CN109370966A - 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法 - Google Patents

一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109370966A
CN109370966A CN201811215068.6A CN201811215068A CN109370966A CN 109370966 A CN109370966 A CN 109370966A CN 201811215068 A CN201811215068 A CN 201811215068A CN 109370966 A CN109370966 A CN 109370966A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
gene
nucleotide sequence
sequence table
homology arm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811215068.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109370966B (zh
Inventor
范晓光
朱新雅
曹华杰
徐庆阳
张通
谢沛
刘博超
陈宁
谢希贤
张成林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HENAN JULONG BIO-ENGINEERING CO LTD
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
HENAN JULONG BIO-ENGINEERING CO LTD
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HENAN JULONG BIO-ENGINEERING CO LTD, Tianjin University of Science and Technology filed Critical HENAN JULONG BIO-ENGINEERING CO LTD
Priority to CN201811215068.6A priority Critical patent/CN109370966B/zh
Publication of CN109370966A publication Critical patent/CN109370966A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109370966B publication Critical patent/CN109370966B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于L‑茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法，在大肠杆菌(Escherichia coli W3110)基因组上单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，该基因由木糖启动子控制；双拷贝来源于Methylovorus mays的γ‑谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，该基因由T7启动子控制；敲除木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。使用本基因工程菌发酵L‑茶氨酸的产量可达40g/L，糖酸转化率可达到25％。本发明提供的L‑茶氨酸生产方法具有原料价格低廉，周期短，操作简便，绿色环保，产率较高的优点，具有良好的工业应用价值。

Description

一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法。
背景技术
L-茶氨酸(L-Theanine)，又名谷氨酸γ-乙基酰胺，是茶叶中特有的游离氨基酸，占茶叶总游离氨基酸50％以上。作为茶叶甘甜味道的主要组成部分，茶氨酸在一定程度上决定着茶叶的质量。茶氨酸具有对人体健康的许多有益作用，包括促进大脑的学习和记忆功能，预防心血管疾病，抑制脂肪积累等。此外，茶氨酸还可以增强风味，抑制食品中的苦味和辣味，减轻涩味，因此已被广泛应用于制药和食品行业。
目前茶氨酸的主要制备方法主要包括提取法和化学合成法。从茶叶或茶叶废渣中提取茶氨酸(ZL201510578407.7、ZL201210341844.3、ZL 201510304960.1、ZL200310109053.9)普遍存在提取步骤繁琐、有机溶剂使用较多、提取收率和产品纯度低等问题，不能满足大规模生产需求。化学法合成茶氨酸(ZL201110225339.8、ZL200510122360.X、ZL201310485626.1)则普遍存在反应条件苛刻、有毒试剂使用较多、产物存在外消旋体等问题，产品难以在食品行业中应用。
微生物酶促合成是近几年新兴的茶氨酸合成方法。现有技术中，ZL201310302347.7报道了通过化学合成获得γ-谷氨酰转肽酶的基因，并以大肠杆菌为宿主菌构建一种过量表达γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，以重组酶作用于不同浓度的谷氨酰胺和乙胺盐酸盐得到L-茶氨酸。ZL201410325370.2报道了使用保藏编号为CCTCCNO：M2014254的硝基还原假单胞菌NTLC4.002为出发菌株制备细胞、细胞转化谷氨酰胺和乙胺制备天然茶氨酸。201510973289.X报道了以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐和少量ATP为底物合成L-茶氨酸。ZL201210235889.2报道了使用从茶树根际土壤筛选得到的近玫色锁掷孢酵母生产γ-谷氨基甲酰胺合成酶，再用该酶催化L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐和ATP生产L-茶氨酸。
现有微生物酶促合成茶氨酸包括产酶菌株的培养和酶促反应制备茶氨酸两个过程，且需要使用价格较高的谷氨酰胺、谷氨酸盐和ATP为原料，因此生产成本与提取法和化学法相比并无优势。目前为止，尚未见以葡萄糖为原料通过微生物发酵制备L-茶氨酸的报道。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种糖酸转化率高、菌株稳定好的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌，其特征在于：在大肠杆菌Escherichiacoli W3110基因组上单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，该基因由木糖启动子PxylF控制；双拷贝来源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，该基因由T7启动子控制；敲除木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。
一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌，构建方法如下：
(1)在Escherichia coli W3110基因组上lacI-lacZ位点单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP(核苷酸序列见序列表1)，该基因由木糖启动子PxylF控制；
(2)在Escherichia coli W3110基因组上yghX及yeeP位点双拷贝来源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas(核苷酸序列见序列表2)，该基因经过密码子优化并由T7启动子控制；
(3)敲除Escherichia coli W3110的木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR，解除木糖启动子受到的反馈调节作用；
(4)敲除Escherichia coli W3110的琥珀酰CoA合成酶基因sucCD，增加α-酮戊二酸到谷氨酸的代谢流量。
(5)使用该基因工程菌在5L发酵罐中发酵得到L-茶氨酸。
优选的，所述步骤(1)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其lacI-lacZ基因的上下序列设计上游同源臂引物UP-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表5)、UP-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表6)和下游同源臂引物DN-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表7)、DN-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表8)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得T7RNAP基因序列，其中包含木糖启动子PxylF，根据其T7RNAP基因序列设计引物T7RNAP-S(核苷酸序列见序列表9)、T7RNAP-A(核苷酸序列见序列表10)，并PCR扩增T7RNAP片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得T7RNAP基因的整合片段(上游同源臂-PxylF-T7RNAP-下游同源臂)。设计引物gRNA-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表11)和gRNA-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表12)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-lacI-lacZ。将整合片段和pGRB-lacI-lacZ电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-lacI-lacZ。
优选的，所述步骤(2)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yghX-S(核苷酸序列见序列表13)、UP-yghX-A(核苷酸序列见序列表14)和下游同源臂引物DN-yghX-S(核苷酸序列见序列表15)、DN-yghX-A(核苷酸序列见序列表16)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表17)、gmas-A(核苷酸序列见序列表18)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yghX-S(核苷酸序列见序列表19)和gRNA-yghX-A(核苷酸序列见序列表20)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yghX。将整合片段和pGRB-yghX电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghX。
优选的，所述步骤(2)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yeeP基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(核苷酸序列见序列表21)、UP-yeeP-A(核苷酸序列见序列表22)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(核苷酸序列见序列表23)、DN-yeeP-A(核苷酸序列见序列表24)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表25)、gmas-A(核苷酸序列见序列表26)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yeeP-S(核苷酸序列见序列表27)和gRNA-yeeP-A(核苷酸序列见序列表28)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP。
优选的，所述步骤(3)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其xylR基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-xylR-S(核苷酸序列见序列表29)、UP-xylR-A(核苷酸序列见序列表30)和下游同源臂引物DN-xylR-S(核苷酸序列见序列表31)、DN-xylR-A(核苷酸序列见序列表32)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得xylR基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-xylR-S(核苷酸序列见序列表33)和gRNA-xylR-A(核苷酸序列见序列表34)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-xylR。将敲除片段和pGRB-xylR电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-xylR。
优选的，所述步骤(4)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其sucCD基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-sucCD-S(核苷酸序列见序列表35)、UP-sucCD-A(核苷酸序列见序列表36)和下游同源臂引物DN-sucCD-S(核苷酸序列见序列表37)、DN-sucCD-A(核苷酸序列见序列表38)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得sucCD基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-sucCD-S(核苷酸序列见序列表39)和gRNA-sucCD-A(核苷酸序列见序列表40)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-sucCD。将敲除片段和pGRB-sucCD电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-sucCD和pREDCas9。
上述基因工程菌的发酵方法为，步骤如下
斜面培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L。当OD600＝15-25时开始以15-30mL/h的速率流加2-4mol/L的乙胺溶液至发酵结束，发酵周期18-20h。L-茶氨酸的产量可达30-40g/L，糖酸转化率可达到18-25％。
