于Methylovorusmays No.9的γ-谷氨酰甲胺合成酶比酶活的1.45倍。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一株用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用

<130> 1

<141> 2019-03-29

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> Methyloversatilis universalis (ATCC BAA1314)

<400> 1

atgagcccga gcgaagccca gcagttttta aaagaaaatc aagttaaata tattttagca 60

cagtttgtgg atatccacgg tagcgccaag accaagagcg tgcccgctga acactacaaa 120

accgtggtga cagacggtgc cggctttgcc ggcttcgcca tttggggcat gggcatgacc 180

cctaatgtgg atgccgacta catggccgtt ggtgatgcaa gcacactgag tctggtgccg 240

tggcagccgg gctatgcacg tattgcttgt gatggtcaca cccatggcaa gccgcacgaa 300

tacgataccc gcgtggttct gaagaagcag ttagagcaga ttaccgcccg cggctggacc 360

ttcttcaccg gcatggaacc ggaattttct ttactgcgca aagtggaagg caaactgctg 420

ccggccgatc cgggtgatac tttaagcaaa ccgtgctacg attacaaggg tctgagtcgc 480

gcccgcgtgt ttttagaacg tctgagcgaa tctttacgta gtgttggcat cgacgtgtac 540

cagattgacc atgaggacgc caatggtcag tttgagatta attacacctt caccgatgcc 600

ttaaccagtt gcgaccacta caccttcttc aaaatgggcg cagccgagat tgccgcagaa 660

ctgggtctga tctgcagctt tatgccgaag ccgttcagta accgtccggg taatggttta 720

cacatgcata tgagcatcgg cgacggcaag cgcaatttat tcgaggataa gagcgataag 780

cacggtctgg ctttaagtaa actggcatat cactgggcag ccggtctgct gaaacatgcc 840

ccggcactgg ccgcattatg ctgcccgacc gttaatagct ataaacgtct ggttgttggc 900

cgcagtctga ccggcgcaac atgggcaccg gcctacattt gctatggcgg caacaatcgc 960

agtggtatga tccgcagtcc gggtggtcgt ctggaactgc gtctgccgga tgcaagctgc1020

aatgcatatt tagcaaccgc cgccgtgatt gcagctggta tggacggtgt gatcaatgaa1080

ctggatccgg gcgccccgca gaatgacaat ctgtatgagt atagtcaagc tcaactggat1140

gcagccggta tcaaagtgct gccgcagaat ctgcacgaag ctttactggc tttagagaaa1200

gatgaagtga ttcgcagtgc tttaggcccg gttgttgatg aatttttacg tttaaaacat1260

atggagtggg tggagtacat gcgccacgtg agcgattggg aagtgaattc ttatctggaa1320

tttttttaa 1329

<210> 2

<211> 1344

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)

<400> 2

atgacagttg atgagcaggt ctctaactat tacgacatgc ttctgaagcg caatgctggc 60

gagcctgaat ttcaccaggc agtggcagag gttttggaat ctttgaagat cgtcctggaa 120

aaggaccctc attacgctga ttacggtctc atccagcgcc tgtgcgagcc tgagcgtcag 180

ctcatcttcc gtgtgccttg ggttgatgac cagggccagg tccacgtcaa ccgtggtttc 240

cgcgtgcagt tcaactctgc acttggacca tacaagggcg gcctgcgctt ccacccatct 300

gtaaacctgg gcattgtgaa gttcctgggc tttgagcaga tctttaaaaa ctccctaacc 360

ggcctgccaa tcggtggtgg caagggtgga tccgacttcg accctaaggg caagtccgat 420

ctggaaatca tgcgtttctg ccagtccttc atgaccgagc tacaccgcca catcggtgag 480

taccgcgacg ttcctgcagg tgacatcgga gttggtggcc gcgagatcgg ttacctgttt 540

ggccactacc gtcgcatggc taaccagcac gagtccggcg ttttgaccgg taagggcctg 600

acctggggtg gatccctggt ccgcaccgag gcaactggct acggctgcgt ttacttcgtg 660

agtgaaatga tcaaggctaa gggcgagagc atcagcggcc agaagatcat cgtttccggt 720

tccggcaacg tagcaaccta cgcgattgaa aaggctcagg aactcggcgc aaccgttatt 780

ggtttctccg attccagcgg ttgggttcat acccctaacg gcgttgacgt ggctaagctc 840

cgcgaaatca aggaagttcg tcgcgcacgc gtatccgtgt acgccgacga agttgaaggc 900

gcaacctacc acaccgacgg ttccatctgg gatctcaagt gcgatatcgc tcttccttgt 960

gcaactcaga acgagctcaa cggcgagaac gctaagactc ttgcagacaa cggctgccgt1020

ttcgttgctg aaggcgcgaa catgccttcc acccctgagg ctgttgaggt cttccgtgag1080

cgcgacatcc gcttcggacc aggcaaggca gctaacgctg gtggcgttgc aacctccgct1140

ctggagatgc agcagaacgc ttcgcgcgat tcctggagct tcgagtacac cgacgagcgc1200

ctccaggtga tcatgaagaa catcttcaag acctgtgcag agaccgcagc agagtatgga1260

cacgagaacg attacgttgt cggcgctaac attgctggct tcaagaaggt agctgacgcg1320

atgctggcac agggcgtcat ctaa 1344

<210> 3

<211> 3423

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)

