CN1167804C - 尿苷二磷酸-n-乙酰葡糖胺的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用微生物菌体，由尿苷酸(UMP)和N-乙酰葡糖胺制备尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)的方法中，以使N-乙酰葡糖胺激酶共存为特征的UDPAG的制备方法。利用本发明，即使在以N-乙酰葡糖胺为底物的情况下，也能够有效地制备UDPAG。

Description

尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制备方法

技术领域

本发明涉及作为低聚糖合成的重要底物的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)的制备方法。

背景技术

近年，随着对糖链研究的急速进行，其功能正日趋明朗，具有生理活性的低聚糖医药品或功能性材料的用途开发正倍受瞩目。但是，现在市售的低聚糖的种类很有限，而且价格昂贵。此外，这种低聚糖仅以试剂规模制备，不一定能够大量生产。

以往，低聚糖的制备采用从天然物中提取的抽取法，化学合成法或酶合成法，或同时使用上述方法，其中，酶合成法适合于大规模生产。即，(1)酶合成法无需化学合成法所需要的保护、脱保护等复杂的工序，就能够快速地合成作为目的产物的低聚糖；(2)利用酶的底物特异性，在合成结构特异性很高的低聚糖时比其他方法有利。而且，近年由于基因重组DNA技术的发展，能够以较低的成本大规模生产各种合成酶，使酶合成法的优越性更为显著。

用酶合成法合成低聚糖的方法包括利用低聚糖水解酶的逆反应的方法及利用转糖基酶的方法这两种。前者具有可利用单价较便宜的单糖作为底物的优点，但反应本身是利用分解反应的逆反应，所以，从合成收率和用于合成具有复杂结构的低聚糖等方面考虑，该方法并不是最佳方法。

另一方面，后者是使用了转糖基酶的合成法，从合成收率和用于合成具有复杂结构的低聚糖等方面考虑，该方法比前一种方法更好。此外，近年随着基因重组DNA技术的进步，各种转糖基酶的大规模生产也随着该技术的发展而发展。

但是，使用转糖基酶的合成法中所用的供糖体糖核苷酸除了一部分之外，其他的价格仍较高，目前的供应量仅在试剂水平。虽有报道说也可用耐渗透压性酵母法来生产在大多数具有生理活性的糖链核心部位中的N-乙酰葡糖胺的供体UDPAG(日本专利公开公报平8-23993号)，但真正实现工业化生产还很值得探讨。

本发明者们对在酵母中的UDPAG生物合成路线进行详细探讨的结果是，葡糖胺经过葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸，被活化为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的一系列反应路线中，从葡糖胺-6-磷酸到N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的乙酰化反应是决定反应速度的阶段。所以，一般认为如果以N-乙酰葡糖胺-6-磷酸为底物，就能够提高uDPAG的合成效率，但是，目前还不可能以较低的价格大量获得上述物质。

因此，如果使用目前以较低价格能够大量获得的N-乙酰葡糖胺为底物，就无需经过作为决定反应速度阶段的乙酰化反应，这是一种比葡糖胺更理想的底物。对

仓等报道的以尿苷酸(UMP)和N-乙酰葡糖胺为底物，用酵母制备UDPAG的方法(日本专利昭49-8278号， 仓法)进行了探讨。以N-乙酰葡糖胺为底物的方法获得的UDPAG的量少于以葡糖胺为底物的方法，或完全不生成，或UDPAG产量极少，这再次验证了 仓等的报告。

因此，本发明的目的是提供即使在以N-乙酰葡糖胺为底物的情况下，也能够以良好收率制备UDPAG的方法。

发明的揭示

本发明者们为达到上述目的进行研究的结果是，(1)酵母中几乎没有使N-乙酰葡糖胺磷酸化的酶活性，即使有也极其微弱，所以，N-乙酰葡糖胺不能够作为底物使用，但如果反应体系中还存在使N-乙酰葡糖胺磷酸化的酶N-乙酰葡糖胺激酶就能够有效合成UDPAG；(2)通过进一步添加N-乙酰葡糖胺-磷酸变位酶及/或尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，能够比仅有N-乙酰葡糖胺激酶的情况下更有效地生成UDPAG；(3)通过使用N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，能够由尿苷三磷酸(UTP)有效地合成UDPAG，从而完成了本发明。

即，本发明提供了在用微生物菌体，由UMP及N-乙酰葡糖胺制备UDPA的方法中，以共存了N-乙酰葡糖胺激酶为特征的UDPAG的制备方法。

本发明进一步提供了在用酶，由N-乙酰葡糖胺制备UDPAG的制备方法中，并用了N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶为特征的UDPAG的制备方法。

对附图的简单说明

图l表示使来源于Bacillus stearothermophilus ATCC15952的N-乙酰葡糖胺激酶共存时的UDPAG产量的经时变化。

图2表示使来源于大肠杆菌IAM1268的N-乙酰葡糖胺激酶共存时的UDPAG产量的经时变化。

图3表示使来源于Klebsiella planticola IFO3317的N-乙酰葡糖胺激酶共存时的UDPAG产量的经时变化。

图4表示使来源于枯草杆菌M168株的重组N-乙酰葡糖胺激酶共存时的UDPAG产量的经时变化。

图5表示使来源于枯草杆菌M168株的重组N-乙酰葡糖胺激酶、来源于面包酵母的重组N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或来源于大肠杆菌E102株的重组UDPAG焦磷酸化酶共存时的UDPAG产量的经时变化。图中，(1)表示酵母和N-乙酰葡糖胺激酶共存时的结果；(2)表示酵母、N-乙酰葡糖胺激酶和N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶共存时的结果；(3)表示酵母、N-乙酰葡糖胺激酶和UDPAG焦磷酸化酶共存时的结果；(4)表示酵母、N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶和UDPAG焦磷酸化酶共存时的结果。