优选的斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，氯化钠1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，pH 7.0-7.2。种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨10-20g/L，氯化钠10-20g/L，pH 7.0-7.2。发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨10-20g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁1-2g/L，pH 7.0-7.2。
优选的L-茶氨酸的检测方法为:高效液相色谱，色谱柱为Agilent ZORBAXEclipse AAA(4.6mm×150mm，5-Micron)，流动相为乙酸钠缓冲液，50％乙腈，柱温33℃，流速1mL/min，检测波长360nm，采用二元梯度分析。样品经衍生化后进行色谱检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明构建的高产L-茶氨酸的基因工程菌遗传背景清晰，无质粒和抗生素抗性，安全稳定。该菌株可以直接消耗葡萄糖和乙胺生产L-茶氨酸，与酶促合成法相比，催化所需的谷氨酸和ATP均可以通过菌体自身代谢产生，因此具有显著的成本优势。
2、本发明首次报道了利用一步发酵法生产L-茶氨酸的工艺路线，发酵培养基成分简单，发酵周期短，产品易于分离纯化。而现有的酶促合成法则需要经历产酶和催化两个环节，生产工艺复杂且成本较高。
3、本发明对L-茶氨酸发酵生产过程中乙胺的流加方式进行了系统优化，得到了最优的添加时间，添加流速以及添加浓度，在保证菌体正常生长的同时，提高了L-茶氨酸的产量和糖酸转化率。
附图说明
图1 T7RNA聚合酶的PCR验证图，其中M：1kb Maker；1：上游同源臂；2：目的基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌PCR片段；6：目的菌PCR片段
图2 yghX::T7-gmas的PCR验证图，其中M：1kb Maker；1：上游同源臂；2：目的基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌PCR片段；6：目的菌PCR片段
图3 yeeP::T7-gmas的PCR验证图，其中M：1kb Maker；1：上游同源臂；2：目的基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌PCR片段；6：目的菌PCR片段
图4 xylR敲除的PCR验证图，其中M：1kb Maker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌PCR片段；5：目的菌PCR片段
图5 sucCD敲除的PCR验证图，其中M：1kb Maker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌PCR片段；5：目的菌PCR片段
图6 5L发酵罐的发酵进程图
图7 L-茶氨酸标品的高效液相色谱图，其中11.828min为L-茶氨酸的特征峰，其他峰为衍生剂峰。
图8 L-茶氨酸发酵样品的高效液相色谱图，其中11.763min为L-茶氨酸的特征峰，其他峰为衍生剂峰。
具体实施方式
实施例1：高产L-茶氨酸的基因工程菌的构建方法
1、将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因整合到E.coli W3110的基因组的lacI-lacZ位点
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其lacI-lacZ基因的上下序列设计上游同源臂引物UP-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表5)、UP-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表6)和下游同源臂引物DN-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表7)、DN-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表8)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得T7RNAP基因序列，其中包含木糖启动子PxylF，根据其T7RNAP基因序列设计引物T7RNAP-S(核苷酸序列见序列表9)、T7RNAP-A(核苷酸序列见序列表10)，并PCR扩增T7RNAP片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得T7RNAP基因的整合片段(上游同源臂-PxylF-T7RNAP-下游同源臂)。设计引物gRNA-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表11)和gRNA-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表12)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-lacI-lacZ。将整合片段和pGRB-lacI-lacZ电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-lacI-lacZ。PxylF-T7RNAP片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。其中上游同源臂长度为424bp，T7RNAP基因片段长度为3034bp，下游同源臂长度为453bp，重叠片段的长度为3911bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为3911bp，原菌扩增出来的片段长度应为4170bp。
2、将T7-gmas整合在假基因yghX位点处
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yghX-S(核苷酸序列见序列表13)、UP-yghX-A(核苷酸序列见序列表14)和下游同源臂引物DN-yghX-S(核苷酸序列见序列表15)、DN-yghX-A(核苷酸序列见序列表16)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表17)、gmas-A(核苷酸序列见序列表18)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yghX-S(核苷酸序列见序列表19)和gRNA-yghX-A(核苷酸序列见序列表20)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yghX。将整合片段和pGRB-yghX电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghX。T7-gmas整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中，上游同源臂的长度应为648bp，gmas基因片段长度应为1415bp，下游同源臂的长度应为595bp，整合片段的总长应为2607bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2607bp，原菌PCR扩增片段长度应为1765bp。
3、将T7-gmas整合在yeeP基因位点处
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yeeP基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(核苷酸序列见序列表21)、UP-yeeP-A(核苷酸序列见序列表22)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(核苷酸序列见序列表23)、DN-yeeP-A(核苷酸序列见序列表24)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表25)、gmas-A(核苷酸序列见序列表26)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yeeP-S(核苷酸序列见序列表27)和gRNA-yeeP-A(核苷酸序列见序列表28)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP。T7-gmas整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中，上游同源臂的长度应为558bp，gmas基因片段长度应为1415bp，下游同源臂的长度应为547bp，整合片段的总长应为2469bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2469bp，原菌PCR扩增片段长度应为1396bp。
4、xylR基因的敲除
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其xylR基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-xylR-S(核苷酸序列见序列表29)、UP-xylR-A(核苷酸序列见序列表30)和下游同源臂引物DN-xylR-S(核苷酸序列见序列表31)、DN-xylR-A(核苷酸序列见序列表32)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得xylR基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-xylR-S(核苷酸序列见序列表33)和gRNA-xylR-A(核苷酸序列见序列表34)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-xylR。将敲除片段和pGRB-xylR电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-xylR。xylR敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中，上游同源臂的长度应为589bp，下游同源臂的长度应为544bp，敲除片段的总长应为1133bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1133bp，原菌PCR扩增片段长度应为2077bp。
5、sucCD基因的敲除
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其sucCD基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-sucCD-S(核苷酸序列见序列表35)、UP-sucCD-A(核苷酸序列见序列表36)和下游同源臂引物DN-sucCD-S(核苷酸序列见序列表37)、DN-sucCD-A(核苷酸序列见序列表38)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得sucCD基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-sucCD-S(核苷酸序列见序列表39)和gRNA-sucCD-A(核苷酸序列见序列表40)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-sucCD。将敲除片段和pGRB-sucCD电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-sucCD和pREDCas9。sucCD敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中，上游同源臂的长度应为493bp，下游同源臂的长度应为622bp，敲除片段的总长应为1112bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1112bp，原菌PCR扩增片段长度应为2037bp。
表1 菌株构建过程中所涉及的所有引物(按正文出现顺序逐一编号)
实施例2：5L发酵罐中发酵生产L-茶氨酸
1、培养基
斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠2.5g/L，琼脂25g/L，pH 7.0；
种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨15g/L，氯化钠15g/L，pH 7.2。
发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，pH 7.2。
斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；
2、发酵方法
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在20-30％之间，培养6h；
发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD600＝20时开始以30mL/h的速率流加2mol/L的乙胺溶液至发酵结束，发酵周期20h，发酵进程图见附图6。
3、检测方法
使用高效液相色谱，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6mm×150mm，5-Micron)，流动相为乙酸钠缓冲液，50％乙腈，柱温33℃，流速1mL/min，检测波长360nm，采用二元梯度分析。样品经衍生化后进行色谱检测。取一定量的标品和发酵样品进行检测，色谱图见附图7和8，L-茶氨酸的产量可达40g/L，糖酸转化率可达到25％。
实施例3
5L发酵罐中不同乙胺流加方式对L-茶氨酸发酵的影响
培养基和检测方法见实施例2
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在20-30％之间，培养6h；
发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L。当OD600＝15-25时开始以15-30mL/h的速率流加2-4mol/L的乙胺溶液至发酵结束，发酵周期20h。具体流加方式和发酵结果如表2所示。
表2 5L发酵罐中不同乙胺流加方式对L-茶氨酸发酵的影响
从表2中可以看出，乙胺添加过早或浓度过高，容易影响菌体的正常生长，导致菌体的产酶和产酸能力下降。而乙胺添加过晚或浓度过低，会导致菌体生长过于旺盛，使得更多的碳代谢用于生物量的积累，从而降低了产量和糖酸转化率。因此，合理的乙胺流加方式是保证L-茶氨酸产量和转化率的关键。
序列表
<110> 天津科技大学
河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2947
<212> DNA
<213> T7噬菌体的RNA聚合酶基因(Unknown)
<400> 1
gagataattc acaagtgtgc gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa 60
ttcctcgaag agaaaaatgc aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat 120
