CN101724670B - 一种尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,该方法以乳清酸和β-酮酯类化合物为底物,以葡萄糖为能量供体,利用有透性的酵母细胞同时制备尿苷磷酰类化合物与手性羟基酯。本发明运用全细胞催化和代谢工程的原理,通过建立代谢网络模型和代谢流量分析,利用有透性的酵母细胞联产尿苷磷酰类化合物和手性羟基酯,得率增高、生产成本降低、合成时间缩短、底物利用率大幅提高。
Description
技术领域
本发明涉及生化产品的制备方法,尤其涉及尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的新方法。
背景技术
尿苷磷酰类化合物和手性羟基酯都是极其重要的化合物,尿苷磷酰类化合物是核酸及寡糖合成的直接前体、重要的辅酶和能量载体,在细胞的生命代谢中起着十分重要的作用;而手性羟基酯主要用于药物的合成,同时在杀虫剂、昆虫信息素、香料和食品添加剂、有机材料及光学材料中有较多的应用。
目前已报导的制备尿苷磷酰类化合物的方法主要有化学合成法和酶法,但是这些方法成本太高,常用的方法是微生物转化法,利用微生物的细胞酶系合成,但是由于工艺原因,转化率普遍偏低,发酵周期太长,致使成本太高。国内的文献报道了产氨短杆菌转化乳清酸为尿苷一磷酸,突变株的转化能力只有2.1g/L,得率仅0.5%【李慧.产氨短杆菌Corynebacterium ammoniagenes转化(OA)生成尿苷酸(UMP)的研究.上海师范大学硕士学位论文.(2005).】。国内UTP还未有产业化生产报道,国外只有少量的相关文献报导【Stabilizing Nucleotides Derivatives.Japan.7,237,036,18 Sep.(1972)】。
手性羟基酯的制备方法主要包括手性源合成法、外消旋体拆分法和不对称合成法,其中采用不对称合成法,通过β-酮酯类化合物的不对称还原是制备手性羟基酯的一种最重要、最基础和最实用的方法。生物催化剂因具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点而受到广泛重视。然而进行生物催化合成手性羟基酯需要烟酰型辅酶II(NADPH)的参与,这种辅酶由于价格昂贵,所以需要通过添加辅助底物实现辅酶的循环再生。国外文献报道了通过基因工程改造的大肠杆菌用于还原4,4,4-三氟-乙酰乙酸乙酯(TFAAE),反应得到的(R)-(+)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯((R)-TFHBE),对应体过量值e.e超过99%,产率高于50%【Shaw n M,Robins K T,Kiener A.Lonza.20years of Biotransformations[J].Adv.Synth.Catal.2003.4:425~435.】。国内也有关于制备手性羟基酯的报道:出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC 1244可以将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原为(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯,其浓度可达20.3g/L【钟萍,孙志浩.生物催化不对称还原方法生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[J].过程工程学报,2005,5(6):665~669.】。然而,由于需要添加辅助底物,使得原料的利用率降低,并增加了生产成本及后分离的难度,使得生物催化手性羟基酯的一直未能实现工业化。
综上所述,现有的技术都是单独合成尿苷磷酰类化合物或单独合成手性羟基酯的方法,存在得率低、成本高等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,该方法能克服现有技术中单独合成尿苷磷酰类化合物或单独合成手性羟基酯时得率低、成本高的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是以乳清酸和β-酮酯类化合物为底物,以葡萄糖为能量供体,利用预处理的有透性的酵母来同时制备尿苷磷酰类化合物和手性羟基酯,基本思路如下反应式所示。
本发明直接利用了微生物体内嘧啶核苷酸的从头合成途径,通过添加尿苷一磷酸的前体来进行催化反应,在此过程中所产生的大量的具有还原力的辅酶II(NADPH)用于还原β-酮酯类化合物,最终实现了尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯。
具体的制备方法如下:
一种尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法:配制含50~400g/L酵母、5~50g/Lβ-酮酯类化合物、1~10g/L乳清酸、50~300g/L葡萄糖、0.01~2M磷酸根离子和1~200mM镁离子的水溶液,调节pH值至5~10,在15~40C下,反应3~40h。
其中所述的尿苷磷酰类化合物为尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、尿苷二磷酸D-葡糖(UDP-Glc)、尿苷二磷酸D-半乳糖(UDP-Gal)、尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨(UDP-GalNAc)。各种尿苷磷酰类化合物的结构式见表1。
表1尿苷磷酰类化合物的结构式
所述的手性羟基酯的通式为:
其中,R1为卤素(如F、Cl、Br、I等),R2为烷基(如CH3、C2H5、C3H7、C4H9等)。
所述的手性羟基酯可举出的例子有:4-氯-3羟基丁酸乙酯、4,4,4-三氟-3-丁酸乙酯、4-溴-3-羟基丁酸乙酯、4-氯-3-羟基丁酸丁酯、4-溴-3-羟基丁酸丁酯、4-氟-3羟基丁酸乙酯、4-氯-3-羟基丁酸甲酯等。
所述的β-酮酯类化合物通式为:
其中,R1为卤素(如F、Cl、Br、I等),R2为烷基(如CH3、C2H5、C3H7、C4H9等)。
所述的β-酮酯类化合物可举出的例子有:4-氯乙酰乙酸乙酯、4,4,4-三氟-乙酰乙酸乙酯、4-溴乙酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸丁酯、4-溴-乙酰乙酸丁酯、4-氟-乙酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸甲酯等等。
所述的乳清酸(OA)结构式如下:
所述的磷酸根离子可通过加入多磷酸或无机磷酸盐的方式得到,多磷酸如正磷酸、焦磷酸或三聚磷酸等,无机磷酸盐如磷酸二氢钾,磷酸二氢钠或磷酸氢二钠等。
所述的镁离子可通过加入无机镁盐的方式得到,无机镁盐如硫酸镁、硝酸镁或氯化镁。
所述的酵母细胞是指从酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中能够利用嘧啶核苷前体合成尿苷磷酰类化合物及能将β-酮酯类化合物还原为手性羟基酯的微生物。如属于酵母属的微生物酿酒酵母,面包酵母等;属于假丝酵母属的微生物近平滑假丝酵母;属于毕赤酵母属的奥默列氏毕赤酵母;属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母;属于德巴利酵母属的类球形德巴利酵母;属于接合酵母属的鲁氏接合酵母;属于克鲁维酵母属的马克斯克鲁维酵母;属于汉逊酵母属的杰丁汉逊酵母;属于酒香酵母属的异酒香酵母等。该酵母可以是经过发酵培养后分离离心得到的酵母细胞、酵母细胞的干燥物、酵母细胞的冻干物和市售酵母粉中的任意一种。
本发明利用了微生物自身的酶系:EMP途径酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶)、HMP途径酶系(6磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、6磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸戊糖异构酶、转酮酶)、尿苷磷酰类化合物合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)和手性羟基酯的合成酶系(醛还原酶、醛糖还原酶、羰基还原酶、酮还原酶)进行催化反应,由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统,各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置,反应所需要的能量和辅酶因子不需要外界供给,直接由细胞产生,因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应,在大规模生产方面,有转化效率高、成本低,以及污染小的优点。
通过大量的研究工作发现细胞膜的结构特性决定了细胞膜一般不允许高极性分子通过,因此欲使其通过细胞膜积累于反应液中,必须改变细胞膜的透性。另一方面,细胞内固有的手性羟基酯合成酶系(醛还原酶、酮还原酶)必须与β-酮酯类化合物结合才能进行催化反应。因此,细胞膜通透性的改变是尿苷磷酰类化合物积累于胞外及手性羟基酯合成的前提条件。通过改变微生物细胞膜的通透性,可加速反应组分向微生物细胞的扩散、渗透,促进底物和酶系的接触,可使最大转化率以及最大得率出现的时间在一定限度内缩短。
改变酵母细胞壁通透性可向酵母中加入表面活性剂、有机溶剂或溶菌酶进行反应,或将酵母细胞经超声、风干、冻融、冻干的方式处理。其中表面活性剂为聚环氧乙烷胺、曲拉通X-100等非离子型表面活性剂,十六烷基三甲胺·溴化物等阳离子型表面活性剂,月桂酰·肌氨酸盐等阴离子表面活性剂,通常以0.1~50g/L的浓度使用,优选以1~20g/L的浓度使用。其中有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯,通常以0.1~50mL/L的浓度使用,优选以1~20mL/L的浓度使用。
本发明所提供的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其中酵母的用量优选100~300g/L,β-酮酯类化合物的用量优选15~45g/L,乳清酸的用量优选3~7g/L,葡萄糖的用量优选100~200g/L,磷酸根离子的用量优选0.1~1M,镁离子的用量优选2~50mM,溶液pH值优选6~9,反应温度优选20~30℃,反应时间优选15~35h。
通过本发明方法,采用同样的反应体系,只要改变具体的底物,改变具体的葡萄糖及磷酸盐和镁离子的含量即可生成相应的尿苷磷酰类化合物与手性羟基酯。例如以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,即可反应得到(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯,以4,4,4-三氟-乙酰乙酸乙酯为底物即可反应得到(S)-(+)-4,4,4-三氟-3-丁酸乙酯,以4-溴乙酰乙酸乙酯为底物即可反应得到(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯,以4-氯-乙酰乙酸丁酯为底物即可反应得到(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯,以4-溴-乙酰乙酸丁酯为底物即可反应得到(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯,以4-氟-乙酰乙酸乙酯为底物即可反应得到(S)-(-)-4-氟-3羟基丁酸乙酯,以4-氯-乙酰乙酸甲酯为底物即可得到(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯。
对于目标产物尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨(UDP-GalNAc),需在上述反应体系反应了3~40h后,再加入50~100g/L葡萄糖和1~5g/L乙酸钠,继续反应1~20h,可得。
本发明可通过优化反应物料的量、反应时间、反应温度等参数,可得到不同的尿苷磷酰类化合物。
本发明是建立在全细胞催化的基础上的,其特点在于克服了其它方法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合,不易改变细胞膜的通透性等缺陷。特别是与酶催化相比,由于使用的是全细胞,胞内的酶受细胞壁/细胞膜的保护,酶稳定性更好,半衰期更长,更易实现能量和辅酶的再生;胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足,同时省去酶的纯化过程,制备简单,成本低廉。
本发明主要涉及到的主要是辅酶的循环高效再生,在现有技术中,单独合成尿苷磷酰类化合物与单独合成手性羟基酯的酶催化反应,在消耗一种形态辅酶的同时将另一种形态的辅酶浪费,而本发明将消耗两种不同形态辅酶的催化反应结合起来,通过反应-反应耦合,形成了一个多目标产物联产的生物转化过程。
有益效果:本发明将酵母细胞以尿苷一磷酸的前体物质为底物合成尿苷磷酰类化合物与以β-酮酯类化合物为底物制备手性羟基酯的反应过程耦联起来,形成反应-反应耦联体系,合理的运用全细胞催化和代谢工程的原理,通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、建立了辅酶的高效循环再生体系,提高了辅酶的再生效率,利用有透性的酵母细胞联产尿苷磷酰类化合物与手性羟基酯,得率增高、生产成本降低、合成时间缩短、底物利用率大幅提高。
具体实施方式:
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:尿苷-磷酸(UMP)联产(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
在容量为15L的反应槽中调制由乳清酸OA 10克,4-氯乙酰乙酸乙酯50克,葡萄糖500克,市售面包酵母粉500克,硫酸镁10mM,磷酸二氢钾0.01M,二甲苯12毫升和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH至8.5,于30℃条件下高速搅拌反应20h,通气量为0.5(V/V·min)。反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酰乙酸萃取(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯,用HPLC和GC分别对尿苷一磷酸(UMP)和(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙进行定量分析,并用旋光仪对产物(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的旋光值进行测定,转化液中含UMP1.89克/升,(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯4.6克/升,对映体过量值为95%,UMP的得率达到91%(mol计),(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的得率为92%(mol计)。
实施例2:尿苷二磷酸D-葡糖(UDP-Glc)联产(S)-(+)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯((S)-TFHBE)。
酵母培养基(g/L):葡萄糖40,尿素2.0,磷酸二氢钾1.5,七水合硫酸镁0.5,七水合硫酸锌4.0×10-3,七水合硫酸亚铁3.0×10-3,四水合氯化锰0.3×10-3,无水氯化钙1.0×10-3,生物素0.05×10-3。酿酒酵母接种量10%(v/v),于30℃下120rpm摇床培养24小时,离心4000rpm,20分钟。取酵母泥,-7℃保藏备用。
在容量为15L的反应槽中调制由OA 100克,葡萄糖3000克,4,4,4-三氟-乙酰乙酸乙酯(TFAAE)500克,酿酒酵母泥5000克,风干处理,硫酸镁200mM,磷酸二氢钠2M,曲拉通X-10010毫升和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH至8.5,通气量为0.5(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度降低至25℃,用HCl调节pH至7.0,补加葡萄糖1000克,再反应8h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酸乙酯萃取TFHBE,用HPLC和GC分别对UDP-Glc和TFHBE进行定量分析,并用旋光仪对产物TFHBE的旋光值进行测定,转化液中含UDP-Glc33.17克/升,(S)-TFHBE 46.8克/升,对映体过量值为93%,UDP-Glc的得率达到91.5%(mol计),(S)-TFHBE的得率为91.7%(mol计)。
实施例3:尿苷三磷酸(UTP)联产(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯。
容量为15L的反应槽中调制由OA 60克、葡萄糖1400克、4-溴乙酰乙酸乙酯200克,硫酸镁20mM、利用实施例2所述方法培养面包酵母2700克,反复冻融3次,磷酸氢二钠0.6M,十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH为7,通气量为1.0(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度升高至37℃,用HCl调节pH至6.5,补加葡萄糖500克,再反应2h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯,用HPLC和GC分别对尿苷三磷酸(UTP)和(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯进行定量分析,并用旋光仪对产物(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯的旋光值进行测定,转化液中含UTP 18.09克/升,(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯19.25克/升,对映体过量值为95%,UTP的得率达到97%(mol计),(S)-(-)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯得率达到96%。
实施例4:尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)联产(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯。
在容量为15L的反应槽中调制由OA40克、葡萄糖1000克、葡萄糖铵30克、硫酸镁25mM、4-氯-乙酰乙酸丁酯150克,利用实施例2所述方法培养面包酵母2000克,风干处理,磷酸二氢钾0.5M和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH为7,通气量为0.7(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度降低至27℃,用HCl调节pH至6.0,补加葡萄糖700克,乙酸钠50克,再反应12h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯,用HPLC和GC分别对尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)和(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯定量分析,并用旋光仪对产物(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯进行测定,转化液中含UDP-GlcNAc 14.78克/升,(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸丁酯14.12克/升,对映体过量值96%,UDP-GlcNAc的得率达到95%(mol计),(S)-(+)-3-羟基丁酸丁酯得率达到95%(mol计)。
