CN106893699A - 一种粗酶制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种粗酶制剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种粗酶制剂、其制备方法及应用，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。发明首次构建了包含γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因和磷酸激酶编码基因的重组载体，将该重组载体转化宿主菌，获得工程菌株，发酵该工程菌株可获得包含γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的粗酶制剂。

Description

一种粗酶制剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种粗酶制剂、其制备方法及应用，特别涉及一种通过基因克隆表达制备的粗酶制剂及其用于合成茶氨酸的应用。
背景技术
L-茶氨酸(C7H14O3N2，又称γ-谷氨酰乙胺)是茶叶中所含的一种特殊氨基酸，具有多种用途：在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等；在保健食品中用于镇静放松、改善睡眠、抗疲劳、提高学习记忆能力等；在医药领域已用于降低血压、预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等。因此L-茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛的需求。
酶法是近年来合成L-茶氨酸的新趋势。目前，专利和文献所报道的生产L-茶氨酸的酶主要有CN 102181501 A和CN 103409475 A公开了γ-谷氨酰转肽酶，CN 1688705 A和JP 2007185132 A公开了谷氨酰胺酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71(2),545-552”公开了谷氨酰胺合成酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”和CN 104212757 A公开了γ-谷氨酰甲胺合成酶，都具有生产生产L-茶氨酸的功能。与传统的化学方法相比，酶催化制备方法效率高、专一性强、反应条件温和，是一种理想的制备L-茶氨酸的方法。但是γ-谷氨酰转肽酶和谷氨酰胺酶所用底物谷氨酰胺价格相对昂贵，且会使该底物水解，需要添加过量的另一种底物乙胺来抑制。谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶可转化价格低廉的谷氨酸钠和等当量的乙胺合成L-茶氨酸，但其为耗能反应，需要消耗当量的ATP。目前有“Biosci.Biotechnol.Biochem.2005,69,784-789；Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”报道利用酵母发酵能量循环来解决这一问题。
除酵母体系外，通过酶催化也可实现ATP再生，且酶法ATP再生效率高、不需考虑透膜问题、反应体系简单、易控。而目前尚无将ATP特异性再生的酶应用于茶氨酸合成体系的报道。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种粗酶制剂、其制备方法及应用，所述粗酶制剂能够催化合成茶氨酸并同时实现反应中ATP再生。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种粗酶制剂，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；
其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。
本发明中，将γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶克隆在同一个载体上，磷酸激酶能将ADP转换为ATP，为γ-谷氨酰甲胺合成酶生产L-茶氨酸提供一部分所需的ATP，达到ATP的再生循环利用。
本发明粗酶制剂中，γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活为500-1000U/g，磷酸激酶的酶活为1000-2000U/g；其中，酶活单位分别定义如下：1Uγ-谷氨酰甲胺合成酶为37℃下每分钟催化生成1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需的酶量；1U磷酸激酶为30℃下每分钟催化生成1mg ATP所需的酶量。
作为优选技术方案，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays。
优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichia coli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。
优选地，所述粗酶制剂的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。
所述核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：
ATGATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGACGCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGAGTCGACAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTGGAAGAAGCACAAAAGTTTCTGGAAGACCACCATGTCAAGTATGTCCTGGCACAGTTCGTCGATATTCACGGCGTTGCTAAAGTGAAGAGCGTTCCGGCGTCTCATCTGAATGATATTCTGACCACGGGTGCAGGTTTTGCAGGCGGTGCTATTTGGGGTACCGGTATCGCACCGAACGGTCCGGATTATATGGCAATTGGTGAACTGAGTACGCTGTCCCTGATCCCGTGGCAGCCGGGTTATGCACGTCTGGTCTGCGACGGCCACGTGAATGGTAAACCGTATGAATTTGATACCCGTGTGGTTCTGAAACAGCAAATTGCACGTCTGGCAGAAAAGGGTTGGACCCTGTATACGGGTCTGGAACCGGAATTTTCACTGCTGAAAAAGGATGAACATGGCGCGGTGCACCCGTTCGATGACTCGGACACGCTGCAAAAACCGTGTTATGATTACAAGGGTATTACCCGCCATAGCCCGTTTCTGGAAAAACTGACGGAATCTCTGGTTGAAGTCGGCCTGGACATTTATCAGATCGATCACGAAGACGCCAATGGTCAATTTGAAATCAACTATACCTACGCCGATTGCCTGAAAAGTGCAGATGACTACATTATGTTCAAGATGGCGGCCTCCGAAATCGCGAACGAACTGGGTATTATCTGTAGTTTTATGCCGAAACCGTTCTCCAATCGTCCGGGCAACGGTATGCACATGCACATGTCAATTGGCGACGGTAAAAAGTCGCTGTTTCAGGATGACTCAGATCCGTCGGGCCTGGGTCTGAGTAAACTGGCTTATCATTTCCTGGGCGGTATCCTGGCACACGCACCGGCACTGGCAGCTGTTTGCGCACCGACCGTCAATTCTTACAAACGTCTGGTCGTGGGTCGCAGCCTGTCTGGTGCTACCTGGGCTCCGGCGTATATTGCGTACGGCAACAATAACCGTAGCACGCTGGTTCGCATCCCGTATGGCCGTCTGGAACTGCGCCTGCCGGATGGTTCTTGTAACCCGTACCTGGCAACCGCAGCAGTGATTGCAGCTGGTCTGGACGGTGTTGCACGTGAACTGGATCCGGGCACGGGTCGCGATGACAATCTGTATGATTACAGCCTGGAACAGCTGGCCGAATTTGGCATTGGTATCCTGCCGCAAAACCTGGGTGAAGCACTGGATGCTCTGGAAGCGGACCAGGTCATCATGGATGCGATGGGCCCGGGTCTGTCCAAAGAATTTGTTGAACTGAAGCGCATGGAATGGGTGGACTATATGCGTCATGTGTCGGACTGGGAAATCAACCGCTATGTTCAATTCTACTGA。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段编码如第一方面所述的粗酶制剂。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
所述载体可选用T7启动子和lac操纵子序列。
优选地，所述表达载体包括启动子、第一核糖体结合位点、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第一终止子、第二核糖体结合位点、磷酸激酶和第二终止子。
优选地，所述表达载体为pET-21a(+)。
优选地，所述表达载体包括第一启动子、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第一终止子、第二启动子、磷酸激酶和第二终止子或第一启动子、磷酸激酶和第一终止子、第二启动子、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第二终止子。
优选地，所述表达载体为pETDuet-1。
第四方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的粗酶制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆到同一表达载体上，将该表达载体转化到宿主细胞中，发酵得到的工程菌株，经细胞破碎、冷冻干燥后得到所述冻干粉粗酶制剂。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的粗酶制剂、如第二方面所述的DNA片段、如第三方面所述的表达载体和如第四方面所述的宿主细胞在制备L-茶氨酸的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次构建了包含γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因和磷酸激酶编码基因的重组载体，将该重组载体转化宿主菌，获得工程菌株，发酵该工程菌株可获得包含γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的粗酶制剂；
(2)本发明所获得的粗酶制剂既能高效利用谷氨酸钠和乙胺合成L-茶氨酸，又能实现ATP的再生，使反应中ATP的添加量从1.0eq降低至0.05-0.1eq；
(4)本发明用所获得的粗酶制剂进行生物转化L-茶氨酸，能降低生产中使用的总的酶量，进而降低成本，为今后充分利用低成本的谷氨酸钠工业化生产L-茶氨酸提供了有效的催化剂。
附图说明
图1是本发明构建成功的pET21a(+)-ppk+gmas重组质粒的双酶切电泳图；
图2是本发明重组质粒pET21a(+)-ppk+gmas的图谱；
图3是本发明SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1基因工程菌种的构建
(1)pET21a(+)-ppk的构建
用质粒抽提试剂盒抽提质粒pET-21a(+)，用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切质粒2h，酶切体系为：质粒50μL，10×buffer 10μL，NdeI 3μL，SalI 3μL，水34μL，电泳回收5.4kb的pET-21a(+)片段。
用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切合成的含有磷酸激酶(US20050287627 A1，SEQ ID NO 125)编码基因ppk的质粒2h，酶切体系同上，电泳回收1kb的ppk片段。
将上述回收得到的5.4kb的pET-21a(+)片段与1kb的ppk片段在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，结果如图1所示，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示构建成功。
(2)pET21a(+)-ppk+gmas的构建
将上述构建成功的pET21a(+)-ppk载体用HindIII在37℃水浴中酶切，酶切体系为：质粒50μL，10×buffer 10μL，HindIII 4μL，水36μL，1.5h后加入2μL碱性磷酸酶继续孵育0.5h，回收酶切产物。
使用下列引物从合成的含有γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因gmas(来源于Methylovorus mays NO.9，DDBJ登录号AB333782)的质粒PCR扩增gmas片段，PCR反应体系为：5×PCR buffer 10μL，dNTP 4μL，引物gmas-F和gmas-R(10μM)各2μL，模板0.5μL，HS DNA Polymerase 0.5μL，加水补足至50μL条件为：94℃5min；94℃45s，58℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。电泳鉴定后直接纯化回收GMAS片段。
gmas-F：CCCAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTG GAAGAAGCAC
gmas-R：CCCAAGCTTTCAGTAGAATTGAACATAGCGGTTG
将扩增获得的gmas片段用HindIII单酶切，电泳回收后与上述HindIII单酶切并去磷酸化的pET21a(+)-ppk载体在T4连接酶的作用下于22℃连接5h，连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示构建成功，质粒图谱如图2所示。