aaatcaagaa ataaaccaaa aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc 180
tgtttagttg ctaaaaattg gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc 240
ctctaactac agaaggccct acaccatggg atttactaac tggaagaggc actaaatgaa 300
cacgattaac atcgctaaga acgacttctc tgacatcgaa ctggctgcta tcccgttcaa 360
cactctggct gaccattacg gtgagcgttt agctcgcgaa cagttggccc ttgagcatga 420
gtcttacgag atgggtgaag cacgcttccg caagatgttt gagcgtcaac ttaaagctgg 480
tgaggttgcg gataacgctg ccgccaagcc tctcatcact accctactcc ctaagatgat 540
tgcacgcatc aacgactggt ttgaggaagt gaaagctaag cgcggcaagc gcccgacagc 600
cttccagttc ctgcaagaaa tcaagccgga agccgtagcg tacatcacca ttaagaccac 660
tctggcttgc ctaaccagtg ctgacaatac aaccgttcag gctgtagcaa gcgcaatcgg 720
tcgggccatt gaggacgagg ctcgcttcgg tcgtatccgt gaccttgaag ctaagcactt 780
caagaaaaac gttgaggaac aactcaacaa gcgcgtaggg cacgtctaca agaaagcatt 840
tatgcaagtt gtcgaggctg acatgctctc taagggtcta ctcggtggcg aggcgtggtc 900
ttcgtggcat aaggaagact ctattcatgt aggagtacgc tgcatcgaga tgctcattga 960
gtcaaccgga atggttagct tacaccgcca aaatgctggc gtagtaggtc aagactctga 1020
gactatcgaa ctcgcacctg aatacgctga ggctatcgca acccgtgcag gtgcgctggc 1080
tggcatctct ccgatgttcc aaccttgcgt agttcctcct aagccgtgga ctggcattac 1140
tggtggtggc tattgggcta acggtcgtcg tcctctggcg ctggtgcgta ctcacagtaa 1200
gaaagcactg atgcgctacg aagacgttta catgcctgag gtgtacaaag cgattaacat 1260
tgcgcaaaac accgcatgga aaatcaacaa gaaagtccta gcggtcgcca acgtaatcac 1320
caagtggaag cattgtccgg tcgaggacat ccctgcgatt gagcgtgaag aactcccgat 1380
gaaaccggaa gacatcgaca tgaatcctga ggctctcacc gcgtggaaac gtgctgccgc 1440
tgctgtgtac cgcaaggaca aggctcgcaa gtctcgccgt atcagccttg agttcatgct 1500
tgagcaagcc aataagtttg ctaaccataa ggccatctgg ttcccttaca acatggactg 1560
gcgcggtcgt gtttacgctg tgtcaatgtt caacccgcaa ggtaacgata tgaccaaagg 1620
actgcttacg ctggcgaaag gtaaaccaat cggtaaggaa ggttactact ggctgaaaat 1680
ccacggtgca aactgtgcgg gtgtcgataa ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat 1740
tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg cgctaagtct ccactggaga acacttggtg 1800
ggctgagcaa gattctccgt tctgcttcct tgcgttctgc tttgagtacg ctggggtaca 1860
gcaccacggc ctgagctata actgctccct tccgctggcg tttgacgggt cttgctctgg 1920
catccagcac ttctccgcga tgctccgaga tgaggtaggt ggtcgcgcgg ttaacttgct 1980
tcctagtgaa accgttcagg acatctacgg gattgttgct aagaaagtca acgagattct 2040
acaagcagac gcaatcaatg ggaccgataa cgaagtagtt accgtgaccg atgagaacac 2100
tggtgaaatc tctgagaaag tcaagctggg cactaaggca ctggctggtc aatggctggc 2160
ttacggtgtt actcgcagtg tgactaagcg ttcagtcatg acgctggctt acgggtccaa 2220
agagttcggc ttccgtcaac aagtgctgga agataccatt cagccagcta ttgattccgg 2280
caagggtctg atgttcactc agccgaatca ggctgctgga tacatggcta agctgatttg 2340
ggaatctgtg agcgtgacgg tggtagctgc ggttgaagca atgaactggc ttaagtctgc 2400
tgctaagctg ctggctgctg aggtcaaaga taagaagact ggagagattc ttcgcaagcg 2460
ttgcgctgtg cattgggtaa ctcctgatgg tttccctgtg tggcaggaat acaagaagcc 2520
tattcagacg cgcttgaacc tgatgttcct cggtcagttc cgcttacagc ctaccattaa 2580
caccaacaaa gatagcgaga ttgatgcaca caaacaggag tctggtatcg ctcctaactt 2640
tgtacacagc caagacggta gccaccttcg taagactgta gtgtgggcac acgagaagta 2700
cggaatcgaa tcttttgcac tgattcacga ctccttcggt accattccgg ctgacgctgc 2760
gaacctgttc aaagcagtgc gcgaaactat ggttgacaca tatgagtctt gtgatgtact 2820
ggctgatttc tacgaccagt tcgctgacca gttgcacgag tctcaattgg acaaaatgcc 2880
agcacttccg gctaaaggta acttgaacct ccgtgacatc ttagagtcgg acttcgcgtt 2940
cgcgtaa 2947
<210> 2
<211> 1335
<212> DNA
<213> γ-谷氨酰甲胺合成酶基因(Unknown)
<400> 2
atgaaaagtc tggaagaagc tcagaagttc ctggaggacc accatgtgaa atacgtgctg 60
gcccagtttg tggacatcca cggcgtggca aaagttaaaa gcgtgccggc aagccatctg 120
aacgatattc tgaccaccgg tgcaggcttt gccggtggtg ccatttgggg taccggtatt 180
gccccgaatg gtccggatta catggccatt ggcgaactga gcacactgag cctgattccg 240
tggcaaccgg gctatgcacg tctggtgtgt gatggtcatg tgaatggcaa gccgtacgag 300
tttgacaccc gcgttgttct gaaacagcag atcgcacgtc tggccgagaa aggctggacc 360
ctgtataccg gtctggagcc tgagtttagc ctgctgaaga aagacgagca tggcgcagtg 420
cacccgttcg atgacagcga tacactgcag aaaccgtgct acgactacaa aggcatcacc 480
cgtcatagcc cgttcctgga aaagctgacc gaaagcctgg tggaggttgg cctggatatc 540
taccagatcg atcacgagga cgcaaatggc cagttcgaaa tcaattacac ctatgccgat 600
tgcctgaaaa gtgccgacga ctatattatg tttaagatgg cagcaagcga gattgccaac 660
gaactgggca tcatctgcag cttcatgccg aaaccgttca gtaaccgccc tggtaatggc 720
atgcatatgc acatgagcat tggcgacggc aagaaaagcc tgtttcagga cgacagcgat 780
ccgagtggcc tgggtctgag caagctggcc tatcatttcc tgggcggtat tctggcacat 840
gcaccggcac tggcagccgt ttgtgcccct accgtgaaca gctacaagcg cctggttgtt 900
ggtcgtagcc tgagtggtgc cacctgggcc ccggcataca tcgcatacgg caacaacaac 960
cgtagcacac tggttcgcat cccgtatggc cgtctggaac tgcgtctgcc ggacggtagc 1020
tgtaacccgt acctggccac cgcagcagtg attgcagccg gcttagatgg tgttgcacgc 1080
gaattagacc cgggtaccgg tcgtgatgat aatctgtacg attacagtct ggaacagctg 1140
gccgagtttg gcatcggcat tctgccgcag aatttaggtg aagccctgga cgccctggaa 1200
gccgatcagg tgattatgga tgccatgggt cctggcctga gcaaggaatt cgtggagctg 1260
aagcgtatgg agtgggttga ctatatgcgc cacgtgagcg actgggaaat caatcgctat 1320
gtgcagttct attaa 1335
<210> 3
<211> 2706
<212> DNA
<213> pGRB(Unknown)
<400> 3
ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagttgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 60
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 120
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 180
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 240
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 300
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 360
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 420
ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accgagctcg 480
aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 540
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 600
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcagtttta 660
gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 720
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 780
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 840
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 900
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 960
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 1020
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 1080
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 1140
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 1200
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 1260
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 1320
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 1380
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 1440
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 1500
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 1560
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 1620
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1680