图6表示使来源于枯草杆菌M168株的重组N-乙酰葡糖胺激酶、来源于面包酵母的重组N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或来源于大肠杆菌E102株的重组UDPAG焦磷酸化酶共存时的UDPAG产量的经时变化。

实施发明的最佳状态

如上所述，本发明涉及在用微生物菌体，由UMP及N-乙酰葡糖胺制备UDPAG的方法中，共存了N-乙酰葡糖胺激酶的UDPAG的制备方法。

反应时所用的微生物菌体只要是可用于制备糖核苷酸的菌体即可，对其没有特别的限定。具体包括酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、球拟酵母菌属(Torulopsis)、汉逊酵母菌属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)等来源于酵母的菌体。这些酵母菌体可以是活酵母菌体、干燥酵母菌体中的任一种，从反应收率、原料来源的难易性考虑，最好是使用干燥酵母菌体。

添加在反应体系中的N-乙酰葡糖胺激酶可以来自动物、植物、微生物等，对其来源没有特别的限定，可使用任何来源的酶。但是，从制备酶时的简便性考虑，最好是使用来源于微生物的酶。

N-乙酰葡糖胺激酶普遍存在于念珠菌属(Candida)(Biochemica et BiophysicaActa，614，350(1980))、链球菌属(Steptococcus)(Method in Enzymology，9，415(1966))、埃舍里希氏杆菌属(Escherichia)(Method in Enzymology，9，421(1966))、芽胞杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)等大多数微生物中，能够容易地从培养菌体制备得到。

此外，按照常用方法克隆N-乙酰葡糖胺激酶基因，使其在微生物菌体内大量表达这种重组DNA法也能够制备出N-乙酰葡糖胺激酶。

添加到反应体系中的N-乙酰葡糖胺激酶只要具有有关活性即可，对其形态没有特别限定。具体来讲，可使用微生物菌体、该菌体的处理物或由该处理物获得的酶制剂等。

微生物菌体的制备可使用能使该微生物生长发育的培养基，按照常用方法培养后，通过离心分离等收集菌体。以Bacillus stearothermophilus或Klebsiellaplanticola属细菌为例进行具体说明。可使用的培养液有肉汤培养基、LB培养基(1％胰化胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2×YT培养基(1.6％胰化胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等。在上述培养基中接种后，在约30～50℃的温度下，根据需要搅拌约10～50小时进行培养，然后，离心分离所得培养液，收集微生物菌体，就能够制得具有N-乙酰葡糖胺激酶活性的微生物菌体。

作为微生物的菌体处理物，可使用经过机械破碎(利用卷绒混合机、法式压力机、均化器、乳钵等)，冻融，自溶，干燥(冷冻干燥、风干等)，酶处理(利用溶菌酶等)，超声波处理，化学处理(酸、碱处理等)等普通处理方法处理而获得的菌体破坏物或菌体细胞壁或细胞膜的变性物。

制备酶制剂，可使用常用的酶精制手段(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂的沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)对来源于上述菌体处理物的具有酶活性的部分进行处理从而获得粗酶或精制酶。

对由微生物菌体制备N-乙酰葡糖胺激酶的方法进行具体说明，即，对收集到的菌体进行超声波处理，使菌体破碎，然后，使菌体破碎液离心，获得上清液，在该上清液中添加硫酸铵，回收约30～54％的饱和硫铵部分。使回收到的沉淀脱盐后，利用离子交换层析法、凝胶层析法等各种层析法进行处理，浓缩N-乙酰葡糖胺激酶活性部分，脱盐后就能够获得作为目的产物的酶制剂。

最好是在反应液中添加约0.001单位/ml以上的N-乙酰葡糖胺激酶，特别好的是添加约0.001～100单位/ml。

本发明反应所用的UMP和N-乙酰葡糖胺可使用市售品。对使用浓度没有特别的限定，一般分别约为1～200mM，较好是设定在约10～100mM的范围内。

本发明中，最好是在反应体系中添加无机磷酸和能量源。无机磷酸可直接使用磷酸钾等，但最好是以磷酸缓冲液的形态使用。磷酸缓冲液的pH较好是设定在约6.0～9.0的范围内。对使用浓度没有特别限定，一般约在10～500mM的范围内，较好是设定在约100～300mM的范围内。作为能源，可使用葡萄糖、果糖等糖类及乙酸、柠檬酸等有机酸。

本发明的制备方法中，除了N-乙酰葡糖胺激酶之外，反应体系中还可添加共存N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或尿苷二磷酸-N-葡糖胺焦磷酸化酶，这样能够进一步提高UDPAG的收率。

共存于反应体系的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶或尿苷二磷酸-N-葡糖胺焦磷酸化酶可来源于动物、植物、微生物等，对其来源没有特别的限定，可使用任何来源的酶。但是，从与上述N-乙酰葡糖胺激酶同样的酶调制简便性等方面考虑，较好是使用来源于微生物的酶。此外，使用分别克隆上述酶的基因，使其在微生物菌体内大量表达这种重组DNA方法，也能够制得上述酶。

来源于微生物的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶除了酵母菌属(Saccharomyces)(European Journal ofBiochemistry，221，741(1994))，链孢霉属(Neurospoa)(Journal of Biological Chemistry，219，753(1956))，芽枝霉属(Blastocldiella)(Biochemica et Biophysica Acta，451，408(1976))微生物之外，还可使用从市售干燥面包酵母中分离出来的酵母菌等。