(3)基因工程菌株的构建
将构建的重组质粒pET21a(+)-ppk+gmas用氯化钙法转化入宿主菌BL21(DE3)，LB试管培养过夜，质粒抽提试剂盒抽提质粒，将正确的克隆子BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams保存。
实施例2重组蛋白的表达
挑取重组菌BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1％的接种量转接于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8，20℃IPTG诱导(终浓度0.1mM)过夜，离心收集细胞，20mM磷酸钠缓冲液(PH 8.0)重悬细胞，超声破碎，离心后将上清冷冻干燥得到的冻干粉粗酶制剂，蛋白表达情况如图3所示。
从图3可以看出，制备的粗酶制剂包含大小分别为38kDa和49kDa的两种蛋白，与预计的相符。
实施例3酶活测定
使用下列方法测定实施例2中所得冻干粉的酶活：
γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活测定检测体系为：3mL反应体系中包含终浓度为50mM谷氨酸钠、15mM盐酸羟胺、7.5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)、30mM六水合氯化镁和100mM咪唑缓冲液(pH 8.0)，在30℃下加入适量粗酶制剂酶液，反应30min后，加入1mL GS显色剂(3.32g三氯乙酸、6.06g三氯化铁和5mL浓盐酸溶于水中，定容至100mL)终止反应，在分光光度计540nm出测定吸光度。该条件下每分钟生成1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需的酶量定义为1U。
磷酸激酶的酶活检测体系为：1mL反应体系中包含终浓度为5mM二磷酸腺苷二钠(ADP)、50mM六偏磷酸钠、100mM六水合氯化镁、50mM磷酸铵和50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，在37℃下加入适量粗酶制剂酶液，反应30min后，加入等体积的乙腈终止反应，离心，取上清用HPLC测定ATP的生成量。
HPLC检测条件如下：
色谱柱：Hypersil ODS25μm colunm(4.6mm x 250mm)
检测波长：254nm
流速：0.8mL/min
流动相：磷酸钾缓冲液(50mM,pH 6.5)/乙腈＝(98/2，V:V)
温度：30℃
该条件下每分钟生成1mg ATP所需的酶量定义为1U。
结果显示，所述冻干粉的γ-谷氨酰甲胺合成酶酶活为800U/g；磷酸激酶酶活为1500U/g。
实施例4酶法转化生产茶氨酸
在50mL反应瓶中依次加入终浓度为50mM谷氨酸钠、50mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0)，加水溶解使终体积为10mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入50mg本发明制备的粗酶制剂。在37℃、200rpm下反应24h后，取样进行HPLC分析，检测条件为：UV 210nm检测；流动相：醋酸铵缓冲液(5mM，pH 6.0)/甲醇＝25/75，v:v。
结果显示，L-茶氨酸的转化率为94％，ee值>99％。
实施例5酶法转化生产茶氨酸
在50mL反应瓶中依次加入终浓度为100mM谷氨酸钠、100mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0)，加水溶解使终体积为10mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入50mg本发明制备的粗酶制剂。在37℃、200rpm下反应24h后，取样进行HPLC分析，检测条件同实施例4。
结果显示，转化率为88％，ee值>99％。
综上所述，本发明的粗酶制剂能够生产L-茶氨酸，转化率达到85％以上，ee值达到99％以上，满足L-茶氨酸生产需要，能降低ATP的用量，节约成本，为今后充分利用低成本的谷氨酸钠工业化生产L-茶氨酸提供了有效的催化剂。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种粗酶制剂，其特征在于，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；
其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。
2.根据权利要求1所述的粗酶制剂，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays；
优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichia coli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的粗酶制剂，其特征在于，所述粗酶制剂的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。
4.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码如权利要求1-3中任一项所述的粗酶制剂。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括启动子、第一核糖体结合位点、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第一终止子、第二核糖体结合位点、磷酸激酶和第二终止子；
优选地，所述表达载体为pET-21a(+)。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括第一启动子、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第一终止子、第二启动子、磷酸激酶和第二终止子或第一启动子、磷酸激酶和第一终止子、第二启动子、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第二终止子；
优选地，所述表达载体为pETDuet-1。
8.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5-7中任一项所述的表达载体。
9.一种如根据权利要求1-3中任一项所述的粗酶制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆到同一表达载体上，将该表达载体转化到宿主细胞中，发酵得到的工程菌株，经细胞破碎、冷冻干燥后得到所述冻干粉粗酶制剂。
10.一种如权利要求1-3中任一项所述的粗酶制剂、如权利要求4所述的DNA片段、如权利要求5-7中任一项所述的表达载体和权利要求8所述的宿主细胞在制备L-茶氨酸的用途。
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