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 1740
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgtgacc 1800
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 1860
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 1920
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 1980
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 2040
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 2100
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 2160
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 2220
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 2280
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 2340
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 2400
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 2460
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 2520
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 2580
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 2640
cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 2700
cgaggc 2706
<210> 4
<211> 15466
<212> DNA
<213> pREDCas9(Unknown)
<400> 4
ctgctcgcgc aggctgggtg ccaagctctc gggtaacatc aaggcccgat ccttggagcc 60
cttgccctcc cgcacgatga tcgtgccgtg atcgaaatcc agatccttga cccgcagttg 120
caaaccctca ctgatccgca tgcggatctt gctgtaggca taggcttggt tatgccggta 180
ctgccgggcc tcttgcggga ttacgaaatc atcctgtgga gcttagtagg tttagcaaga 240
tggcagcgcc taaatgtaga atgataaaag gattaagaga ttaatttccc taaaaatgat 300
aaaacaagcg ttttgaaagc gcttgttttt ttggtttgca gtcagagtag aatagaagta 360
tcaaaaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta gccttatttt 420
aacttgctat gctgttttga atggttccaa caagattatt ttataacttt tataacaaat 480
aatcaaggag aaattcaaag aaatttatca gccataaaac aatacttaat actatagaat 540
gataacaaaa taaactactt tttaaaagaa ttttgtgtta taatctattt attattaagt 600
attgggtaat attttttgaa gagatatttt gaaaaagaaa aattaaagca tattaaacta 660
atttcggagg tcattaaaac tattattgaa atcatcaaac tcattatgga tttaatttaa 720
actttttatt ttaggaggca aaaatggata agaaatactc aataggctta gatatcggca 780
caaatagcgt cggatgggcg gtgatcactg atgaatataa ggttccgtct aaaaagttca 840
aggttctggg aaatacagac cgccacagta tcaaaaaaaa tcttataggg gctcttttat 900
ttgacagtgg agagacagcg gaagcgactc gtctcaaacg gacagctcgt agaaggtata 960
cacgtcggaa gaatcgtatt tgttatctac aggagatttt ttcaaatgag atggcgaaag 1020
tagatgatag tttctttcat cgacttgaag agtctttttt ggtggaagaa gacaagaagc 1080
atgaacgtca tcctattttt ggaaatatag tagatgaagt tgcttatcat gagaaatatc 1140
caactatcta tcatctgcga aaaaaattgg tagattctac tgataaagcg gatttgcgct 1200
taatctattt ggccttagcg catatgatta agtttcgtgg tcattttttg attgagggag 1260
atttaaatcc tgataatagt gatgtggaca aactatttat ccagttggta caaacctaca 1320
atcaattatt tgaagaaaac cctattaacg caagtggagt agatgctaaa gcgattcttt 1380
ctgcacgatt gagtaaatca agacgattag aaaatctcat tgctcagctc cccggtgaga 1440
agaaaaatgg cttatttggg aatctcattg ctttgtcatt gggtttgacc cctaatttta 1500
aatcaaattt tgatttggca gaagatgcta aattacagct ttcaaaagat acttacgatg 1560
atgatttaga taatttattg gcgcaaattg gagatcaata tgctgatttg tttttggcag 1620
ctaagaattt atcagatgct attttacttt cagatatcct aagagtaaat actgaaataa 1680
ctaaggctcc cctatcagct tcaatgatta aacgctacga tgaacatcat caagacttga 1740
ctcttttaaa agctttagtt cgacaacaac ttccagaaaa gtataaagaa atcttttttg 1800
atcaatcaaa aaacggatat gcaggttata ttgatggggg agctagccaa gaagaatttt 1860
ataaatttat caaaccaatt ttagaaaaaa tggatggtac tgaggaatta ttggtgaaac 1920
taaatcgtga agatttgctg cgcaagcaac ggacctttga caacggctct attccccatc 1980
aaattcactt gggtgagctg catgctattt tgagaagaca agaagacttt tatccatttt 2040
taaaagacaa tcgtgagaag attgaaaaaa tcttgacttt tcgaattcct tattatgttg 2100
gtccattggc gcgtggcaat agtcgttttg catggatgac tcggaagtct gaagaaacaa 2160
ttaccccatg gaattttgaa gaagttgtcg ataaaggtgc ttcagctcaa tcatttattg 2220
aacgcatgac aaactttgat aaaaatcttc caaatgaaaa agtactacca aaacatagtt 2280
tgctttatga gtattttacg gtttataacg aattgacaaa ggtcaaatat gttactgaag 2340
gaatgcgaaa accagcattt ctttcaggtg aacagaagaa agccattgtt gatttactct 2400
tcaaaacaaa tcgaaaagta accgttaagc aattaaaaga agattatttc aaaaaaatag 2460
aatgttttga tagtgttgaa atttcaggag ttgaagatag atttaatgct tcattaggta 2520
cctaccatga tttgctaaaa attattaaag ataaagattt tttggataat gaagaaaatg 2580
aagatatctt agaggatatt gttttaacat tgaccttatt tgaagatagg gagatgattg 2640
aggaaagact taaaacatat gctcacctct ttgatgataa ggtgatgaaa cagcttaaac 2700
gtcgccgtta tactggttgg ggacgtttgt ctcgaaaatt gattaatggt attagggata 2760
agcaatctgg caaaacaata ttagattttt tgaaatcaga tggttttgcc aatcgcaatt 2820
ttatgcagct gatccatgat gatagtttga catttaaaga agacattcaa aaagcacaag 2880
tgtctggaca aggcgatagt ttacatgaac atattgcaaa tttagctggt agccctgcta 2940
ttaaaaaagg tattttacag actgtaaaag ttgttgatga attggtcaaa gtaatggggc 3000
ggcataagcc agaaaatatc gttattgaaa tggcacgtga aaatcagaca actcaaaagg 3060
gccagaaaaa ttcgcgagag cgtatgaaac gaatcgaaga aggtatcaaa gaattaggaa 3120
gtcagattct taaagagcat cctgttgaaa atactcaatt gcaaaatgaa aagctctatc 3180
tctattatct ccaaaatgga agagacatgt atgtggacca agaattagat attaatcgtt 3240
taagtgatta tgatgtcgat cacattgttc cacaaagttt ccttaaagac gattcaatag 3300
acaataaggt cttaacgcgt tctgataaaa atcgtggtaa atcggataac gttccaagtg 3360
aagaagtagt caaaaagatg aaaaactatt ggagacaact tctaaacgcc aagttaatca 3420
ctcaacgtaa gtttgataat ttaacgaaag ctgaacgtgg aggtttgagt gaacttgata 3480
aagctggttt tatcaaacgc caattggttg aaactcgcca aatcactaag catgtggcac 3540
aaattttgga tagtcgcatg aatactaaat acgatgaaaa tgataaactt attcgagagg 3600
ttaaagtgat taccttaaaa tctaaattag tttctgactt ccgaaaagat ttccaattct 3660
ataaagtacg tgagattaac aattaccatc atgcccatga tgcgtatcta aatgccgtcg 3720
ttggaactgc tttgattaag aaatatccaa aacttgaatc ggagtttgtc tatggtgatt 3780
ataaagttta tgatgttcgt aaaatgattg ctaagtctga gcaagaaata ggcaaagcaa 3840
ccgcaaaata tttcttttac tctaatatca tgaacttctt caaaacagaa attacacttg 3900
caaatggaga gattcgcaaa cgccctctaa tcgaaactaa tggggaaact ggagaaattg 3960
tctgggataa agggcgagat tttgccacag tgcgcaaagt attgtccatg ccccaagtca 4020
atattgtcaa gaaaacagaa gtacagacag gcggattctc caaggagtca attttaccaa 4080
aaagaaattc ggacaagctt attgctcgta aaaaagactg ggatccaaaa aaatatggtg 4140
gttttgatag tccaacggta gcttattcag tcctagtggt tgctaaggtg gaaaaaggga 4200
aatcgaagaa gttaaaatcc gttaaagagt tactagggat cacaattatg gaaagaagtt 4260
cctttgaaaa aaatccgatt gactttttag aagctaaagg atataaggaa gttaaaaaag 4320
acttaatcat taaactacct aaatatagtc tttttgagtt agaaaacggt cgtaaacgga 4380
tgctggctag tgccggagaa ttacaaaaag gaaatgagct ggctctgcca agcaaatatg 4440
tgaatttttt atatttagct agtcattatg aaaagttgaa gggtagtcca gaagataacg 4500
aacaaaaaca attgtttgtg gagcagcata agcattattt agatgagatt attgagcaaa 4560
tcagtgaatt ttctaagcgt gttattttag cagatgccaa tttagataaa gttcttagtg 4620
catataacaa acatagagac aaaccaatac gtgaacaagc agaaaatatt attcatttat 4680
ttacgttgac gaatcttgga gctcccgctg cttttaaata ttttgataca acaattgatc 4740
gtaaacgata tacgtctaca aaagaagttt tagatgccac tcttatccat caatccatca 4800