来源于微生物的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶包括埃舍里希氏杆菌属(Escherichia)(Journal ofBacteriology，175，6150(1993))，葡萄球菌属(Staphylococcus)(Journal of Biological Chemistry，234，1822(1959))，酵母菌属(Saccharomyces)(Agricultural Biological Chemistry，40，2275(1976))，链孢霉属(Neurospoa)(Can.J.Microbiology，25，1381(1979))的微生物，大肠杆菌等。

N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶与N-乙酰葡糖胺激酶一样，也普遍存在于大多数微生物中，能够容易地从培养菌体中调制。

添加在反应体系中的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶只要具备有关活性即可，对其形态没有限定。具体来讲，可使用微生物菌体、该菌体的处理物或来自该处理物的酶制剂等，可通过与前述N-乙酰葡糖胺激酶调制法同样的方法调制而得。

添加在反应液中的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶一般在约0.001单位/ml以上，特别好的是在约0.1～10单位/ml的范围内。

例如，在磷酸缓冲液中添加酵母、UMP、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰葡糖胺激酶，以及根据需要添加作为能源的糖类而形成的反应液中，任意添加N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，在约5-30℃的温度下，较好是约5～25℃的温度下，根据需要进行搅拌，使反应进行1～50小时左右，，就能够制得UDPAG。

利用糖核苷酸的常用分离精制手段(离子交换层析法、吸附层析法、盐析等)能够对所得UDPAG进行分离精制。

下面，对用N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，由UTP和N-乙酰葡糖胺制备UDPAG的方法进行说明。

添加到反应体系中的N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶可使用上述酶。

本发明反应所用的UTP和N-乙酰葡糖胺可使用市售品。使用浓度分别约为1～200mM，较好是设定在约10～100mM的范围内。

UDPAG的合成反应进行如下，例如，在pH约为6.0～9.0的酸性缓冲液中添加UTP和N-乙酰葡糖胺，然后，在该反应液中添加上述3种酶，含量约在0.001单位/ml以上，更好是在约0.001～100单位/ml的范围内，在约5～30℃的温度下，较好是约5～25℃，根据需要进行搅拌使反应进行约1～50小时。

如前所述，所得UDPAG可通过糖核苷酸的常用手段进行分离精制。

此外，本发明的方法中，还可用UTP生成体系代替UTP而共存于制备UDPAG的反应体系。

上述UTP生成体系只要是能够向反应体系提供UTP的体系即可，对其没有特别的限定，可从公知的方法，例如，用微生物菌体的方法，用酶的方法等中适当选择。

如果对UTP生成体系进行具体说明，以用微生物的方法为例，可利用来自乳清酸的UTP生成体系(日本专利公开公报平5-276974号)等。以用酶的方法为例，较好是同时使用UTP生成体系和ATP再生体系。即，能够利用使多磷酸激酶、腺苷酸激酶及多磷酸作用于腺苷酸(AMP)，使ATP再生，同时使尿苷酸激酶，及根据需要使核苷酸二磷酸激酶作用于UMP，生成UTP的体系等。

利用UTP生成体系的UDPAG合成反应的条件基本与上述UDPAG的合成反应条件一致，通过小规模试验确定UTP生成反应和UDPAG合成反应顺利进行的条件，就可适当确定最终反应条件。

实施例

以下，以实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于此。而且，实施例中，采用HPLC法对反应液中的UDPAG进行定量。即，分离时选用YMC公司的ODS-AQ312柱，洗脱液选用0.5M的磷酸钾溶液。DNA的调制、利用限制性酶进行的剪切、利用T4DNA连接酶进行的DNA连接，以及大肠菌的性状转变法都参照《分子克隆》(Maniatis等编，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York(1982))。所用的限制性酶、AmpliTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶由宝酒造株式会社生产。

实施例1

(1)N-乙酰葡糖胺激酶的调制

在10ml的2×YT(1.6％胰化胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)中接种一个接种环量的Bacillus stearothermophilus ATCC15952，于50℃振荡培养24小时。将其作为一级培养菌体接种于500ml烧瓶中的100ml 2×YT中，于50℃振荡培养18小时。通过离心分离从3升培养液中回收菌体，所得菌体悬浮于500ml的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。再以离心分离回收菌体并悬浮于300ml PEN(50mM磷酸缓冲液(pH7.6)、1mM EDTA、0.1mM N-乙酰葡糖胺)后，用超声波粉碎处理粉碎菌体。将离心分离获得的上清液作为粗酶溶液。

回收到的270ml粗酶溶液中N-乙酰葡糖胺激酶的活性为1.05单位/ml，比活性为0.07单位/mg蛋白质。在粗酶溶液中添加270ml 90％饱和度的硫酸铵溶液，低温放置1小时后，离心分离回收上清液。在回收液中加入135ml 90％饱和度的硫酸铵溶液，回收所得沉淀，并溶于30mlPEN，再对PEN进行透析，获得43.5ml粗酶液。该酶液中N-乙酰葡糖胺激酶的活性为4.5单位/ml，比活性为0.21单位/mg蛋白质。

N-乙酰葡糖胺激酶的活性是利用公知的方法(Method in Enzymology IX，p415-425(1966))测定后算出的值。

即，注入10mM N-乙酰葡糖胺溶液、500mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)、100mM ATP溶液、100mM氯化镁溶液各50μl后，添加50μl酶液，于37℃反应20～30分钟。另外，用水代替ATP溶液进行同样反应。

