CN110904063A - 一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法，它是核苷磷酸化酶的种子接种到培养基上，经过发酵培养，制得含有核苷磷酸化酶的发酵液；培养基包碳源、氮源、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、柠檬酸和消泡剂，在发酵培养过程中控制好温度为、空气流量、罐压、溶氧水平、pH值和发酵周期。它的应用方法是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中，控制好底物浓度、核苷磷酸化酶加入量、转化温度、pH值和转化时间。该工艺技术控制简易，容易工业化放大，且发酵终点生物量大；转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷效率高。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其是一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法。
背景技术
核苷磷酸化酶，是核苷补救代谢途径中的关键酶，能够可逆地催化嘌呤核苷、嘧啶核苷磷酸化的酶，属于N-水解和转移酶家族，广泛存在于真核或者原核细胞中。
随着全球艾滋病感染群体日益增多，作为“鸡尾酒”疗法中的拉米夫定、替诺福韦需求量急剧增加，作为拉米夫定、替诺福韦的关键中间体的胞嘧啶和腺嘌呤，开发廉价、大规模生产这两个游离碱基的工艺成为关注的焦点。传统的化学合成法，工艺路线长、有机溶剂使用量大，存在着生产成本高、安全风险大的缺点。生物酶法催化核苷生产游离碱基，是一种绿色、低成本的生产工艺，但目前这一类的技术报道都停留在实验室阶段，同时存在着底物浓度低、催化效率慢的缺点。
本发明通过对核苷磷酸化酶发酵配方、工艺控制进行研究，获得高生物量的核苷磷酸化酶发酵液，并通过研究其转化条件，解决上述技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核苷磷酸化酶的发酵工艺，该工艺技术控制简易，容易工业化放大，且发酵终点生物量大。
本发明的另一目的在于提供一种核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷中的应用方法，该方法转化率高。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种核苷磷酸化酶的发酵工艺，它是核苷磷酸化酶的种子接种到培养基上，经过发酵培养，制得含有核苷磷酸化酶的发酵液；其特征在于：
所述的培养基包含如下组分：碳源5-30g/L，氮源5-35g/L，硫酸铵0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾2-20g/L，磷酸氢二铵2-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，柠檬酸0.2-1.0g/L，消泡剂0.1-0.2ml/L。
进一步，所述的碳源是指葡萄糖、甘油、果糖中的一种或多种。
进一步，所述的氮源是指大豆蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆粉的一种或多种。
进一步，所述的酵母粉是指啤酒或者面包酵母粉。
进一步，在核苷磷酸化酶的发酵培养过程中，发酵温度为35-39℃，空气流量0.5-1VVM，罐压0.03-0.05MPa，溶氧水平10-40％，pH值6.0-7.5，发酵周期20-35小时。
上述工艺方法制备的核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷中的应用方法，它是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中，底物浓度为30-200g/L(底物水溶液中含有的胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷合计浓度)，核苷磷酸化酶相对底物加入量为0.25-2.5ml/g，转化温度35-39℃，pH值6.0-7.0，转化时间1-6小时。
本发明和现有技术相比的优点为：
(1)发酵配方中无特殊来源的培养基，且原料价格低廉。
(2)发酵工艺控制简易，容易工业化放大，且发酵终点生物量大。
(3)由于发酵终点生物量大，在转化过程中底物浓度高，加入酶的比例低，且转化时间短。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中，葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨5g/L，黄豆粉10g/L，玉米浆10g/L，硫酸铵0.8g/L，磷酸二氢钾10g/L，磷酸氢二铵5g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸0.5g/L，消泡剂0.15ml/L，在温度37℃，空气流量：0-18小时0.8VVM，18-28小时0.6VVM，罐压0.04MPa，溶氧水平10-20％，pH6.5，培养28小时发酵结束。测得菌体生物量75g/L。
实施例2：将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中，葡萄糖5g/L，甘油5g/L，酵母粉10g/L，黄豆粉5g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵0.8g/L，磷酸二氢钾10g/L，磷酸氢二铵5g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸0.5g/L，消泡剂0.20ml/L，在温度39℃，空气流量：0-16小时0.8VVM，16-28小时0.6VVM，罐压0.04MPa，溶氧水平15-25％，pH6.2，培养28小时发酵结束。测得菌体生物量88g/L。
实施例3：将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中，果糖5g/L，甘油10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，玉米浆15g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵15g/L，硫酸镁1.0g/L，柠檬酸1.0g/L，消泡剂0.20ml/L，在温度35℃，空气流量：0-10小时0.6VVM，10-25小时0.8VVM，25-32小时1.0VVM，罐压0.04MPa，溶氧水平10-25％，pH6.8，培养32小时发酵结束。测得菌体生物量105g/L。
实施例4：取例1中的酶发酵液200ml，加入到胞苷浓度50g/L、鸟苷浓度100g/L的1L水溶液中，调节pH至6.5，在37℃转化4小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，胞苷0.13％，鸟苷纯度0.13％，两种底物的转化率超过99.5％。
实施例5：取例1中的酶发酵液100ml，加入到腺苷浓度70g/L、肌苷浓度100g/L的1L水溶液中，调节pH至6.5，在37℃转化5小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，腺苷0.22％，肌苷纯度0.05％，两种底物的转化率超过99.2％。
实施例6：取例2中的酶发酵液150ml，加入到胞苷浓度100g/L、腺苷浓度100g/L的1L水溶液中，调节pH至6.2，在39℃转化3.5小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，胞苷0.22％，腺苷纯度0.11％，两种底物的转化率超过99.3％。
实施例7：取例3中的酶发酵液50ml，加入到腺苷浓度50g/L、鸟苷浓度100g/L的1L水溶液中，调节pH至6.8，在35℃转化3小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，腺苷0.08％，鸟苷纯度0.10％，两种底物的转化率超过99.5％。
实施例8：取例3中的酶发酵液150ml，加入到肌苷发酵液88g/L、鸟苷发酵液47g/L的1L混合液中，调节pH至6.8，在35℃转化5小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，肌苷0.18％，鸟苷纯度0.11％，两种底物的转化率超过99.5％。
实施例9：取例2中的酶发酵液150ml，加入到鸟苷发酵液38g/L、腺苷发酵液41g/L的1L混合液中，调节pH至6.2，在39℃转化4.5小时，取样进HPLC检测转化液各组分纯度，鸟苷0.27％，腺苷纯度0.16％，两种底物的转化率超过99.3％。
Claims (6)
1.一种核苷磷酸化酶的发酵工艺，它是核苷磷酸化酶的种子接种到培养基上，经过发酵培养，制得含有核苷磷酸化酶的发酵液；其特征在于：所述的培养基包含如下组分：碳源5-30g/L，氮源5-35g/L，硫酸铵0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾2-20g/L，磷酸氢二铵2-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，柠檬酸0.2-1.0g/L，消泡剂0.1-0.2ml/L。
2.根据权利要求1所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺，其特征在于：所述的碳源是指葡萄糖、甘油、果糖中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺，其特征在于：所述的氮源是指大豆蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆粉的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺，其特征在于：所述的酵母粉是指啤酒或者面包酵母粉。
5.根据权利要求4所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺，其特征在于：在核苷磷酸化酶的发酵培养过程中，发酵温度为35-39℃，空气流量0.5-1VVM，罐压0.03-0.05MPa，溶氧水平10-40％，pH值6.0-7.5，发酵周期20-35小时。
6.权利要求1至5任意一项所述的工艺制备的核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷中的应用方法，它是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中，底物浓度为30-200g/L，核苷磷酸化酶相对底物加入量为0.25-2.5ml/g，转化温度35-39℃，pH值6.0-7.0，转化时间1-6小时。
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