ctggtcttta tgaaacacgc attgatttga gtcagctagg aggtgactga agtatatttt 4860
agatgaagat tatttcttaa taactaaaaa tatggtataa tactcttaat aaatgcagta 4920
atacaggggc ttttcaagac tgaagtctag ctgagacaaa tagtgcgatt acgaaatttt 4980
ttagacaaaa atagtctacg aggttttaga gctatgctgt tttgaatggt cccaaaactg 5040
cagcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta aaatctagcg agggctttac 5100
taagctccgc aaaaaacccc gcccctgaca gggcggggtt ttttcgcgcc cgatccttgg 5160
agcccttgcc ctcccgcacg atgatcgtgc cgtgatcgaa atccagatcc ttgacccgca 5220
gttgcaaacc ctcactgatc cgcatgctta tgacaacttg acggctacat cattcacttt 5280
ttcttcacaa ccggcacgga actcgctcgg gctggccccg gtgcattttt taaatacccg 5340
cgagaaatag agttgatcgt caaaaccaac attgcgaccg acggtggcga taggcatccg 5400
ggtggtgctc aaaagcagct tcgcctggct gatacgttgg tcctcgcgcc agcttaagac 5460
gctaatccct aactgctggc ggaaaagatg tgacagacgc gacggcgaca agcaaacatg 5520
ctgtgcgacg ctggcgatat caaaattgct gtctgccagg tgatcgctga tgtactgaca 5580
agcctcgcgt acccgattat ccatcggtgg atggagcgac tcgttaatcg cttccatgcg 5640
ccgcagtaac aattgctcaa gcagatttat cgccagcagc tccgaatagc gcccttcccc 5700
ttgcccggcg ttaatgattt gcccaaacag gtcgctgaaa tgcggctggt gcgcttcatc 5760
cgggcgaaag aaccccgtat tggcaaatat tgacggccag ttaagccatt catgccagta 5820
ggcgcgcgga cgaaagtaaa cccactggtg ataccattcg cgagcctccg gatgacgacc 5880
gtagtgatga atctctcctg gcgggaacag caaaatatca cccggtcggc aaacaaattc 5940
tcgtccctga tttttcacca ccccctgacc gcgaatggtg agattgagaa tataaccttt 6000
cattcccagc ggtcggtcga taaaaaaatc gagataaccg ttggcctcaa tcggcgttaa 6060
acccgccacc agatgggcat taaacgagta tcccggcagc aggggatcat tttgcgcttc 6120
agccatactt ttcatactcc cgccattcag agaagaaacc aattgtccat attgcatcag 6180
acattgccgt cactgcgtct tttactggct cttctcgcta accaaaccgg taaccccgct 6240
tattaaaagc attctgtaac aaagcgggac caaagccatg acaaaaacgc gtaacaaaag 6300
tgtctataat cacggcagaa aagtccacat tgattatttg cacggcgtca cactttgcta 6360
tgccatagca tttttatcca taagattagc ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact 6420
ctctactgtt tctccatgta ggtcgttcgc tccaagcgtt ttagagctag aaatagcaag 6480
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accagacccc gttgatgata 6540
ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct cgagttttag agctatgctg 6600
ttttgaatgg tcccaaaact tcagcacact gagacttgtt gagttccatg ttttagagct 6660
atgctgtttt gaatggactg tcgagccatt caacattgcc gatgataact tgagaaagag 6720
ggttaatacc agcagtcgga taccttccta ttctttctgt taaagcgttt tcatgttata 6780
ataggcaaaa gaagagtagt gtgatcgtcc attccgacgt cgagccgttc catacagaag 6840
ctgggcgaac aaacgatgct cgccttccag aaaaccgagg atgcgaacca cttcatccgg 6900
ggtcagcacc accggcaagc gccgcgacgg ccgaggtctt ccgatctcct gaagccaggg 6960
cagatccgtg cacagcacct tgccgtagaa gaacagcaag gccgccaatg cctgacgatg 7020
cgtggagacc gaaaccttgc gctcgttcgc cagccaggac agaaatgcct cgacttcgct 7080
gctgcccaag gttgccgggt gacgcacacc gtggaaacgg atgaaggcac gaacccagtg 7140
gacataagcc tgttcggttc gtaagctgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg 7200
gtccagaacc ttgaccgaac gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg 7260
ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta 7320
cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg 7380
ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact 7440
atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt 7500
gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac 7560
ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac 7620
ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca 7680
cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca 7740
gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat 7800
cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact 7860
ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg 7920
gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat 7980
ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat 8040
ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctagacagg cttatcttgg 8100
acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg tccactacgt 8160
gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg 8220
ccgcttcgcg gcgcggctta actcaagcgt tagatgcact aagcacataa ttgctcacag 8280
ccaaactatc aggtcaagtc tgcttttatt atttttaagc gtgcataata agccctacac 8340
aaattgggag atatatcatg aaaggctggc tttttcttgt tatcgcaata gttggcgaag 8400
taatcgcaac atccgcatta aaatctagcg agggctttac taagctcctg cagagatctg 8460
aattccctag agagacgaaa gtgattgcgc ctacccggat attatcgtga ggatgcgtca 8520
tcgccattgc tccccaaata caaaaccaat ttcagccagt gcctcgtcca ttttttcgat 8580
gaactccggc acgatctcgt caaaactcgc catgtacttt tcatcccgct caatcacgac 8640
ataatgcagg ccttcacgct tcatacgcgg gtcatagttg gcaaagtacc aggcattttt 8700
tcgcgtcacc cacatgctgt actgcacctg ggccatgtaa gctgacttta tggcctcgaa 8760
accaccgagc cggaacttca tgaaatcccg ggaggtaaac gggcatttca gttcaaggcc 8820
gttgccgtca ctgcataaac catcgggaga gcaggcggta cgcatacttt cgtcgcgata 8880
gatgatcggg gattcagtaa cattcacgcc ggaagtgaat tcaaacaggg ttctggcgtc 8940
gttctcgtac tgttttcccc aggccagtgc tttagcgtta acttccggag ccacaccggt 9000
gcaaacctca gcaagcaggg tgtggaagta ggacattttc atgtcaggcc acttctttcc 9060
ggagcggggt tttgctatca cgttgtgaac ttctgaagcg gtgatgacgc cgagccgtaa 9120
tttgtgccac gcatcatccc cctgttcgac agctctcaca tcgatcccgg tacgctgcag 9180
gataatgtcc ggtgtcatgc tgccaccttc tgctctgcgg ctttctgttt caggaatcca 9240
agagctttta ctgcttcggc ctgtgtcagt tctgacgatg cacgaatgtc gcggcgaaat 9300
atctgggaac agagcggcaa taagtcgtca tcccatgttt tatccagggc gatcagcaga 9360
gtgttaatct cctgcatggt ttcatcgtta accggagtga tgtcgcgttc cggctgacgt 9420
tctgcagtgt atgcagtatt ttcgacaatg cgctcggctt catccttgtc atagatacca 9480
gcaaatccga aggccagacg ggcacactga atcatggctt tatgacgtaa catccgtttg 9540
ggatgcgact gccacggccc cgtgatttct ctgccttcgc gagttttgaa tggttcgcgg 9600
cggcattcat ccatccattc ggtaacgcag atcggatgat tacggtcctt gcggtaaatc 9660
cggcatgtac aggattcatt gtcctgctca aagtccatgc catcaaactg ctggttttca 9720
ttgatgatgc gggaccagcc atcaacgccc accaccggaa cgatgccatt ctgcttatca 9780
ggaaaggcgt aaatttcttt cgtccacgga ttaaggccgt actggttggc aacgatcagt 9840
aatgcgatga actgcgcatc gctggcatca cctttaaatg ccgtctggcg aagagtggtg 9900
atcagttcct gtgggtcgac agaatccatg ccgacacgtt cagccagctt cccagccagc 9960
gttgcgagtg cagtactcat tcgttttata cctctgaatc aatatcaacc tggtggtgag 10020
caatggtttc aaccatgtac cggatgtgtt ctgccatgcg ctcctgaaac tcaacatcgt 10080
catcaaacgc acgggtaatg gattttttgc tggccccgtg gcgttgcaaa tgatcgatgc 10140
atagcgattc aaacaggtgc tggggcaggc ctttttccat gtcgtctgcc agttctgcct 10200
ctttctcttc acgggcgagc tgctggtagt gacgcgccca gctctgagcc tcaagacgat 10260
cctgaatgta ataagcgttc atggctgaac tcctgaaata gctgtgaaaa tatcgcccgc 10320
gaaatgccgg gctgattagg aaaacaggaa agggggttag tgaatgcttt tgcttgatct 10380
cagtttcagt attaatatcc attttttata agcgtcgact gtttcctgtg tgaaattgtt 10440
atccgctcac aattccacac attatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 10500
cctaatgagt gagaattcgg atctcgacgg gatgttgatt ctgtcatggc atatccttac 10560
aacttaaaaa agcaaaaggg ccgcagatgc gacccttgtg tatcaaacaa gacgattaaa 10620