在反应液中加入5％硫酸锌溶液及150mM氢氧化钡溶液各500μl使反应停止，离心分离除去沉淀后，用另一容器提取上清液166μl，在其中添加33μl硼酸盐溶液(在50ml水中溶解4.95g硼酸，再用1N氢氧化钾将pH调整到9.1，最后加水至100ml)后，煮沸3分钟。

煮沸后，用水冷却至室温，然后，加入1ml DMBA试剂(将10g对二甲基氨基苯甲醛溶于100ml含有12.5％10N的盐酸的冰醋酸，使用前再用冰醋酸稀释10倍后获得的溶液)，于37℃放置20分钟后，用分光光度计测定其在585nm时的吸收值。由已知浓度的N-乙酰葡糖胺溶液的标准曲线算出反应液中残存N-乙酰葡糖胺量，将37℃时1分钟内消耗掉1μmole的N-乙酰葡糖胺的活性计为1个单位(unit)。

接着，用DEAE-トヨパ-ル650M(2.2×25cm柱)进行分离，回收以0-0.5M的食盐浓度梯度进行洗脱而获得的组分中的活性部分，获得47.5ml回收液。在其中添加95ml 90％饱和度的硫酸铵溶液，低温放置后，离心分离回收沉淀。使沉淀溶于15ml PEN中，并对PEN进行透析，获得21ml部分精制酶。该酶中的N-乙酰葡糖胺激酶活性为6.84单位/ml，比活性为0.99单位/mg蛋白质。

(2)UDPAG的合成

在含有20mM氯化镁、30mM 5′-UMP、20mM N-乙酰葡糖胺、100mM葡萄糖及含有规定活性的来源于Bacillus stearothermophilus ATCC15992的N-乙酰葡糖胺激酶制剂(部分精制酶)的10ml 200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中添加1g干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)，于20℃一边搅拌一边反应。

在不同时间对反应液进行分析的结果如图1所示。从图1可明显看出，当反应液中未添加N-乙酰葡糖胺激酶时，几乎没有UDPAG生成，而添加了N-乙酰葡糖胺激酶并反应6小时后，添加0.1单位/ml时反应液中生成9.2mM的UDPAG，添加0.2单位/ml时反应液中生成11.5mM的UDPAG。

实施例2

在含有20mM氯化镁、30mM 5′-UMP、20mM N-乙酰葡糖胺、100mM葡萄糖及2个单位的与实施例1的(1)同样调制而成的来源于大肠杆菌IAM1268的N-乙酰葡糖胺激酶的10ml 200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中添加1g干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)，于20℃一边搅拌一边反应。

在不同时间对反应液进行分析的结果如图2所示。从图2可明显看出，当反应液中未添加N-乙酰葡糖胺激酶时，完全没有UDPAG生成，而添加了N-乙酰葡糖胺激酶并反应8小时后，生成了7.3mM的UDPAG。

实施例3

在含有20mM氯化镁、30mM 5′-UMP、20mM N-乙酰葡糖胺、100mM葡萄糖及2个单位的与实施例1的(1)同样调制而成的来源于Klebsiella planticolaIFO3317的N-乙酰葡糖胺激酶的10ml 200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中添加1g干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)，于20℃一边搅拌一边反应。

在不同时间对反应液进行分析的结果如图3所示。从图3可明显看出，当反应液中未添加N-乙酰葡糖胺激酶时，完全没有UDPAG生成，而添加了N-乙酰葡糖胺激酶并反应8小时后，生成了7.8mM的UDPAG。

实施例4

使与实施例1具有同样组成的反应液1000ml反应24小时后，用盐酸将反应液的pH值调整到3.0，离心后回收上清液，对回收液中的UDPAG作定量分析，确认其中含有7.2gUDPAG。

实施例5

(1)编码来源于枯草杆菌的N-乙酰葡糖胺激酶的yqgR基因的克隆

按照齐藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))调制枯草杆菌M168株(东大·分子细胞生物学研究所·分子遗传育种部)的染色体DNA，以该DNA为模板，按照常用方法合成以下所示的2种引物DNA，用PCR法使枯草杆菌yqgR基因(Submitted to EMBL/GENEBANK/DDBJ DATABANKS、Accession No.D84432、小林等)扩增。

引物(A)：5′-TATCTAGAACCACATGATTGAAAAGGAGCA-3′

引物(B)：5′-TGAAGCTTCGCATTTCAACCTCCTATGCAG-3′

利用PCR法使yqgR基因扩增时，使用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制造的DNA热循环仪使反应液100μl(50mM氯化钾、10mM Tris盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1μg、引物(A)和(B)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5个单位)分别进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(55℃，1.5分钟)和延伸反应(72℃，3分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液对反应液进行处理，在水溶性部分添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文献(分子克隆，前述)的方法，通过琼脂糖凝胶电泳使沉淀回收的DNA分离，精制相当于1.0kb的DNA片段。用限制性酶XbaI及HindIII剪切该DNA，同样用限制性酶XbaI及HindIII消化质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司生产)，再通过T4DNA连接酶连接。利用连接反应液使大肠杆菌K12株IM109(宝酒造株式会社生产)进行性状转变，从所得耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTrcYQG-AB。pTrcYQG-AB是在pTrc99A的trc启动子下游的XbaI-HindIII剪切部位插入含有枯草杆菌yqgR结构基因及SD序列的XbaI-HindIIIDNA片段而获得的质粒。

(2)来源于枯草杆菌的yqgR基因产物的调制

将具有质粒pTrcYQC-AB的大肠杆菌JM109接种在100ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡培养。当菌数达到4×10⁸个/ml时，添加IPTG使培养液的最终浓度达到1mM，然后在37℃继续培养5小时。培养结束后，离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，使其悬浮于20ml缓冲液(50mM Tris盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶)中，于37℃保温1小时后，进行超声波处理，使菌体破碎，再通过离心分离(20,000×g，10分钟)除去菌体残渣。