<400> 3

gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60

ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120

atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180

attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240

gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300

cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360

cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420

gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480

cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540

gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600

gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660

gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720

ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780

ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840

gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900

ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960

gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag1020

atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc1080

ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt1140

cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg1200

aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg1260

gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg1320

gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc1380

cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc1440

accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg1500

cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc1560

ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc1620

ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct1680

gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc1740

gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag1800

ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg1860

ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc1920

ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca1980

atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt2040

gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag2100

gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc2160

ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac2220

gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct2280

ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc2340

ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag2400

gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag2460

tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg2520

tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa2580

gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc2640

aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt2700

gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag2760

cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc2820

tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct2880

gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa2940

gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc3000

ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca3060

ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg3120

gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc3180

accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct3240

ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca3300

atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat3360

cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc3420

taa 3423

<210> 4

<211> 1284

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coliATCC 27325)

<400> 4

atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60

ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120

ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180

gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240

tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300

tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360

ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420

gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480

gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540

attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600

atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660

gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720

accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780

tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840

tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900

ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960

gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct1020

atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg1080

aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc1140

accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac1200

agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac1260

tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcgcaacgta gaacaggaat t 21

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaagatt 60

gaagcgcctt tactactcc 79

<210> 7

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatgt 60

catagtaatc cagcaactct tgtg 84

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gagcaggtat ttacgtgaac cg 22

<210> 9

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgaaaagtc tggaagaagc tcaga 85

<210> 10

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttaatag aactgcacat agcgattga 89

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

agtcctaggt ataatactag taccgcactt cgccgcaagg ttgaggtttt agagctagaa 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ttctagctct aaaacctcaa ccttgcggcg aagtgcggta ctagtattat acctaggact 60

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ggtcaggagg taacttatca gcg 23

<210> 14

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaatgg 60

cagggctccg tttt 74

<210> 15

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatgaactgg attttcttct gaacctgt 88

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

acgatgtcag cagccagca 19

<210> 17

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgagcccga gcgaagccca gcagt 85

<210> 18

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttaaaaa aattccagat aagaattc 88

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

agtcctaggt ataatactag tacagaatat tcgcgaaaaa agttttagag ctagaa 56

<210> 20

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ttctagctct aaaacttttt tcgcgaatat tctgtactag tattatacct aggact 56

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

aatagttgtt gccgcctgag t 21

<210> 22

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaaaaa 60

caggcagcaa agtccc 76

<210> 23

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaataa 60

gcactacctg tgaagggatg t 81

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

cagggcttcc acagtcacaa t 21

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agtcctaggt ataatactag tagggattat gaacggcaat ggttttagag ctagaa 56

<210> 26

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

ttctagctct aaaaccattg ccgttcataa tccctactag tattatacct aggact 56

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gactgtggaa gccctgtata cg 22

<210> 28

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaactgt 60

cccttgtcga ctgtctgt 78

<210> 29

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaattg 60

aacgagttta ttctgccgg 79

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

tggcgacatt cccttcctt 19

<210> 31

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgacagttg atgagcaggt ctcta 85

<210> 32

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt ctttcgactg agcctttcgt tttatttgtt 60

agatgacgcc ctgtgcc 77

<210> 33

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

agtcctaggt ataatactag tgcgtagtcg aaattctcag cgttttagag ctagaa 56

<210> 34

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

ttctagctct aaaacgctga gaatttcgac tacgcactag tattatacct aggact 56

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

gtcaggcact ggcgaaagat 20

<210> 36

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacgca 60

agccataaac ccaca 75

<210> 37

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaattt 60

ccgacatcga aatgcgt 77

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

aggcgttgtt gtggcagatt 20

<210> 39

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

gtgtcgactc acacatcttc aacg 84

<210> 40

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt ctttcgactg agcctttcgt tttatttgtt 60

aggaaacgac gacgatcaag tc 82

<210> 41

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

agtcctaggt ataatactag taatgccggg gatggagcgc cgttttagag ctagaa 56

<210> 42

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

ttctagctct aaaacggcgc tccatccccg gcattactag tattatacct aggact 56

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

acccaacctt acgcaaccag 20

<210> 44

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaattgt 60

tcgataaccg cagcat 76

<210> 45

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatcgctggc gtgctttgaa 80

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

ggcgtaactc agcaggcag 19

<210> 47

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atggctgata caaaagcaaa actc 84

<210> 48

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttaacgc ttgatatcgc ttttaaag 88

<210> 49

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

agtcctaggt ataatactag tacactggct ggatgtgcaa cgttttagag ctagaa 56

<210> 50

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

ttctagctct aaaacgttgc acatccagcc agtgtactag tattatacct aggact 56

Claims (6)

1.一株合成L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，通过以下改造获得：在其基因组上整合三拷贝的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu，该基因由trc启动子控制；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079，该基因由trc启动子控制；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689，该基因由trc启动子控制；以及单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制；

所述γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述丙酮酸羧化酶基因Cgl0689，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

所述柠檬酸合酶基因gltA，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的一株合成L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌Escherichia coli ATCC 27325。

3.权利要求1或2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向改造。

4.权利要求1或2所述基因工程菌在生产L-茶氨酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵生产L-茶氨酸的方法如下：将种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在7.0，温度维持在36-38℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD₆₀₀＝15-25时开始以35-40mL/h的流速流加2.5-2.8mol/L的乙胺溶液，流加量为160-180mL/L培养基，发酵周期18-20h。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

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