aatcttcgtt agtttctgct acgccttcgc tatcatctac agagaaatcc ggcgttgagt 10680
tcgggttgct cagcagcaac tcacgtactt tcttctcgat ctctttcgcg gtttccgggt 10740
tatctttcag ccaggcagtc gcattcgctt taccctgacc gatcttctca cctttgtagc 10800
tgtaccacgc gcctgctttc tcgatcagct tctcttttac gcccaggtca accagttcgc 10860
cgtagaagtt gataccttcg ccgtagagga tctggaattc agcctgttta aacggcgcag 10920
cgattttgtt cttcaccact ttcacgcggg tttcgctacc caccacgttt tcgccctctt 10980
tcaccgcgcc gatacgacgg atgtcgagac gaacagaggc gtagaatttc agcgcgttac 11040
caccggtagt ggtttccggg ttaccgaaca tcacaccaat tttcatacgg atctggttga 11100
tgaagatcag cagcgtgttg gactgcttca ggttacccgc cagcttacgc atcgcctggc 11160
tcatcatacg tgccgcaagg cccatgtgag agtcgccgat ttcgccttcg atttccgctt 11220
tcggcgtcag tgccgccacg gagtcaacga cgataacgtc tactgcgcca gaacgcgcca 11280
gggcgtcaca gatttccagt gcctgctcgc cggtgtccgg ctgggagcac agcaggttgt 11340
cgatatcgac gcccagttta cgtgcgtaga ttgggtccag cgcgtgttca gcatcgataa 11400
acgcacaggt tttaccttca cgctgcgctg cggcgatcac ctgcagcgtc agcgtggttt 11460
taccggaaga ttccggtccg tagatttcga cgatacggcc catcggcaga ccacctgccc 11520
caagcgcgat atccagtgaa agcgaaccgg tagagatggt ttccacatcc atggaacggt 11580
cttcacccag gcgcatgatg gagcctttac caaattgttt ctcaatctgg cccagtgctg 11640
ccgccaacgc tttctgtttg ttttcgtcga tagccatttt tactcctgtc atgccgggta 11700
ataccggata gtcaatatgt tctgttgaag caattatact gtatgctcat acagtatcaa 11760
gtgttttgta gaaattgttg ccacaaggtc tgcaatgcat acgcagtagc ctgacgacgc 11820
accgcatcac ggtcgccgct gaagcatccc gccgggtaat gccttcaccg cgggcagtgg 11880
caaaagcaaa ccagacggtg ccgacaggct tctctagatc cgcctacctt tcacgagttg 11940
cgcagtttgt ctgcaagact ctatgagaag cagataagcg ataagtttgc tcaacatctt 12000
ctcgggcata agtcggacac catggcatca cagtatcgtg atgacagagg cagggagtgg 12060
gacaaaattg aaatcaaata atgattttat tttgactgat agtgacctgt tcgttgcaac 12120
aaattgataa gcaatgccaa gcttggcact ggctgatcag ctagctcact gcccgctttc 12180
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 12240
ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg 12300
attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc 12360
cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc 12420
ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat 12480
ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat 12540
gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc 12600
ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg 12660
cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa 12720
tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt 12780
gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc 12840
cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg 12900
cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga 12960
caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga 13020
cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc 13080
cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt 13140
ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata 13200
agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct 13260
gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc accattcgat 13320
gctagcccat gggtatggac agttttccct ttgatatgta acggtgaaca gttgttctac 13380
ttttgtttgt tagtcttgat gcttcactga tagatacaag agccataaga acctcagatc 13440
cttccgtatt tagccagtat gttctctagt gtggttcgtt gtttttgcgt gagccatgag 13500
aacgaaccat tgagatcata cttactttgc atgtcactca aaaattttgc ctcaaaactg 13560
gtgagctgaa tttttgcagt taaagcatcg tgtagtgttt ttcttagtcc gttacgtagg 13620
taggaatctg atgtaatggt tgttggtatt ttgtcaccat tcatttttat ctggttgttc 13680
tcaagttcgg ttacgagatc catttgtcta tctagttcaa cttggaaaat caacgtatca 13740
gtcgggcggc ctcgcttatc aaccaccaat ttcatattgc tgtaagtgtt taaatcttta 13800
cttattggtt tcaaaaccca ttggttaagc cttttaaact catggtagtt attttcaagc 13860
attaacatga acttaaattc atcaaggcta atctctatat ttgccttgtg agttttcttt 13920
tgtgttagtt cttttaataa ccactcataa atcctcatag agtatttgtt ttcaaaagac 13980
ttaacatgtt ccagattata ttttatgaat ttttttaact ggaaaagata aggcaatatc 14040
tcttcactaa aaactaattc taatttttcg cttgagaact tggcatagtt tgtccactgg 14100
aaaatctcaa agcctttaac caaaggattc ctgatttcca cagttctcgt catcagctct 14160
ctggttgctt tagctaatac accataagca ttttccctac tgatgttcat catctgagcg 14220
tattggttat aagtgaacga taccgtccgt tctttccttg tagggttttc aatcgtgggg 14280
ttgagtagtg ccacacagca taaaattagc ttggtttcat gctccgttaa gtcatagcga 14340
ctaatcgcta gttcatttgc tttgaaaaca actaattcag acatacatct caattggtct 14400
aggtgatttt aatcactata ccaattgaga tgggctagtc aatgataatt actagtcctt 14460
ttcctttgag ttgtgggtat ctgtaaattc tgctagacct ttgctggaaa acttgtaaat 14520
tctgctagac cctctgtaaa ttccgctaga cctttgtgtg ttttttttgt ttatattcaa 14580
gtggttataa tttatagaat aaagaaagaa taaaaaaaga taaaaagaat agatcccagc 14640
cctgtgtata actcactact ttagtcagtt ccgcagtatt acaaaaggat gtcgcaaacg 14700
ctgtttgctc ctctacaaaa cagaccttaa aaccctaaag gcttaagtag caccctcgca 14760
agctcggttg cggccgcaat cgggcaaatc gctgaatatt ccttttgtct ccgaccatca 14820
ggcacctgag tcgctgtctt tttcgtgaca ttcagttcgc tgcgctcacg gctctggcag 14880
tgaatggggg taaatggcac tacaggcgcc ttttatggat tcatgcaagg aaactaccca 14940
taatacaaga aaagcccgtc acgggcttct cagggcgttt tatggcgggt ctgctatgtg 15000
gtgctatctg actttttgct gttcagcagt tcctgccctc tgattttcca gtctgaccac 15060
ttcggattat cccgtgacag gtcattcaga ctggctaatg cacccagtaa ggcagcggta 15120
tcatcaacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 15180
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 15240
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 15300
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 15360
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 15420
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccg 15466
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> UP-lacI-lacZ-S(Unknown)
<400> 5
acaacaactg gcgggcaaac 20
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> UP-lacI-lacZ-A(Unknown)
<400> 6
cgagcgcaca cttgtgaatt atctccgccg agacagaact taatggg 47
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> DN-lacI-lacZ-S(Unknown)
<400> 7
aaataccttg atactgtgcc ggcaggtagc agagcgggta aactggctcg gatt 54
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> DN-lacI-lacZ-A(Unknown)
<400> 8
ggatttcctt acgcgaaata cg 22
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> T7RNAP-S(Unknown)
<400> 9
cccattaagt tctgtctcgg cggagataat tcacaagtgt gcgctcg 47
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> T7RNAP-A(Unknown)
<400> 10
aatccgagcc agtttacccg ctctgctacc tgccggcaca gtatcaaggt attt 54
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-lacI-lacZ-S(Unknown)
<400> 11
agtcctaggt ataatactag tcagccgata gcggaacggg agttttagag ctagaa 56
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-lacI-lacZ-A(Unknown)
<400> 12
ttctagctct aaaactcccg ttccgctatc ggctgactag tattatacct aggact 56
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> UP-yghX-S(Unknown)
<400> 13