将以上获得的上清部分作为酶标品，用实施例1记载的方法对酶标品中N-乙酰葡糖胺激酶活性进行测定，其结果和对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109)同列于下表。

                        表1

菌/质粒	N-乙酰葡糖胺激酶活性(Units/mg蛋白质)
		JM109/pTrc99A	0.012
JM109/pTrcYQG-AB	0.517

(3)UDPAG的合成

在5ml含有10mM氯化镁、50mM 5′-UMP、50mM N-乙酰葡糖胺、200mM葡萄糖的200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中添加上述(2)调制的具备规定活性量的N-乙酰葡糖胺激酶溶液及干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)0.5g，于16℃一边搅拌一边反应。

在反应过程中从反应液中取出0.2ml，煮沸5分钟后离心分离，将上清液稀释250倍后，用0.45μm的滤膜过滤，对所得物质进行HPLC分析。

在不同时间对反应液进行分析的结果如图4所示。从图4可明显看出，在未添加N-乙酰葡糖胺激酶的反应液中完全没有检测出UDPAG，而添加了该酶溶液并反应24小时后，添加0.2个单位时产生了12.2mM的UDPAG，添加1个单位时，产生了13.6mM的UDPAG。

实施例6

(1)来自酵母的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶基因的克隆

在YPD培养液中培养从オリエンタル酵母工业购入的干燥面包酵母，然后将分离出来的低聚酵母继续在YPD培养液中培养后，通过常用方法制备染色体DNA。以该DNA为模板，使用以下2种引物DNA通过PCR法使含有来自酵母的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶(EC 5，4，2，3)基因(agml)(Eur.J.Biochem.，221，741-747(1994))的DNA片段扩增。

引物(C)：5′-TTGGCTGTTTGCTTGCTTGCGT-3′

引物(D)：5′-CGATTGCAGAGCGAAACGACGAAA-3′

PCR反应使用与实施例5同样的反应组成和同样的反应器，进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(37℃，2分钟)和延伸反应(72℃，3分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，与实施例1同样从反应液中精制相当于2.2kb的DNA片段。以该DNA为模板，利用以下2种引物DNA通过PCR法使含有来自酵母的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶基因(agml)的DNA片段再度扩增。第2次的PCR反应条件与第1次相同。

引物(E)：5′-AAGGTTGATTACGAGCAATTGTGC-3′

引物(F)：5′-TCAAGCAGATGCCTTAACGTGCTC-3′

基因扩增后，利用与前述同样的方法精制1.7kb的DNA片段。然后，利用DNA平头试剂盒(宝酒造株式会社生产)使回收到的DNA末端成平头。用限制性酶NcoJ使该DNA消化后，通过T4DNA连接酶使其与末端为平头的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司生产)连接。利用该反应液使大肠杆菌K12株JM109进行性状转变，从所得耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTrc-agml，该质粒pTrc-agml是在pTrc99A的trc启动子下游的NcoJ剪切部位ATG插入酵母agml基因的起始密码子ATG而获得的质粒。此外，将所得的性状转变体命名为JM109″pTrc-agml″。

(2)来自酵母的N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶的调制

将JM109″pTrc-agml″在37℃的温度下，在25ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养一晚。然后，将其接种在500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃培养2小时后，添加IPTG使最终浓度达到1mM，于37℃继续培养5小时，然后在20℃培养一晚，培养结束后，离心分离回收菌体。将回收到的菌体悬浮于50mM咪唑缓冲液(pH6.8)中。使用ブランソン公司生产的超声波粉碎机(motel 450sonifer)将菌体粉碎后(50W，5分钟，3次)，以15,000rpm离心分离30分钟，回收可溶性部分(上清)。

将所得上清部分作为酶标品，测定该酶标品中的N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶活性。其结果和对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109)同列于以下的表2。

N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶活性是根据公知的文献(European Journal ofBiochemsitry，No.221，741(1994))，按照以下所示方法测定由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸向N-乙酰葡糖胺-6-磷酸转变的活性而算出的值。

即，在50mM咪唑(pH6.8)、100mM氯化钾、10mM氯化镁、0.1mM EDTA、20μM葡萄糖-1，6-二磷酸、2mM N-乙酰葡糖胺-1-磷酸中加入N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶标品，于30℃使其反应。另外，用水代替葡萄糖-1，6-二磷酸进行同样的反应。

然后，加入与反应液等量的1M硫酸溶液，使酶失活，煮沸10分钟后，冷却至25℃。这样，就能够使不耐热的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸分解，使磷酸游离。通过以下方法对游离的无机磷酸进行定量。即，在200μl

冷却至25℃的试样中添加700μl蒸馏水、100μl阿米多尔试剂(溶解亚硫酸氢钠100g和阿米多尔5g，制成500ml水溶液)及8.3％钼酸铵(溶解41.5g钼酸铵，滴加氨水，充分溶解后制成500ml水溶液)70μl。室温放置10分钟后，用分光光度计测定其在750nm时的吸光度。将无机磷酸为1mM时的吸光度定为0.3867，由无机磷酸的浓度算出由于酶反应而减少的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的量，将30℃时在1分钟内使1μmoleN-乙酰葡糖胺-1-磷酸转变为N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的活性计为1个单位(unit)

                            表2

菌/质粒	N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶活性(Units/mg蛋白质)
		JM109/pTrc99A	0.01以下
JM109/pTrc-agml	5.70

后述的UDPAG的合成中利用了N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶的使N-乙酰葡糖胺-6-磷酸转变为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的活性。所以，测定该转换反应的活性时可用N-乙酰葡糖胺-6-磷酸代替上述反应液中的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，利用上述方法算出反应生成的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的量，从而求出酶活性。其结果是，使N-乙酰葡糖胺-6-磷酸转变为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的活性是使N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转变为N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的活性的约1/30。

(3)来源于大肠杆菌的UDPAG焦磷酸化酶基因的制备

众所周知，大肠杆菌的UDPAG焦磷酸化酶即为葡糖胺·尿苷·转移酶(EC2.7.7.23)(glmU)(Journal of Bacteriology，175，19，6150(1993))。所以，按照齐藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))调制大肠杆菌IFO3972的染色体DNA，以该DNA为模板，利用以下所示的2种引物DNA，用PCR法使UDPAG焦磷酸化酶(Biochem.J.，(1984)，224，799-815)的DNA片段扩增。

引物(G)：5′-CCTGCTGATATAAAACCCCCCTGT-3′

引物(H)：5′-CCCGAAGCTTGTAGAGAGTGGGGT-3′

PCR反应使用与实施例5同样的反应组成和同样的反应器，进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(37℃，2分钟)和延伸反应(72℃，3分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，利用与实施例5同样的方法精制1.5kb的DNA片段。然后，利用DNA平头试剂盒(宝酒造株式会社生产)使回收到的DNA末端成平头。用限制性酶DraI使该DNA消化，并用限制性酶SmaI使质粒pUC18消化，再通过T4DNA连接酶使两者连接。用限制性酶EcoRI及HindIII使该质粒消化后，与前述同样精制1.5kb的DNA片段，使其与同样用限制性酶EcoRI及HindIII使质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司生产)消化后的产物利用T4DNA连接酶连接。利用连接反应液使大肠杆菌K12株JM109进行性状转变，从耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTrc-glmU，质粒pTrc-glmU是在pTrc99A的trc启动子下游的SmaI-HindIII酶切部位插入大肠杆菌glmU的结构基因而获得的质粒。将所得的性状转变体命名为JM109″pTrc-glmU″。

(4)UDPAG焦磷酸化酶的调制

将JM109″pTrc-glmU″在37℃的温度下，在25ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养一晚。然后，将其接种在500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃培养2小时后，添加IPTG使最终浓度达到1mM，于37℃继续培养一晚。培养结束后，离心分离(4℃，9,000×g，20分钟)回收菌体。将回收到的菌体悬浮于50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。使用ブランソン公司生产的超声波粉碎机(motel 450sonifer)将菌体粉碎后(50W，5分钟，3次)，在4℃、15,000rpm的条件下离心分离30分钟，回收可溶性部分(上清)。

将所得上清部分作为酶标品，测定该酶标品中的UDPAG焦磷酸化酶活性。其结果和对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109)同列于以下的表3。

                        表3

菌/质粒	UDPAG焦磷酸化酶活性(Units/mg蛋白质)
		JM109/pTrc99A	0.29
JM109/pTrc-glmU	16.52

UDPAG焦磷酸化酶活性是按照以下所示方法测定使UDPAG和焦磷酸分解为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸和UTP的活性而算出的值。

即，在50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、5mM氯化镁、3mM焦磷酸钠、1mMUDPAG中添加焦磷酸化酶标品(每1ml反应液约6μg)，于37℃反应5分钟。另外，用水代替焦磷酸钠溶液进行同样的反应，以作空白对照。

将反应液煮沸5分钟使反应停止，将其稀释30倍后，用HPLC进行分析。分离时使用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，所用洗脱液为0.5M的磷酸钾溶液。从HPLC分析结果可算出反应液中的UDPAG残留量，将37℃时1分钟内分解1μmole的UDPAG的活性计为1个单位(unit)。

(5)使用了重组酶的UDPAG的合成

在含有200mM葡萄糖、50mM N-乙酰葡糖胺、50mM UMP、200mM磷酸钾(pH8.0)、10mM氯化镁、5％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)的溶液5ml中添加重组酶(N-乙酰葡糖胺激酶0.2个单位、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶0.5个单位、UDPAG焦磷酸化酶5个单位)，于20℃以300rpm一边搅拌一边进行反应。在反应开始后的第16、24、40、48、64、72小时时分别添加1/14反应液的50％葡萄糖溶液。

对不同时间的反应液进行分析的结果如图5所示。添加葡萄糖的情况下，含有5％干燥面包酵母和N-乙酰葡糖胺激酶的反应液在反应88小时后生成了27mM的UDPAG。除了N-乙酰葡糖胺激酶还含有UDPAG焦磷酸化酶的情况下，还含有N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶的情况下，还同时含有UDPAG焦磷酸化酶和N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶的情况下，UDPAG的蓄积量分别增加到33mM、37mM和39mM。

实施例7

实施例6是在试管中进行的反应例，本实施例使用了发酵罐，表示UDPAG合成反应扩大规模后的结果。即，在含有400mM葡萄糖、100mMN-乙酰葡糖胺、100mM UMP、200mM磷酸钾(pH8.0)、20mM氯化镁、5％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)的溶液1.5L中添加实施例5-(2)和实施例6-(2)及(4)调制而得的重组酶溶液(N-乙酰葡糖胺激酶120个单位、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶750个单位、UDPAG焦磷酸化酶750个单位)，在温度为23℃、通气量为1.5L/分、700rpm的条件下一边搅拌一边进行反应。反应过程中可适当添加消泡剂エイノ-ル。此外，在反应进行到第12、20、36小时时可在反应液中添加54g葡萄糖。

