CN110846361A - 一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，具体包括以下步骤：(1)制备UDPG生产酶、(2)固定化UDPG生产酶、(3)分离产物；本发明采用UGP、SPA两种UDPG生产酶，只需两步酶促反应即可合成UDPG，与化学和发酵法生产UDPG繁琐的工艺过程相比，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备UDPG，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本；同时避免了使用酵母引入的大量色素和其他类型核苷酸等杂质，更加易于纯化；该方法适用于大规模生产UDPG。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法。
背景技术
UDPG的合成主要是化学合成、发酵法、酶法转化。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛刻，有机溶剂用量大，环境污染严重，反应周期长，得率低。发酵法也存在着产率低的缺点。由于酶对底物具有较强的立体选择性和专一性使酶法合成UDPG成为一种简便易行的方式。而且，近年基因重组技术的快速发展，能够以较低的成本大规模生产各种酶，使酶合成法的优势更为显著。
酶法合成糖核苷酸主要是以NTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶作用下生成。如中国科技大学祁超等以UTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，通过大肠杆菌表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在65～85％。日本Yamasa公司采用面包酵母生产UDPG，转化率只有28％。Agnes W.H.TAN利用纯的己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDPG焦磷酸化酶、焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在85％，但是用纯酶价格比较高，也限制了其工业化生产使用。
有专利报道(201310499761.1)，以尿苷三磷酸或其盐、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶粗酶液和麦芽糊精磷酸化酶粗酶液作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。该方法利用游离酶生产尿苷二磷酸葡萄糖，酶活下降迅速，无法有效的回收利用，势必会导致生产成本过高，影响了实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，将尿苷二磷酸葡萄糖生产酶固定化，可实现酶的重复和连续利用，大大降低了生产成本，同时固定化酶的使用，产物更容易纯化产品质量更加稳定。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备UDPG生产酶：将UDPG生产酶固定于固定化载体上，采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9，UGP)、蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPA)两种酶促反应即可合成，制备固定化UDPG生产酶；
(2)固定化UDPG生产酶：利用固定化UDPG生产酶，催化制备得到二磷酸尿苷葡萄糖反应液，过滤收集载体，得固定化UDPG生产酶；
(3)分离产物：将上述固定化UDPG生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
优选地，所述制备UDPG生产酶：制备高表达UGP、SPA菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含UGP的菌体1.0-2.0kg，含SPA的菌体0.5-0.8kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得UDPG生产酶。
优选地，所述固定化UDPG生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述UDPG生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌4-6h；过滤收集载体，用0.1MpH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤2-4遍，得固定化UDPG生产酶。
优选地，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含UTP 250-350g，磷酸二氢钾400-500g，含氯化镁110-130g，蔗糖550-650g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化UDPG生产酶0.5-0.8kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应4-6h后，经高效液相色谱检测UDPG的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用UGP、SPA两种UDPG生产酶，只需两步酶促反应即可合成UDPG，与化学和发酵法生产UDPG繁琐的工艺过程相比，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定。
2、采用固定化酶催化的方法制备UDPG，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本；同时避免了使用酵母引入的大量色素和其他类型核苷酸等杂质，更加易于纯化；该方法适用于大规模生产UDPG。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一：
一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备UDPG生产酶：将UDPG生产酶固定于固定化载体上，采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9，UGP)、蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPA)两种酶促反应即可合成，制备固定化UDPG生产酶；
(2)固定化UDPG生产酶：利用固定化UDPG生产酶，催化制备得到二磷酸尿苷葡萄糖反应液，过滤收集载体，得固定化UDPG生产酶；
(3)分离产物：将上述固定化UDPG生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
具体的，所述制备UDPG生产酶：制备高表达UGP、SPA菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含UGP的菌体1.0kg，含SPA的菌体0.5kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得UDPG生产酶。
具体的，所述固定化UDPG生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述UDPG生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌4h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤2遍，得固定化UDPG生产酶。
具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含UTP 250g，磷酸二氢钾400g，含氯化镁110g，蔗糖550g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化UDPG生产酶0.5kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应4h后，经高效液相色谱检测UDPG的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)200g。
实施例二：
一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备UDPG生产酶：将UDPG生产酶固定于固定化载体上，采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9，UGP)、蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPA)两种酶促反应即可合成，制备固定化UDPG生产酶；
(2)固定化UDPG生产酶：利用固定化UDPG生产酶，催化制备得到二磷酸尿苷葡萄糖反应液，过滤收集载体，得固定化UDPG生产酶；
(3)分离产物：将上述固定化UDPG生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
具体的，所述制备UDPG生产酶：制备高表达UGP、SPA菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含UGP的菌体2.0kg，含SPA的菌体0.8kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得UDPG生产酶。
具体的，所述固定化UDPG生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述UDPG生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌6h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤4遍，得固定化UDPG生产酶。
具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含UTP 350g，磷酸二氢钾500g，含氯化镁130g，蔗糖650g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化UDPG生产酶0.8kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应6h后，经高效液相色谱检测UDPG的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)250g。
实施例三：
一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备UDPG生产酶：将UDPG生产酶固定于固定化载体上，采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9，UGP)、蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPA)两种酶促反应即可合成，制备固定化UDPG生产酶；
(2)固定化UDPG生产酶：利用固定化UDPG生产酶，催化制备得到二磷酸尿苷葡萄糖反应液，过滤收集载体，得固定化UDPG生产酶；
(3)分离产物：将上述固定化UDPG生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
具体的，所述制备UDPG生产酶：制备高表达UGP、SPA菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含UGP的菌体1.5kg，含SPA的菌体0.7kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得UDPG生产酶。
具体的，所述固定化UDPG生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述UDPG生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌5h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤3遍，得固定化UDPG生产酶。
具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含UTP 300g，磷酸二氢钾450g，含氯化镁120g，蔗糖600g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化UDPG生产酶0.7kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应5h后，经高效液相色谱检测UDPG的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)230g。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，其特征在于,具体包括以下步骤：
(1)制备UDPG生产酶：将UDPG生产酶固定于固定化载体上，采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9，UGP)、蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPA)两种酶促反应即可合成，制备固定化UDPG生产酶；
(2)固定化UDPG生产酶：利用固定化UDPG生产酶，催化制备得到二磷酸尿苷葡萄糖反应液，过滤收集载体，得固定化UDPG生产酶；
(3)分离产物：将上述固定化UDPG生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，其特征在于，所述制备UDPG生产酶：制备高表达UGP、SPA菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含UGP的菌体1.0-2.0kg，含SPA的菌体0.5-0.8kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得UDPG生产酶。
3.根据权利要求1所述的一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，其特征在于，所述固定化UDPG生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述UDPG生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌4-6h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤2-4遍，得固定化UDPG生产酶。
4.根据权利要求1所述的一种固定化酶法制备二磷酸尿苷葡萄糖的方法，其特征在于，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含UTP 250-350g，磷酸二氢钾400-500g，含氯化镁110-130g，蔗糖550-650g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化UDPG生产酶0.5-0.8kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应4-6h后，经高效液相色谱检测UDPG的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化UDPG生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得二磷酸尿苷葡萄糖干粉(UDPG)。
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