gcgcaacgta gaacaggaat t 21
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> UP-yghX-A(Unknown)
<400> 14
taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattagatt gaagcgcctt 60
tactactcc 69
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> DN-yghX-S(Unknown)
<400> 15
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggtcata gtaatccagc aactcttgtg 60
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> DN-yghX-A(Unknown)
<400> 16
gagcaggtat ttacgtgaac cg 22
<210> 17
<211> 71
<212> DNA
<213> gmas-S(Unknown)
<400> 17
tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatga aaagtctgga 60
agaagctcag a 71
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> gmas -A(Unknown)
<400> 18
agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttaata gaactgcaca tagcgattga 60
<210> 19
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-yghX-S(Unknown)
<400> 19
agtcctaggt ataatactag tggtgcctga cgaccataaa agttttagag ctagaa 56
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-yghX-A(Unknown)
<400> 20
ttctagctct aaaactttta tggtcgtcag gcaccactag tattatacct aggact 56
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> UP-yeeP-S(Unknown)
<400> 21
ggtcaggagg taacttatca gcg 23
<210> 22
<211> 64
<212> DNA
<213> UP-yeeP-A(Unknown)
<400> 22
taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattaatgg cagggctccg 60
tttt 64
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> DN-yeeP-S(Unknown)
<400> 23
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggaactg gattttcttc tgaacctgt 59
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> DN-yeeP-A(Unknown)
<400> 24
acgatgtcag cagccagca 19
<210> 25
<211> 71
<212> DNA
<213> gmas -S(Unknown)
<400> 25
tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatga aaagtctgga 60
agaagctcag a 71
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> gmas -A(Unknown)
<400> 26
agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttaata gaactgcaca tagcgattga 60
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-yeeP-S(Unknown)
<400> 27
agtcctaggt ataatactag tacagaatat tcgcgaaaaa agttttagag ctagaa 56
<210> 28
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-yeeP-A(Unknown)
<400> 28
ttctagctct aaaacttttt tcgcgaatat tctgtactag tattatacct aggact 56
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> UP-xylR-S(Unknown)
<400> 29
tactcggcgg aatgtttatg g 21
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> UP-xylR-A(Unknown)
<400> 30
aggtggttga aatcagcaga ctgttcccct acgccttcta ctacc 45
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> DN-xylR-S(Unknown)
<400> 31
ggtagtagaa ggcgtagggg aacagtctgc tgatttcaac cacct 45
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> DN-xylR-A(Unknown)
<400> 32
gtcactaacc tgaatacgca ccc 23
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> gRNA-xylR-S(Unknown)
<400> 33
caactttttg cccgctatgg 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> UP-sucCD-A(Unknown)
<400> 34
ccagtttacc ttccagaccc ag 22
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> DN-sucCD-S(Unknown)
<400> 35
attatcacca tcactgaagg catc 24
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> DN-sucCD-A(Unknown)
<400> 36
ggcgagggct atttcttatt aca 23
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> DN-sucCD-S(Unknown)
<400> 37
attatcacca tcactgaagg catc 24
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> DN-sucCD-A(Unknown)
<400> 38
ggcgagggct atttcttatt aca 23
<210> 39
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-sucCD-S(Unknown)
<400> 39
agtcctaggt ataatactag tcccgctggt catcaccaaa cgttttagag ctagaa 56
<210> 40
<211> 56
<212> DNA
<213> gRNA-sucCD-A(Unknown)
<400> 40
ttctagctct aaaacgtttg gtgatgacca gcgggactag tattatacct aggact 56

Claims (9)

1.一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌，其特征在于：在大肠杆菌Escherichia coliW3110基因组上单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，该基因由木糖启动子控制；双拷贝来源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，该基因由T7启动子控制；敲除木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。
2.一种用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：步骤如下：
(1)在大肠杆菌Escherichia coli W3110基因组上lacI-lacZ位点单拷贝来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，核苷酸序列见序列表1，该基因由木糖启动子PxylF控制；
(2)在Escherichia coli W3110基因组上yghX及yeeP位点双拷贝来源于Methylovorusmays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，核苷酸序列见序列表2，该基因经过密码子优化并由T7启动子控制；
(3)敲除Escherichia coliW3110的木糖操纵子阻遏蛋白基因xylR，解除木糖启动子受到的反馈调节作用；
(4)敲除Escherichia coli W3110的琥珀酰CoA合成酶基因sucCD，增加α-酮戊二酸到谷氨酸的代谢流量。
3.根据权利要求2所述的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤(1)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其lacI-lacZ基因的上下序列设计上游同源臂引物UP-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表5)、UP-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表6)和下游同源臂引物DN-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表7)、DN-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表8)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得T7RNAP基因序列，其中包含木糖启动子PxylF，根据其T7RNAP基因序列设计引物T7RNAP-S(核苷酸序列见序列表9)、T7RNAP-A(核苷酸序列见序列表10)，并PCR扩增T7RNAP片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得T7RNAP基因的整合片段(上游同源臂-PxylF-T7RNAP-下游同源臂)。设计引物gRNA-lacI-lacZ-S(核苷酸序列见序列表11)和gRNA-lacI-lacZ-A(核苷酸序列见序列表12)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-lacI-lacZ。将整合片段和pGRB-lacI-lacZ电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-lacI-lacZ。
4.根据权利要求2所述的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤(2)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yghX-S(核苷酸序列见序列表13)、UP-yghX-A(核苷酸序列见序列表14)和下游同源臂引物DN-yghX-S(核苷酸序列见序列表15)、DN-yghX-A(核苷酸序列见序列表16)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表17)、gmas-A(核苷酸序列见序列表18)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yghX-S(核苷酸序列见序列表19)和gRNA-yghX-A(核苷酸序列见序列表20)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yghX。将整合片段和pGRB-yghX电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coliW3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghX。
5.根据权利要求2所述的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤(2)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yeeP基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(核苷酸序列见序列表21)、UP-yeeP-A(核苷酸序列见序列表22)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(核苷酸序列见序列表23)、DN-yeeP-A(核苷酸序列见序列表24)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得gmas基因序列，根据gmas基因设计引物gmas-S(核苷酸序列见序列表25)、gmas-A(核苷酸序列见序列表26)，并扩增gmas基因片段，启动子T7则设计在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中；上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂)。设计引物gRNA-yeeP-S(核苷酸序列见序列表27)和gRNA-yeeP-A(核苷酸序列见序列表28)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP。
