CN114507649B

CN114507649B - 嗜热酶及一锅法高效合成udp-葡萄糖和udp-葡萄糖醛酸的方法

Info

Publication number: CN114507649B
Application number: CN202210140823.9A
Authority: CN
Inventors: 解桂秋; 李雅静; 韩涛; 高仁钧
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114507649A

Abstract

嗜热酶及一锅法高效合成UDP‑葡萄糖和UDP‑葡萄糖醛酸的方法，属于生物工程及生物合成技术领域。本发明使用热稳定性更好的嗜热酶(核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～5所示)代替常温酶催化UDP‑Glc的合成反应，并将一锅法反应体系拆分为几个分步反应，对每步反应的条件进行系统优化，最终整合各步反应最适条件的基础上设计一锅法反应条件，以达到高效合成UDP‑Glc和UDP‑GlcUA的目的。与全细胞催化相比，UDP‑Glc终产量提高了约14倍(Leloir途径)和3.5倍(非Leloir途径)。反应合成的UDP‑Glc作为底物进一步合成了药用价值更高的UDP‑葡萄糖醛酸(UDP‑GlcUA)。

Description

嗜热酶及一锅法高效合成UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程及生物合成技术领域，具体涉及一系列嗜热酶及一锅法高效合成UDP-葡萄糖和一锅法高效合成UDP-葡萄糖醛酸的方法。

背景技术

天然小分子的糖基化反应是当今糖生物学的研究热点之一，糖基化对生物体的正常生命活动具有重要意义，该反应是自然界中最普遍也是最重要的修饰作用之一，许多疾病均与蛋白质的异常糖基化相关。在糖基化反应中，糖残基可以转移至大分子上（如蛋白质和脂质等），也可以转移至小分子上（如某些特定的次级代谢产物和寡糖），这些小分子的糖基化作用通常具有深远影响，可以极大地改变被修饰分子的稳定性、溶解度和生物活性等。研究发现葡萄糖醛酸化作用可以将体内的外源或内源亲脂性化合物转变为亲水性化合物，以达到解毒的效果；此外糖基化的小分子还可用作食品添加剂、治疗剂和保健食品等。综上所述，小分子糖基化在科学研究和日常生活中均展现出广阔的应用前景。

糖基化反应通常是由糖基转移酶催化的，尿嘧啶核苷二磷酸（UDP）-葡萄糖依赖的糖基转移酶是目前应用最多的糖基转移酶之一。糖基转移酶可以将糖残基从活化后的糖基供体转移至各种受体上，UDP-葡萄糖（UDP-Glc）是糖基化反应的主要供体之一。目前，UDP-Glc已实现商品化生产，但昂贵的价格（1 g约1700元）及较差的稳定性是限制UDP-Glc依赖的糖基转移酶进一步发展的主要障碍，使糖基转移酶只能停留于实验室研究水平。探索建立高效合成UDP-Glc的方法势在必行。

目前通常采用酶法或化学法合成UDP-Glc。化学法由于立体选择性较低及过程相对复杂等因素，不适合行业的长期发展。因此，酶法合成UDP-Glc逐渐成为主流。改造细胞内代谢途径合成UDP-Glc是研究比较多的一类方法，利用代谢工程改造宿主的UDP-Glc生物合成途径，提高内源性UDP-Glc合成量，并采用全细胞反应与发酵法进行底物的糖基化修饰。专利CN 110699373A改造了大肠杆菌中嘧啶合成途径、改变碳源流量和 UDP-Glc的代谢去路，构建了UDP-Glc高产菌株，并验证了其应用的可行性，在完全避免外源性UDP-Glc使用的情况下，UDP-Glc高产大肠杆菌菌株可实现22.5 g/L甜茶苷高效合成莱鲍迪苷KA，甜茶苷的转化率达到95.7％。专利CN 109371079A以可溶淀粉为主要初始原料，将高温α-葡聚糖磷酸化酶和高温糖-1-磷酸核苷酸化酶分别在大肠杆菌中重组表达，利用表达后的菌体进行高温全细胞催化合成UDP-Glc，省去了酶纯化提取的步骤，节约了时间与成本，简化了操作步骤。但由于全细胞合成的体内代谢网络复杂，反应难操控且产物纯化难度高，产物量偏低。因此，体外一锅法(One-pot)是目前最为常用的酶法UDP-Glc合成策略。然而，现有一锅法合成UDP-Glc的反应中使用的酶均为常温酶，稳定性较差。嗜热酶的应用可以很好地解决这一问题，成为高效合成UDP-Glc的理想选择。

发明内容

本发明的目的是提供一系列嗜热酶（核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示）及一锅法高效合成UDP-葡萄糖（UDP-Glc）和一锅法高效合成UDP-葡萄糖醛酸（UDP- GlcUA）的方法。本发明通过廉价的葡萄糖和麦芽糊精最终得到价值昂贵的UDP-Glc和UDP- GlcUA，且通过优化反应条件最终实现UDP-Glc和UDP- GlcUA的高效合成。

本发明使用热稳定性更好的嗜热酶代替常温酶来催化UDP-Glc的合成反应，整合各嗜热酶的最适反应条件并确定一锅法最优反应条件以达到高效合成UDP-Glc和UDP-GlcUA的目的。除此之外，本发明还引入了两种一锅法直接合成1-磷酸-葡萄糖（1-P -Glc）的方法（非Leloir途径），以期对现有的合成路线进行补充。结果显示，与全细胞（CN109371079A）催化相比，UDP-Glc终产量提高了约14倍（Leloir途径）和3.5倍（非Leloir途径）。反应合成的UDP-Glc作为底物进一步合成了药用价值更高的UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）。

为了达到上述目的，本发明的技术方案具体如下：

首先UDP-Glc合成的关键嗜热酶是分别从实验室保藏的嗜热菌Geobacillus stearothermophilusX1中筛选得到的嗜热葡萄糖激酶GS01513、Thermus thermophilusHB8中筛选得到的嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353、Thermococcus onnurineusNA1中筛选得到的嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191及Thermobifida fusca YX中筛选得到的嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4。

上述四种嗜热酶是通过DNA重组构建大肠杆菌表达菌，再利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂诱导酶表达获得的。首先，通过NCBI GenBank搜索得到来自嗜热细菌Geobacillus stearothermophilusX1的葡萄糖激酶GS01513基因（954 bp，编码317 aa，SEQID No.1）、Thermus thermophilusHB8的磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353基因（1575 bp，编码524 aa，SEQ ID No.2）、Thermococcus onnurineusNA1的麦芽糊精磷酸化酶TON_0191基因（2502 bp，编码833 aa，SEQ ID No.3）及Thermobifida fusca YX的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155基因（930 bp ，编码309 aa，SEQ ID No.4）的核苷酸序列，然后根据四种酶的核苷酸序列SEQ ID No.1-4设计引物，PCR扩增酶基因，并将基因与表达载体pET28a连接构建重组质粒，分别转化大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）感受态细胞构建重组酶表达菌，再经诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导重组酶表达菌表达四种嗜热酶，由于表达蛋白是细胞内可溶蛋白，最后再通过细胞超声破碎、Ni-NTA亲和层析进行分离纯化得到嗜热葡萄糖激酶GS01513、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353、嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155。

本发明设计了两种反应路径，通过一锅法合成UDP-Glc：

路径一是由嗜热葡萄糖激酶GS01513、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353和嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155催化合成得到UDP-Glc（GPUP），该一锅法反应包括三个催化过程：（i）以D-葡萄糖、UTP（尿嘧啶核苷三磷酸）为底物，嗜热葡萄糖激酶GS01513催化合成得到6-P-Glc（6-磷酸-葡萄糖）；（ⅱ）以6-P-Glc为底物，嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353催化合成得到1-P-Glc（1-磷酸-葡萄糖）；（iii）以1-P-Glc和UTP为底物，嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155催化合成得到UDP-Glc并产生反应抑制副产物PPi（焦磷酸），同时嗜热无机焦磷酸酶PPase（专利申请号：202110765804.0，核苷酸序列为SEQID No.6所示）去除副产物PPi ，提高产物合成效率。

由上述四种酶催化的一锅法偶联反应（GPUP）具体实验流程如下：

将UTP和D-葡萄糖按摩尔比2：1加入到50 mM的Na₂HPO₄-NaOH缓冲液（pH 8.0~10.0）中使二者的终浓度分别为50~120 mM，再加入终浓度为5~10 mM的MgCl₂；随后依次加入嗜热葡萄糖激酶GS01513、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155和嗜热无机焦磷酸酶PPase，四种酶的终浓度分别为0.3~0.6 mg/mL；最后于50~60℃下以150~200 rpm振荡反应4~6 h，沸水浴2~5 min终止反应，得到产物UDP-Glc；

路径二是由嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155催化合成得到UDP-Glc（MUP），本次一锅法反应包括两个催化过程：（i）以麦芽糊精为底物，嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191催化合成得到1-P-Glc；（ⅱ）以1-P-Glc和UTP为底物，嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155催化合成得到UDP-Glc并产生反应抑制副产物PPi（焦磷酸），同时嗜热无机焦磷酸酶PPase去除副产物PPi，提高产物合成效率。

以上述三种酶催化的一锅法偶联反应（MUP）具体实验流程如下：

将麦芽糊精和UTP溶于200 mM 的磷酸钾缓冲液（pH 7.0~7.5）中，麦芽糊精的最终质量浓度为5%，UTP的终浓度为50~120 mM；然后加入MgCl₂使其终浓度为5 mM，再依次加入嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155和嗜热无机焦磷酸酶PPase，三种酶的终浓度分别为0.3~2.0 mg/mL；最后于60~70℃、150~200 rpm下振荡反应4~6 h，再加入等体积的反应终止液（2 mM PABA和14 mM SDS的混合液）终止反应，得到产物UDP-Glc。

将本发明合成的UDP-Glc作为底物，利用嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630，可进一步催化合成得到UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA），最终构建了嗜热酶法合成UDP-Glc和UDP- GlcUA的方法。嗜热酶法合成UDP- GlcUA的方法中使用的嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630来源于嗜热菌Geobacillus stearothermophilusX1，利用基因重组技术构建大肠杆菌表达菌发酵生产，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述合成UDP- GlcUA的具体方法：依次添加终浓度为 2~5 mM 的UDP-Glc、4~10mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及0.2~2.0 mg/mL 的嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630至50 mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液（pH 7~8）中，然后于37℃以 150~200 rpm振荡反应1~3 h，再加入等体积反应终止液（2 mM PABA和14 mM SDS的混合液）终止反应，从而得到UDP- GlcUA。

附图说明

图1：GPUP及MUP一锅法级联反应合成UDP-Glc的薄层层析检测图；其中1为UDP-葡萄糖，2为GPUP反应，3为MUP反应，4为对照组；对照组和实验组相比不加酶，结果表明GPUP和MUP反应路径都能高效合成UDP-Glc。

图2：以UDP-Glc为底物合成UDP-GlcUA的薄层层析检测图；其中1为UDP-葡萄糖，2为实验组；结果为UV254nm 下观测的产物荧光点，结果显示嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630可以催化UDP-Glc生成UDP-GlcUA。

图3：UDP-葡萄糖（UDP-Glc）的1H NMR结果谱图；1HNMR（400MHz ， D₂O） δ 7.87 (d, J=8.02 Hz , 1H) , 5.89 (d , J=8.6 Hz , 1H) , 5.51 (t , J=9.92 Hz , 1H) ,4.70 (D₂O) , 4.29 (s , 1H) , 4.15 (t , J=24.88 Hz , 1H) , 3.79 (t , J=13.2 Hz, 1H) , 3.71-3.66 (m , 1H) , 3.46-3.35(m , 1H)，该核磁结果证明GPUP和MUP反应得到的物质是UDP-Glc。

图4：UDP-葡萄糖醛酸（UDP- GlcUA）的1H NMR结果谱图；1HNMR（400MHz，D₂O） δ7.80d , J=8.14 Hz , 1H) , 5.835 (t , J=7.88 Hz , 2H) , 5.46(d , J=11.12 Hz ,1H) , 4.63 (D₂O) , 4.215 (d , J=4.04 Hz , 1H) , 4.13 (s , 1H) , 3.07-4.03 (m, 1H) , 3.99 (s , 1H) , 3.97(s , 1H) , 3.63 (t , J=18.92 Hz , 1H) , 3.50 (s ,1H) , 3.43-3.37 (m , 1H) , 3.35 (t , J=9.72 Hz , 1H) ，该核磁结果证明嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630催化反应得到的物质是UDP-GlcUA。

图5：嗜热葡萄糖激酶GS01513催化合成6-P-Glc的反应时间进程曲线；横坐标为反应时间（min），纵坐标为底物的转化率（%），结果表明反应20 min达到平衡，最终葡萄糖的转化率可达95%以上。

图6：嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353催化合成1-P-Glc的反应时间进程曲线；横坐标为反应时间（min），纵坐标为底物的转化率（%），结果表明反应10 min达到平衡，最终6-P-Glc的转化率可达75%以上。

图7：嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191催化合成1-P-Glc的反应时间进程曲线；横坐标为反应时间（min），纵坐标为底物的转化率（%），结果表明反应180 min达到平衡，最终1-P-Glc的转化率可达65%以上。。

图8：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155催化合成1-P-Glc的反应时间进程曲线；横坐标为反应时间（min），纵坐标为底物的转化率（%），结果表明反应50 min达到平衡；添加无机焦磷酸酶PPase可以使转化率达到80%，较未加无机焦磷酸酶组提高1倍以上。

图9：嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630 催化合成UDP-葡萄糖醛酸的毛细管电泳曲线；由上至下四条曲线分别为UDP-Glc+PAPB（PAPB为反应终止液，具体反应见实施例3）、NAD⁺、实验组和对照组，其中对照组与实验组相比只是不添加酶。其中1为NAD⁺，2为NADH，3为UDP-Glc，4为PABA，5为UDP-GlcUA；由图显示毛细管电泳可以分离得到产物UDP-GlcUA，通过与标准品对比可以直观看出嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630催化反应得到的物质是UDP-GlcUA。

具体实施方式

实施例1：GS01513、TTHA0353、TON_0191、IM867_06155和N231_05630工程菌的构建及蛋白的表达纯化，包括以下步骤：

1. GS01513、TTHA0353 、TON_0191、IM867_06155和N231_05630基因的扩增

五种嗜热酶基因扩增的引物序列如下：

（1）嗜热葡萄糖激酶GS01513：

上游引物：GAGGGAGAATTCATGGAACAATGGTTGGTAGG，横线处为限制酶EcoR Ⅰ识别位点；

下游引物：ATATTTTACTCGAGTTAGGCGCCGATGAGCGATTTC ，横线处为限制酶Xho Ⅰ识别位点；

（2）嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353：

上游引物：ACAATGGCCATATGGAGATCACCCGGCTC ，横线处为限制酶Nde Ⅰ识别位点；

下游引物：GAAAGCGAATTCTCAGGCGAGGGCCTTG，横线处为限制酶EcoR Ⅰ识别位点；

（3）嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191：

上游引物：TAATTGGGATCCATGGCCGACGTTGAAAC，横线处为限制酶BamH Ⅰ识别位点；

下游引物：GCGGGGGAATTCTCACTCAAAGAAACCT，横线处为限制酶EcoR Ⅰ识别位点。

4）嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155：

上游引物：ATCGTGGAATTCATGACAGATGAACAGCACT，横线处为限制酶EcoR Ⅰ识别位点；

下游引物：CGTTTCCTCGAGTTACCTGGTGGAGTCTGT，横线处为限制酶Xho Ⅰ识别位点。

5）嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630：

上游引物：TGAGGACATATGAAGATAGCGATTGCGGGA，横线处为限制酶Nde Ⅰ识别位点；

下游引物：CTAACCGAATTCTCATTCGTGATGCTCCAC，横线处为限制酶EcoR Ⅰ识别位点。

五种酶的PCR反应体系如下

表1： PCR反应体系

组分	体积（μL）
		基因组DNA	1
10×Easy Pfu缓冲液	10
		2.5 mM dNTPs	10
上游引物（10 μM）	1
		下游引物（10 μM）	1
Easy Pfu DNA聚合酶	2
		无菌水（ddH₂O）	75
总体积	100

PCR反应条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，2.41 min，30个循环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

2. 重组表达菌的构建及酶蛋白的表达

将嗜热葡萄糖激酶GS01513的PCR产物用限制酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切、嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切，载体pET28a也分别用相应的限制酶酶切。酶切体系如下：

表2：载体质粒的酶切反应体系

组分	体积（μL）
		10×缓冲液	5
PCR产物或pET-28a质粒	40
		限制性内切酶 Ⅰ	2.5
限制性内切酶 Ⅱ	2.5
		总体积	50

于 37 ℃孵育4 h得到酶切产物。其中，载体pET28a酶切产物继续进行去磷酸化反应。向酶切体系中依次加入5.5 μL Fast 碱性磷酸酶（AP） Buffer和0.5 μL Fast AP后继续孵育30 min得到酶切产物，随后将5 µL酶切产物与3 µL pET28a载体片段、1 µL 10×T4DNA buffer和1 µL T4 DNA Ligase混合，16 ℃连接过夜。取10 µL连接混合物转化100 µL大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），培养至OD600为0.6-1.0时加入0.5 mM IPTG于25 ℃振荡培养过夜，诱导目标蛋白的表达。

质粒的提取、大肠杆菌感受态细胞制备及载体转化方法参照“分子克隆实验指南”（第三版，科学出版社，2002年）。

实施例2：UDP-Glc的大量合成

UDP-Glc的一锅法合成主要包括两种途径

1、以D-葡萄糖为初始底物级联一锅法（GPUP）合成UDP-Glc具体反应方程如下：

具体实验反应条件如下：

将D-葡萄糖和UTP加入50 mM Na₂HPO₄-NaOH缓冲液（pH 8.0）中使其终浓度达到60mM和120 mM再加入MgCl₂（终浓度为6 mM）、嗜热葡萄糖激酶GS01513（终浓度为0.6 mg/mL）、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353（终浓度为0.3 mg/mL）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155（终浓度为0.3 mg/mL）和嗜热无机焦磷酸酶PPase（终浓度为0.3 mg/mL），以无酶反应体系为空白对照，于60 ℃、180 rpm振荡反应5 h后，沸水浴3 min终止反应。反应液离心（13000 rpm，10 min）后取适量上清进行产物的毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis，CE）检测。产物UDP-Glc的产量可达29.6 mM，CN109371079A合成UDP-Glc的产量约2.1mM，与其相比的最大产量提高了约14倍。

2、以麦芽糊精为初始底物级联一锅法合成UDP-葡萄糖（MUP）的具体反应方程如下：

具体实验反应条件如下：

依次加入终浓度为5%的麦芽糊精和100 mM UTP溶于200 mM Na₂HPO₄-NaOH缓冲液中（pH 7.5），加入MgCl₂（终浓度为5 mM），加入嗜热麦芽糊精磷酸化酶TON_0191 （终浓度为2.0 mg/mL）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155 （终浓度为0.6 mg/mL）和嗜热无机焦磷酸酶PPase（终浓度为 0.3 mg/mL），于60 ℃、180 rpm振荡反应5 h后，反应结束后取部分样品加入等比例反应终止液（2 mM PABA和14 mM SDS混合液），混合均匀后通过CE检测生成的UDP-Glc。结果显示终产率可达14.09%，产量为9.1mM，比专利CN 109371079A的最大产量提高了3.5倍左右。

毛细管电泳检测：UDP-Glc在254 nm处具有强紫外吸收，可通过毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）对其进行定量。本发明使用来自贝克曼公司的P/ACETMMDQ高效毛细管电泳系统，配备裸熔融弹性石英毛细管和光电二极管阵列（PDA）检测器。分离过程在有效长度为50 cm（总长60 cm，内径75 μm）的毛细管中进行，CE缓冲液配制方法：50 mM 乙酸铵，1 mM EDTA，1 M NaOH调pH至9.2。电泳条件：阳极加压上样（0.5 psi，5 s），液冷控温23 ℃，PDA检测器波长设置为254 nm，于15 kV（0.1 psi辅助分离）下电泳20 min，相邻样品的检测之间均使用CE缓冲液清洗（10 psi，10 min）。

实例3：嗜热酶法合成UDP-葡萄糖醛酸

以实施例2合成的UDP-Glc为底物，使用嗜热尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶N231_05630催化UDP-Glc脱氢合成UDP-葡萄糖醛酸，反应体系见表3。

表3：酶法合成UDP-葡萄糖醛酸的反应体系

将终浓度5 mM UDP-Glc，5 mM NAD⁺加入到50 mM Na₂HPO₄-NaOH缓冲液中（pH 7.3）中，加入1 mg/mL的N231_05630于37℃、160rpm振荡反应1 h后，加入反应终止液（2 mM PABA和14 mM SDS混合液）混匀后进行CE检测参照实例2。结果显示产率可达84%，产量2.44 mg/mL。专利CN112608960A利用尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶氧化UDP-Glc生成UDP-葡萄糖醛酸的产量为1.01 mg/mL，本发明较其提高了2.4倍。

<110> 吉林大学

<120>嗜热酶及一锅法高效合成UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸的方法

<130> 2022.2.16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> Geobacillus stearothermophilus X1

<221> CDS

<222> (1)..(954)

<400> 1

atg gaa caa tgg ttg gta ggc atc gat ctt ggc ggc acg acg acg aag 48

atg gcg ttt att aca gaa gac gga att att gta cac aaa tgg gaa att 96

cca aca gac acg tcc aac cgc ggc gaa cgg atc gtc gcc cat atc gcc 144

cgg tcg ttg gat gaa acg ctc gcc cgg ctt ggc gga acg aaa gaa cag 192

ctg ctc gcc atc gga atc ggc gcc ccc ggg ccg gtt cag gaa gaa aca 240

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ggg gcg cgc cat ttg ctg ttt gtg acg ctc ggc acc ggc gtt ggc ggc 432

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gga gaa atc ggc cat atg acg atg gtt gca gac ggc ggc gcg ccg tgc 528

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gcg ctc cgc ggc ggc gat gtc acc gcc aaa gct gtg ttt gac gcc gcc 672

aaa acg ggg gat gcg ctc gcg ctt gag gtt gtt gag gag gtg acg cgc 720

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aaa att gtg atc ggc ggc ggt gtc tcg aag gcg ggg gca ctg ctc gtt 816

gag cat gtc gcc gcc cat ttc cgc cgc tat gct ttt ccg cgt gtc gcc 864

gcc gga gcg gag atc gtg ctg gca acg ctc ggc aat gac gcc gga gtc 912

atc ggc ggc gcc tgg ttg gcg aaa tcg ctc atc ggc gcc taa 954

<210> 2

<211> 1575

<212> DNA

<213> Thermus thermophilus HB8

<221> CDS

<222> (1)..(1575)

<400> 2

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<210> 4

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<213> Thermobifida fusca YX

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<222> (1)..(930)

<400> 4

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ccc gtg gca gga ctg ggg acg aga ttc ctc ccc gcc act aag tcc acg 96

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<210> 5

<211> 1341

<212> DNA

<213> Geobacillus stearothermophilus X1

<221> CDS

<222> (1)..(1341)

<400> 5

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ccg cgc atc ggc cgc cgc ttt ttg cgc gcc ggc gtc ggg tat ggc ggc 768

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cac ggc tat tcg ctc aaa acg gta tgg gcg gcg atc gac gtc aat gag 864

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gaa gcc gcc ggc tta atc tac gag tcg att ggg cgg ccg gtg gtg gtc 1296

gga tgg caa agc gcg ata aag gaa acg gtg gag cat cac gaa tga 1341

<210> 6

<211> 537

<212> DNA

<213> Thermococcus onnurineus

<400> 6

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Claims

1.一种嗜热酶一锅法高效合成UDP-葡萄糖的方法，其特征在于：将UTP和D-葡萄糖按摩尔比1：1加入到50 mM 、pH 8.0~10.0的Na₂HPO₄-NaOH缓冲液中使二者的终浓度分别为50~120 mM，再加入终浓度为5~10 mM的MgCl₂；随后依次加入嗜热葡萄糖激酶GS01513、嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353、嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155和嗜热无机焦磷酸酶PPase，四种酶的终浓度分别为0.3~0.6 mg/mL；最后于50~60℃下以150~200 rpm振荡反应4~6 h，沸水浴2~5 min终止反应，得到产物UDP-葡萄糖；其中，UTP为尿嘧啶核苷二磷酸，嗜热葡萄糖激酶GS01513的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，嗜热磷酸葡萄糖变位酶TTHA0353的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，嗜热尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶IM867_06155的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，嗜热无机焦磷酸酶Ppase的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。