实施例5:尿苷二磷酸(UDP)联产(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯。
容量为15L的反应槽中调制由OA 55克、葡萄糖1200克、4-溴-乙酰乙酸丁酯170克,硫酸镁22mM、利用实施例2所述方法培养面包酵母2500克,磷酸氢二钠0.5M,十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH为7,通气量为0.7(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度升高至35℃,用HCl调节pH至6.0,补加葡萄糖600克,再反应1h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酸乙酯萃取(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯,用HPLC和GC分别对尿苷二磷酸(UDP)和(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯进行定量分析,并用旋光仪对产物(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯的旋光值进行测定,转化液中含UDP 14.25克/升,(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯16克/升,对映体过量值94%,UDP的得率达到94%(mol计),(S)-4-溴-(-)-3-羟基丁酸丁酯得率达到94.1%。
实施例6:尿苷二磷酸D-半乳糖UDP-Gal联产(S)-(-)-4-氟-3-羟基丁酸乙酯。
在容量为15L的反应槽中调制由乳清酸OA 70克,4-氟-乙酰乙酸乙酯230克,葡萄糖1100克,市售面包酵母粉2200克,硫酸镁15mM,磷酸二氢钾0.4M,二甲苯12毫升和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH至6.5,通气量为0.9(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度降低至20℃,用氢氧化钠调节pH至7.5,补加葡萄糖900克,再反应12h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-氟-3羟基丁酸乙酯,用HPLC和GC分别对尿苷二磷酸D-半乳糖UDP-Gal和(S)-(-)-4-氟-3-羟基丁酸乙酯进行定量分析,并用旋光仪对产物(S)-(-)-4-氟-3羟基丁酸乙酯的旋光值进行测定,转化液中含UDP-Gal 25.54克/升,(S)-(-)-4-氟-3羟基丁酸乙酯21.34克/升,对映体过量值为95%,UDP-Gal的得率达到94%(mol计),(S)-(-)-4-氟-3羟基丁酸乙酯的得率为93%(mol计)。
实施例7:尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨UDP-GalNAc联产(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯。
在容量为15L的反应槽中调制由乳清酸OA 50克,4-氯-乙酰乙酸甲酯210克,葡萄糖1500克,利用实施例2所述方法培养面包酵母1700克,硫酸镁30mM,磷酸二氢钾0.33M,二甲苯12毫升和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH至6.5,通气量为1.6(V/V·min),于30℃条件下高速搅拌反应16h,然后停止通气,降低搅拌速率,温度降低至18℃,用氢氧化钠调节pH至7.0,补加葡萄糖900克,乙酸钠20克,再反应16h,反应结束后,用高氯酸灭活,用乙酰乙酸萃取(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯,用HPLC和GC分别对尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨UDP-GalNAc和(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯进行定量分析,并用旋光仪对产物(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸甲酯的旋光值进行测定,转化液中含UDP-GalNAc 18.54克/升,(S)-(-)-4-氯-3羟基丁酸甲酯19.34克/升,对映体过量值为95%,UDP-GalNAc的得率达到95%(mol计),(S)-(-)-3羟基丁酸甲酯的得率为94%(mol计)。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其特征在于所述的酵母是经过发酵培养后分离离心得到的酵母细胞、酵母细胞的干燥物、酵母细胞的冻干物和市售酵母粉中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其特征在于所述的酵母细胞为经加入表面活性剂、有机溶剂或溶菌酶反应,或经超声、风干、冻融、冻干处理,使细胞膜的通透性发生改变的酵母细胞。
4.根据权利要求1所述的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其特征在于所述的磷酸根离子可通过加入多磷酸或无机磷酸盐的方式得到。
5.根据权利要求1所述的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其特征在于所述的镁离子可通过加入无机镁盐的方式得到。
6.根据权利要求1所述的尿苷磷酰类化合物联产手性羟基酯的方法,其特征在于在反应了3~40h后,加入50~100g/L葡萄糖,1~5g/L乙酸钠,继续反应1~20h。
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