6.根据权利要求2所述的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤(3)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其xylR基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-xylR-S(核苷酸序列见序列表29)、UP-xylR-A(核苷酸序列见序列表30)和下游同源臂引物DN-xylR-S(核苷酸序列见序列表31)、DN-xylR-A(核苷酸序列见序列表32)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得xylR基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-xylR-S(核苷酸序列见序列表33)和gRNA-xylR-A(核苷酸序列见序列表34)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-xylR。将敲除片段和pGRB-xylR电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-xylR。
7.根据权利要求2所述的用于L-茶氨酸生产的基因工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤(4)是以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其sucCD基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-sucCD-S(核苷酸序列见序列表35)、UP-sucCD-A(核苷酸序列见序列表36)和下游同源臂引物DN-sucCD-S(核苷酸序列见序列表37)、DN-sucCD-A(核苷酸序列见序列表38)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得sucCD基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。设计引物gRNA-sucCD-S(核苷酸序列见序列表39)和gRNA-sucCD-A(核苷酸序列见序列表40)扩增包含靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体(核苷酸序列见序列表3)重组后获得重组的pGRB-sucCD。将敲除片段和pGRB-sucCD电转化至含有pREDCas9载体(核苷酸序列见序列表4)的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-sucCD和pREDCas9。
8.一种采用权利要求1所述用于L-茶氨酸生产的基因工程菌发酵生产L-茶氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：
斜面培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加800g/L的葡萄糖溶液并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜2g/L，当OD600＝15-25时开始以15-30mL/h的速率流加2-4mol/L的乙胺溶液至发酵结束，发酵周期18-20h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，氯化钠1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，pH 7.0-7.2。种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨10-20g/L，氯化钠10-20g/L，pH 7.0-7.2。发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨10-20g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁1-2g/L，pH 7.0-7.2。
CN201811215068.6A 2018-10-18 2018-10-18 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法 Active CN109370966B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811215068.6A CN109370966B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811215068.6A CN109370966B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109370966A true CN109370966A (zh) 2019-02-22
CN109370966B CN109370966B (zh) 2020-04-24

Family

ID=65400937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811215068.6A Active CN109370966B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109370966B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109777763A (zh) * 2019-03-29 2019-05-21 天津科技大学 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
CN110564789A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法
CN110643559A (zh) * 2019-09-03 2020-01-03 宁夏伊品生物科技股份有限公司 提高l-色氨酸生产效率的转运载体基因在大肠杆菌中的应用
CN113774075A (zh) * 2021-09-30 2021-12-10 天津科技大学 一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产l-茶氨酸的方法
CN114874959A (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 天津科技大学 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用
CN117821356A (zh) * 2024-03-05 2024-04-05 天津科技大学 一种提高l-茶氨酸从头发酵产量和转化率的基因工程菌株、方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068713A1 (en) * 2005-05-09 2009-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing gamma-glutamylamide compounds
CN106893699A (zh) * 2015-12-21 2017-06-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种粗酶制剂、其制备方法及应用
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068713A1 (en) * 2005-05-09 2009-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing gamma-glutamylamide compounds
CN106893699A (zh) * 2015-12-21 2017-06-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种粗酶制剂、其制备方法及应用
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAMAMOTO S.等: "Theanine production by coupled fermentation with energy transfer using gammaglutamylmethylamide synthetase of Methylovorus mays No. 9.", 《BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM.》 *
李元等: "PPK和GMAS共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用", 《生物工程学报》 *
李元等: "酶催化合成L-茶氨酸的研究进展", 《食品科学》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109777763A (zh) * 2019-03-29 2019-05-21 天津科技大学 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
CN109777763B (zh) * 2019-03-29 2020-06-30 天津科技大学 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
CN110643559A (zh) * 2019-09-03 2020-01-03 宁夏伊品生物科技股份有限公司 提高l-色氨酸生产效率的转运载体基因在大肠杆菌中的应用
CN110564789A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法
CN110564789B (zh) * 2019-09-12 2021-05-04 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法
CN113774075A (zh) * 2021-09-30 2021-12-10 天津科技大学 一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产l-茶氨酸的方法
US11453898B1 (en) 2021-09-30 2022-09-27 Henan Julong Biological Engineering Co., Ltd Genetically engineered bacterium of Escherichia coli and method for fermentation production of L-theanine thereof
CN113774075B (zh) * 2021-09-30 2023-08-08 天津科技大学 一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产l-茶氨酸的方法
CN114874959A (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 天津科技大学 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用
CN114874959B (zh) * 2022-04-27 2024-04-16 天津科技大学 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用
CN117821356A (zh) * 2024-03-05 2024-04-05 天津科技大学 一种提高l-茶氨酸从头发酵产量和转化率的基因工程菌株、方法和应用
CN117821356B (zh) * 2024-03-05 2024-06-04 天津科技大学 一种提高l-茶氨酸从头发酵产量和转化率的基因工程菌株、方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109370966B (zh) 2020-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109370966B (zh) 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
CN104342410B (zh) 一种酮还原酶突变体及其制备方法
CN113584134B (zh) 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用
CN104342406B (zh) 热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法
CN104694452B (zh) 一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
CN104342411B (zh) 活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法
CN104342412B (zh) 用于生产(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体
CN111635907B (zh) 一种构建虾青素生产菌的方法
CN113122513B (zh) 一种丹参p450突变体及其应用
CN115161251B (zh) 一种根瘤菌hh103的多基因突变体及应用
CN113755518B (zh) 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用
CN113846019B (zh) 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法
CN101492685A (zh) 一种重组表达载体的基因序列及其构建方法
CN110431232B (zh) 用于提取和扩增核酸的试剂
CN114085868A (zh) 一种打靶载体、重组Huh7细胞系及构建方法和应用
CN109337851B (zh) 一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法
CN108517326A (zh) 一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法
CN107475279B (zh) 苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体构建方法及应用
CN109055413B (zh) 一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用
CN113122512B (zh) 一种用于制备丹参酮类化合物的丹参p450突变体
CN113528450B (zh) 一种水稻原生质体高效生物素标记体系的建立及应用
CN109182241A (zh) 一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用
CN113025651B (zh) 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用
KR102422842B1 (ko) 크리스퍼 간섭을 이용한 rna 번역 조절용 조성물
Soldan plasmid maps: from Macro to Micro: a combined bioluminescence-fluorescence approach to monitor bacterial localization

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant