CN101230372B - 全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-n-乙酰葡糖胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。本发明采用全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，克服了发酵法代谢产物复杂、底物转化率低等缺陷，简化了后续的分离工艺；与酶法相比由于使用的是全细胞，酶的稳定性更好，耐有机溶剂的适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生。
Description
技术领域
本发明涉及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制备方法，尤其涉及全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法。
背景技术
在过去很长的一段时间内，碳水化合物及其衍生物并没有得到很大发展，但近十年来，随着发现糖类物质在细胞识别，免疫方面的重要生理作用，糖类物质又日益受到了重视并有了长足的进步。尤其是寡糖，它在生物体内起着调节细胞内外联系的作用，并参与激素的调节和抗体的免疫识别，能激活植物的自我防卫系统、诱导根瘤菌的固氮作用、可以与入侵的微生物上的糖蛋白相结合而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭等等[Glycoconjugate Journal.1999，16：147]。
尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)是合成寡糖的重要糖基供体[USP6,287,819，2001]，故有必要对糖核苷酸尤其是作为含有许多生理活性糖链链芯部分的N-乙酰葡糖胺供体的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的合成进行深入的研究。
生物体中尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺中涉及不同氨基糖之间的转化，且作为生物合成粘多糖、糖肽、脂蛋白和几丁质等的氨基糖成分的重要前体物质[Biol.Chem.1971，35(2)：163-176]。
尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生物催化合成，从能量利用方面看，是较高难度的合成反应。首先添加在反应液中的葡糖胺通过与EMP途径的化学能生成系统共轭，葡糖胺被磷酸化为葡糖胺-6-磷酸，再进一步消耗乙酰-辅酶A，而被转化为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸；另一方面，作为构成核苷酸部分原料的尿苷酸，通过与EMP途径的能量生成系统共轭，被磷酸化为尿苷三磷酸，最后通过缩合反应，生成UDPAG[(Yeast 2006，23：1-4]。
目前合成UDPAG的方法有：化学法[J.Org.Chem.1992，57：146]、酶化学法[J.Org.Chem.1992，57：146]、发酵法[USP 5,674,715，1997]。化学合成需要五步，最后一步合成收率很低，总收率只有15％，化学法和发酵法都是用于实验室生产少量的UDPAG，在实际应用中酶化学法比较方便，收率较高，但后续的分离却很复杂。有报道用尿苷酸及N-乙酰葡糖胺为底物，并加入N-乙酰葡糖胺激酶、N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶为特征的UDPAG的制备方法[CN 1276837A]。此方法成本高昂，操作繁琐，稳定性差，真正实现工业化还有待探讨。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、便于后续分离操作的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制备方法。
本发明的关键在于：
1、全细胞催化
由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有活细胞所处的状态和特定位置，因此用酵母细胞直接作为酶源进行酶催化反应，能够迅速有效地完成多步酶催化反应。在本发明中利用停止生长的酵母，采用全细胞催化技术，同时添加促渗透剂对酵母进行细胞渗透性增强处理，从而既保持了细胞酶系的完整性，又有利于底物的利用，并使得产物能够从胞内释放出来，从而可以降低后续分离的难度。
本发明是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了其它方法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合，不易改变细胞的通透性等缺陷。特别是与酶催化相比，由于使用的是全细胞，胞内的酶受细胞壁/细胞膜的保护，酶稳定性更好，半衰期更长，更易实现能量和辅酶的再生；胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足，同时省去酶的纯化过程，制备简单，成本低廉。
2、利用酵母合成UDPAG的自身代谢途径
在酵母细胞中生物合成UDPAG从葡萄糖开始，在己糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶的作用下变为6-磷酸果糖，再以6-磷酸果糖和谷氨酰胺为底物在氨合成酶作用下转化成为6-磷酸葡萄糖胺，随后6-磷酸葡萄糖胺被乙酰化、异构化乙酰葡糖胺-1-磷酸，最后被相应的焦磷酸化酶转化为UDPAG。因此谷氨酰胺的加入可以利用酵母自身的合成途径，促进UDPAG的合成。
本发明直接加入葡糖胺，利用己糖激酶被催化成6-磷酸葡萄糖胺。而己糖激酶的优先底物为葡萄糖，体系中一旦存在葡萄糖则葡糖胺的磷酸化反应很弱[Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392，2000]，因此用果糖代替葡萄糖作为能源，可以消除葡糖胺磷酸化受到抑制的同时还可以利用酵母自身的合成途径，作为合成的底物合成UDPAG。
3、小分子效应物的加入
代谢通量经调解因子镁离子、钾离子调节后，代谢途径流量分配发生了重大改变，EMP主途径得以加强，提高了能量的利用率，部分解决了UTP合成和糖部分合成反应过程中需要大量ATP的问题。
反应过程中底物6-磷酸-葡糖胺和乙酰辅酶A在葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的催化下转变为6-磷酸-N-乙酰葡糖胺，此步反应为整个催化合成过程中的限速反应[Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392，2000]。因此解决乙酰辅酶A的再生问题，是本发明的关键。酵母内乙酰辅酶A的形成途径有两条：一是线粒体内的丙酮酸直接氧化脱羧途径，由丙酮酸脱氢酶将丙酮酸氧化为乙酰辅酶A；二是细胞质内的丙酮酸脱羧支路，在丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的联合作用下将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。醋酸钠可以利用酵母细胞中丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的联合作用生成乙酰辅酶A，所以反应体系中加入醋酸根离子，可以促进乙酰辅酶A的再生，对促进UDPAG的合成有很大作用。
具体来说，本发明的目的通过以下技术措施达到：
一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸(UMP)、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
其中，底物中，尿苷酸的起始反应浓度为8～50mM，优选10～35mM；葡糖胺的起始反应浓度为10～70mM，优选15～45mM；磷酸根离子起始反应浓度为60～300mM，优选80～180mM。
其中，果糖的起始反应浓度为20～180mM，优选150mM。
其中，所述的小分子化学效应物质为无机小分子和有机小分子；其中无机小分子为镁离子和钾离子的组合物；有机小分子为醋酸根离子和谷氨酰胺的组合物；Mg2+起始反应浓度为2～30mM，优选2～22mM；K+起始反应浓度为5～80mM，优选15～65mM；CH3COO-起始反应浓度为5～90mM，优选5～65mM；谷氨酰胺起始反应浓度为5～80mM，优选15～60mM。
其中，所述的酵母为酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或酿酒酵母属中能够利用尿苷酸和葡糖胺为前体合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的酵母，优选酿酒酵母、近平滑假丝酵母、面包酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、类球形德巴利酵母、鲁氏接合酵母、马克斯克鲁维酵母、杰丁汉逊酵母或异酒香酵母；酵母细胞的使用量为按湿菌体160～400g/L，优选250～400g/L，即对于总体积为1L的反应液，需加入湿酵母160～400g，优选加入250～400g。
其中，所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。
表面活性剂法中使用的表面活性剂包括非离子型表明活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100，阳离子性表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物或阴离子表明活性剂月桂酸·肌氨酸盐，使用量为0.1～40g/L，优选1～20g/L，即表面活性剂法处理酵母细胞时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～40g，优选加入1～20g。
有机溶剂法中使用的有机溶剂为甲苯、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1～70ml/L，优选1～40ml/L，即有机溶剂法处理酵母细胞时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～70mL，优选加入1～40mL。
其它处理细胞透性的方法，如冻融法、超声波处理法、风干法等，采用先将酵母细胞处理后，再将处理好的酵母加入反应液的方式。
其中，上述尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生成反应在水溶液中进行，pH4.0～10.0，15℃～40℃条件下反应4～30小时，优选pH6.0～10.0，20℃～37℃的条件。
上述反应的代谢途径见图1。本发明所采用的UDPAG的合成方法，利用UTP生成体系和ATP再生体系共同发挥作用的体系，其中UTP生成体系是利用酵母自身酶系以果糖、无机磷等为底物，使ATP再生，同时利用酵母中的尿苷酸激酶作用于UMP生成UTP。
有益效果：本发明采用全细胞酵母生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，克服了发酵法代谢产物复杂、底物转化率低等缺陷，简化了后续的分离工艺；与酶法相比由于使用的是全细胞，酶的稳定性更好，耐有机溶剂的适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生。本发明成本低廉，操作简单，易于实现工业化，为全细胞催化合成糖核苷酸提供了一种新的思路和方法。
附图说明
图1为本发明全细胞酵母生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的代谢途径。其中，ATP为三磷酸腺苷，ADP为二磷酸腺苷，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+为指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，PPi为焦磷酸。
具体实施方式
实施例1：
酵母培养基：葡萄糖40g/L，尿素2.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸锌4.0×10-3g/L，七水合硫酸亚铁3.0×10-3g/L，四水合氯化锰0.3×10-3g/L，无水氯化钙1.0×10-3g/L，生物素0.05×10-3g/L。
酵母接种量10％，于30℃下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。
取酵母泥，-7℃保藏备用。
实施例2：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐16.3mM、果糖166.7mM、葡糖胺25.5mM、谷氨酰胺10.3mM、磷酸二氢钠189mM、氯化镁6.4mM、氯化钾53.7mM、醋酸钠36.6mM、甲苯150ml、利用实施例1所述的方法培养面包酵母酵母泥2000g克和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至8.0，与28℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG4.15g/L，产物对UMP的得率为39.1％。
实施例3：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐9.51mM、果糖194.4mM、葡糖胺37.1mm、利用实施例1所述的方法培养面包酵母酵母冻干粉3500g、谷氨酰胺20.5mM、磷酸二氢钠224mM、氯化镁9.85mM、氯化钾60.4mM、醋酸钠46.3mM和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至8.0，与28℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG 3.25g/L，产物对UMP的得率为52.5％。
实施例4：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐10.9mM、果糖222.2mM、葡糖胺19.9mM、利用实施例1所述的方法培养白色球拟酵母3000g、风干处理、谷氨酰胺17.1mM、磷酸二氢钠135mM、氯化镁9.36mM、氯化钾44.3mM、醋酸钠48.8mM和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至8.0，与28℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG 3.79g/L，产物对UMP的得率为53.6％。
实施例5：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐18mM、果糖250mM、葡糖胺70mM、谷氨酰胺60mM、磷酸二氢钠180mM、氯化镁2mM、氯化钾65mM、醋酸钠65mM、阳离子性表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物400g、白色球拟酵母泥2500g和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至10.0，与40℃条件下低速搅拌反应4h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG4.36g/L，产物对UMP的得率为37.2％。
实施例6：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐4mM、果糖30mM、葡糖胺15mM、利用实施例1所述的方法培养白色球拟酵母3000g反复冻融4次、谷氨酰胺15mM、磷酸二氢钠80mM、氯化镁30mM、氯化钾15mM、醋酸钠5mM和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至6.0，与20℃条件下低速搅拌反应30h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG 1.35g/L，产物对UMP的得率为51.8％。
实施例7：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐40mM、果糖130mM、葡糖胺15mM、谷氨酰胺80mM、磷酸二氢钠60mM、氯化镁22mM、氯化钾80mM、醋酸钠90mM、阴离子表明活性剂月桂酸·肌氨酸盐1g、类球形德巴利酵母泥4000g和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至4.0，与37℃条件下低速搅拌反应20h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG 2.47g/L，产物对UMP的得率为9.49％。
实施例8：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐6mM、果糖20mM、葡糖胺45mM、谷氨酰胺40mM、磷酸二氢钠300mM、氯化镁15mM、氯化钾5mM、醋酸钠20mM、丙酮700mL、类球形德巴利酵母泥1600g和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至7.0，与15℃条件下低速搅拌反应20h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG1.73g/L，产物对UMP的得率为44.3％。
实施例9：
在容量为15L的反应槽中调制出由尿苷酸二钠盐35mM、果糖20mM、葡糖胺45mM、谷氨酰胺40mM、磷酸二氢钠300mM、氯化镁15mM、氯化钾5mM、醋酸钠20mM、乙酸乙酯1mL、近平滑假丝酵母泥2500g和水组成的反应液10L，用氢氧化钾调pH至7.0，与15℃条件下低速搅拌反应25h，反应结束后，用三氯乙酸沉淀，用HPLC对UDPAG进行定量分析，转化液中含UDPAG 2.51g/L，产物对UMP的得率为11％。
Claims (12)
1.一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺；
其中，所述的小分子化学效应物质为无机小分子和有机小分子；其中无机小分子为镁离子和钾离子的组合物；有机小分子为醋酸根离子和谷氨酰胺的组合物；镁离子起始反应浓度为2～30mM，钾离子起始反应浓度为5～80mM；醋酸根离子起始反应浓度为5～90mM，谷氨酰胺起始反应浓度为5～80mM；
其中，所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、风干法或冷冻干燥法。
2.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于底物中，尿苷酸的起始反应浓度为4～40mM，葡糖胺的起始反应浓度为10～70mM，磷酸根离子起始反应浓度为60～300mM。
3.根据权利要求2所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于底物中，尿苷酸的起始反应浓度为6～35mM，葡糖胺的起始反应浓度为15～45mM，磷酸根离子起始反应浓度为80～180mM。
4.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于果糖的起始反应浓度为20～250mM。
5.根据权利要求4所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于果糖的起始反应浓度为30～130mM。
6.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于镁离子起始反应浓度为2～22mM，钾离子起始反应浓度为15～65mM；醋酸根离子起始反应浓度为5～65mM，谷氨酰胺起始反应浓度为15～60mM。
7.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于所述的酵母为假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或酿酒酵母属中能够利用尿苷酸和葡糖胺为前体合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的酵母，酵母细胞的使用量为按湿菌体160～400g/L。
8.根据权利要求7所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于所述的酵母为酿酒酵母、近平滑假丝酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、类球形德巴利酵母、鲁氏接合酵母、马克斯克鲁维酵母、杰丁汉逊酵母或异酒香酵母，酵母的使用量为按湿菌体250～400g/L。
9.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表明活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100、阳离子性表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物或阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，表面活性剂使用量为0.1～40g/L。
10.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于有机溶剂法中使用的有机溶剂为甲苯、丙酮或乙酸乙酯，使用量为0.1～70ml/L。
11.根据权利要求1～10中任意一项所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生成反应在水溶液中进行，pH4.0～10.0，15℃～40℃条件下反应4～30小时。
12.根据权利要求11所述的全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于反应条件为pH6.0～10.0，温度为20℃～37℃。
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