在不同时间对反应液进行分析的结果如图6所示。反应进行到第54小时时生成了82mM的UDPAG。

实施例8

到实施例7为止，对使用了干燥面包酵母的UDPAG合成进行了说明。以下所示的是用UMP激酶、多磷酸激酶、腺苷酸激酶形成的UTP来代替干燥面包酯母，在体外合成UDPAG的例子。由UDP合成UTP时，一般都需要核苷二磷酸激酶，但是，由于腺苷酸激酶具有上述活性，所以，没有添加核苷二磷酸激酶的必要。

(1)来源于大肠杆菌的UMP激酶基因的克隆

按照齐藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))调制大肠杆菌K12株JM109(宝酒造株式会社生产)的染色体DNA。以该DNA为模板，利用按常用方法合成的以下所示的2种引物DNA，通过PCR法使大肠杆菌UMP激酶(pryH)基因(Genetics(Life Sci.Adv.)，11，59-65(1992))扩增。

引物(I)：5′-TTCCATGGCTACCAATGCAAAAC-3′

引物(J)：5′-TTGGATCCTTATTCCGTGATTAAAGTCCC-3′

用PCR使pyrH基因扩增时，使用与实施例5同样的反应组成和同样的反应器，进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(55℃，2分钟)和延伸反应(72℃，4分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，利用与实施例5同样的方法精制0.74kb的DNA片段。然后，用限制性酶NcoI及BamHI剪切该DNA，同时用限制性酶NcoI及BamHI使质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司生产)消化，再通过T4DNA连接酶连接。利用该反应液使大肠杆菌JM109进行性状转变，从耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTP01，质粒pTP01是在pTrc99A的trc启动子及核糖体结合位点下游的NcoI-BamHI剪切部位插入含有大肠杆菌pryH基因的结构基因的NcoI-BamHIDNA片段而获得的质粒。

(2)来源于大肠杆菌的UMP激酶的调制

将具有质粒pTP01的大肠杆菌JM109接种在10ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃振荡培养。当菌数达到4×10⁸个/ml时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后在30℃进行振荡培养5小时。

培养结束后，离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，使其悬浮于2ml的缓冲液(50mM Tris盐酸(pH7.5)、50mM氯化钾、2mM氯化镁)中。对悬浮液进行超声波处理，使菌体粉碎，再次离心分离(20,000×g，10分钟)，除去上清部分。将所得沉淀部分作为酶标品。

酶标品中的UMP激酶活性和对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109)同列于以下表4。本发明的UMP激酶活性的单位(unit)是按以下方法测定后计算而得的。

即，在50mM Tris盐酸(pH7.5)、50mM氯化钾、2mM氯化镁、3mM UTP、3mM ATP的条件下，将温度保持在30℃进行反应，煮沸1分钟使酶失活。

利用HPLC对反应液中的UDP进行定量，将30℃时1分钟内生成1μmole的UDP的活性计为1个单位(unit)。

                   表4

菌/质粒	UMP激酶活性(Units/mg蛋白质)
		JM109/pTrc99A	0.1以下
JM109/pTP01	4.9

(3)来源于大肠杆菌的多磷酸激酶基因的克隆

按照齐藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))调制大肠杆菌K12株JM109(宝酒造株式会社生产)的染色体DNA。以该DNA为模板，用按常法合成的以下所示的2种引物DNA，通过PCR法使大肠杆菌多磷酸激酶(ppk)基因(J.Biol.Chem.，267，22556-22561(1992))扩增。

引物(K)：5′-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3′

引物(L)：5′-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3′

用PCR方法使PPK基因扩增时使用与实施例5同样的反应组成和同样的反应器，进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(55℃，1.5分钟)和延伸反应(72℃，1.5分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，利用与实施例5同样的方法精制1.0kb的DNA片段。然后，用限制性酶NcoI及BamHI剪切该DNA，同时用限制性酶NcoI及BamHI使质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司生产)消化，再通过T4DNA连接酶连接两者。利用该反应液使大肠杆菌JM109进行性状转变，从耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTrc-PPK，质粒pTrc-PPK是在pTrc99A的trc启动子下游的NcoI-BamHI剪切部位插入含有大肠杆菌ppk基因的NcoI-BamHI DNA片段而获得的质粒。

(4)来源于大肠杆菌的多磷酸激酶的制备

将具有质粒pTrc-PPK的大肠杆菌JM109接种在300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡培养。当菌数达到4×10⁸个/ml时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后在30℃进行振荡培养5小时。

培养结束后，离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，使其悬浮于60ml的缓冲液(50mM Tris盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶)中。在27℃保温1小时后，对悬浮液进行超声波处理，使菌体粉碎，再次离心分离(20,000×g，10分钟)，除去残留菌体部分。接着用含有5mM氯化镁及1mM 2-巯基乙醇的50mM Tris盐酸(pH7.8)对所得上清部分进行透析，获得粗酶液。

然后，测定粗酶液中的多磷酸激酶活性，其结果和对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109)同列于以下表5。

                     表5

菌/质粒	多磷酸激酶活性(Units/mg蛋白质)
		JM109/pTrc99A	0.00018
JM109/pTrc-PPK	0.19

本发明的多磷酸激酶活性的单位(unit)是按以下方法测定后算出的值。

即，在含有5mM氯化镁、100mM硫酸铵、5mM ADP、多磷酸(作为无机磷酸，150mM)的5mM Tris盐酸缓冲液(pH7.8)中添加酶标品，将温度保持在37℃进行反应，煮沸1分钟使酶失活。利用HPLC对反应液中的ATP进行定量，将37℃时生成1μmole ATP的活性计为1个单位(unit)。

然后，以0～0.5M的NaCl浓度梯度，利用DEAEトヨパ-ル650M(ト-ソ-株式会社)对粗酶液进行分离，获得多磷酸激酶部分。将该部分作为多磷酸激酶酶标品。该酶标品中的多磷酸激酶的比活性为0.6单位/mg蛋白质。

(5)来源于大肠杆菌的腺苷酸激酶的克隆

按照齐藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))调制大肠杆菌K12株JM109(宝酒造株式会社生产)的染色体DNA。以该DNA为模板，用按常法合成的以下所示的2种引物DNA，通过PCR法使大肠杆菌腺苷酸激酶(adk)基因(Nucleic Acids Res.，13(19)，7139-7151(1985))扩增。

引物(M)：5′-ATGGATCCCGTTTCAGCCCCAGGTGCC-3′

引物(N)：5′-ATAAGCTTGGCCTGAGATTGCTGATAAG-3′

用PCR技术使ask基因扩增时使用与实施例5同样的反应组成和同样的反应器，进行热变性反应(94℃，1分钟)、退火(56℃，1分钟)和延伸反应(72℃，3分钟)，反复进行25次。

基因扩增后，利用与实施例5同样的方法精制1.0kb的DNA片段。然后，用限制性酶BamHI及HindIII剪切该DNA，同时用限制性酶BamHI及HindIII使质粒pUC18(宝酒造株式会社生产)消化，再通过T4DNA连接酶连接两者。利用该反应液使大肠杆菌JM109进行性状转变，从耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pUC-ADK，pUC-ADK是在pUC18的lac启动子下游的BamHI及HindIII剪切部位插入含有大肠杆菌adk基因的BamHI及HindIII DNA片段而获得的质粒。

(6)来源于大肠杆菌的腺苷酸激酶的制备

将具有质粒pUC-ADK的大肠杆菌JM109接种在300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡培养。当菌数达到4×10⁸个/ml时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后在30℃进行振荡培养5小时。

培养结束后，离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，使其悬浮于60ml的缓冲液(50mM Tris盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶)中。在27℃保温1小时后，对悬浮液进行超声波处理，使菌体粉碎，再次离心分离(20,000×g，10分钟)，除去残留菌体部分。接着用含有5mM氯化镁及1mM 2-巯基乙醇的50mM Tris盐酸(pH7.8)对所得上清部分进行透析，获得粗酶液。

然后，测定粗酶液中的腺苷酸激酶活性，其结果和对照菌(具有pUC18的大肠杆菌JM109)同列于以下表6。

                   表6

菌/质粒	腺苷酸激酶活性(Units/mg蛋白质)

JM109/pU18	1.9
		JM109/pUC-ADK	134

本发明的腺苷酸激酶活性的单位(unit)是按以下方法测定后算出的值。

即，在含有5mM氯化镁、5mM ATP、5mM AMP的50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.8)中添加酶标品，将温度保持在37℃进行反应，煮沸1分钟使酶失活。利用HPLC对反应液中的ADP进行定量，将37℃时生成2μmole ADP的活性计为1个单位(unit)。

然后，以0～0.5M的NaCl浓度梯度，用DEAEトヨパ-ル650M(ト-ソ-株式会社)对粗酶液进行分离，回收具有腺苷酸活性的部分。将该部分作为腺苷酸激酶酶标品。该酶标品中的多磷酸激酶的比活性为344单位/mg蛋白质。

(7)使用了UMP激酶、多磷酸激酶、腺苷酸激酶形成的UTP生成系的UDPAG的合成

在含有10mM氯化镁、10mM硫酸铵、多磷酸(作为无机磷酸，75mM)、10mM UMP及3mM AMP的200mM Tris盐酸缓冲液(pH7.8)中加入0.1单位/ml多磷酸激酶、2.5单位/ml腺苷酸激酶、0.5单位/ml UMP激酶、0.05单位/ml N-乙酰葡糖胺激酶、0.5单位/ml N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶、1.0单位/ml UDPAG焦磷酸化酶标品，于37℃保温24小时后，生成了3.4mM的UDPAG。

产业上利用的可能性

利用本发明，首次在即使将作为底物的利用价值较低的N-乙酰葡糖胺作为底物使用的情况下，也能够有效地生产UDPAG。

Claims (9)

1.一种UDPAG的制备方法，其特征在于，在使用面包酵母，由尿苷酸(UMP)和N-乙酰葡糖胺制备尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)的方法中，使N-乙酰葡糖胺激酶共存。

2.如权利要求1所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，N-乙酰葡糖胺激酶来源于细菌。

3.如权利要求1所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，还可使用N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及/或尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶。

4.一种UDPAG的制备方法，其特征在于，在使用酶，由尿苷三磷酸(UTP)及N-乙酰葡糖胺制备UDPAG的方法中，作为酶，合并使用N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺·磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶。

5.如权利要求4所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，用UTP生成体系代替UTP。

6.如权利要求5所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，UTP生成体系为使用微生物菌体的方法。

7.如权利要求5所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，UTP生成体系为使用酶的方法。

8.如权利要求5所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，UTP生成体系是UTP生成体系和腺苷三磷酸(ATP)再生体系共同发挥作用的体系。

9.如权利要求8所述的UDPAG的制备方法，其特征还在于，UTP生成体系是使多磷酸激酶、腺苷酸激酶及多磷酸作用于腺苷酸(AMP)，使ATP再生，同时，使尿苷酸激酶作用于UMP生成UTP的体系。

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