CN105219665B - 一种低聚异麦芽糖的制造方法及其催化剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以淀粉及其衍生物为原料，酶法生产低聚异麦芽糖的方法，通过将来源于黑曲霉的α‑葡萄糖苷酶编码基因组合表达，并由固定化α‑葡萄糖苷酶催化合成低聚异麦芽糖和由非水双相体系进行产品‑固定化酶的快速分离与再循环。本发明以双相反应体系，加入固定化α‑葡萄糖苷酶微球催化生产低聚异麦芽糖，反应完成后固定化酶可自动分配到有机相中，实现固定化酶与产物的分离。本发明具有反应条件温和，无需添加其它交联剂，经济性好，降低生产成本，固定化酶酶活回收率高，操作稳定性好等特点。采用本发明方法得到的低聚异麦芽糖产品，可广泛应用于医药、食品、饲料等重要领域。

Description

一种低聚异麦芽糖的制造方法及其催化剂

技术领域：

本发明涉及低聚异麦芽糖的生产方法，具体涉及其催化剂产生菌株的选育方法、微生物发酵法制备催化用酶制剂的方法、催化剂的固定化方法、催化剂的有效分离方法、重复使用方法及低聚异麦芽糖的连续生产方法。

背景技术：

低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharides，以下简称IMO)，又称分枝低聚糖、异麦芽低聚糖等，是葡萄糖之间至少有一个以a-1,6糖苷键结合而成的、单糖数为2～6不等的一类低聚糖。它的主要成分是异麦芽糖(IG₂)、潘糖(P)、异麦芽三糖(IG₃)及异麦芽四糖(G_n)等。低聚异麦芽糖属于非可消化性低聚糖，其不可以作为人体能量的直接来源，但其能选择性的增殖肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌，其代谢的短链脂肪酸能够降低肠道的pH，抑制有害菌的生长，来维持肠道微生态的平衡；另外，这些短链脂肪酸可以为其它微生物提供能量，所以又称功能性低聚糖。低聚异麦芽糖的商业产品规格主要有两种：IMO-50型(IG₂+P+IG₃+G_n≥50％)和IMO-90型(IG₂+P+IG₃+G_n≥90％)。IMO-50中含有一定量的葡萄糖、麦芽糖，而IMO-90中含较少葡萄糖和麦芽糖，产品纯度较高，是在IMO-50基础上经过纳滤分离制取的高纯度低聚异麦芽糖。工业化生产IMO的主要方法是用葡萄糖苷酶催化麦芽糖转苷为IMO，再经脱色、浓缩、干燥而成。

α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶(α-glucosidase,EC.3.2.1.20)，系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反应中具有水解和转糖苷的双重作用。水解作用可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；转糖苷作用又可将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(简称IMO)。

自20世纪80年代日本从黑曲霉中筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种，并得以工业化生产酶制剂以来，α-葡萄糖苷酶在基础研究和工业生产上发挥着越来越重要的作用。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，酶活较高；而国内主要以粗酶液为主，酶活较低。而且，国内尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制剂出售，用于生产的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵，并且在IMO的生产过程中该酶是一次性使用，难以回收利用，存在来源不稳定、消耗大等严重问题，导致IMO的生产成本居高不下，一定程度上制约了我国IMO产业的发展，而固定化酶技术是实现酶重复连续使用和改善稳定性的有效手段，为这些问题的解决提供了有效的手段。与游离酶相比，固定化酶具有储存稳定性高、易于分离回收、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点，不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且具有节省能源与资源、减少污染的生成。

但固定化酶在催化反应完成后，需要回收重复利用，目前工厂中普遍使用柱式、膜反应器等装置来实现固定化酶的回收，这一操作要求设备复杂，操作性高等缺点。而疏水性双相反应体系可自然形成双相，选择合适的溶剂，即不影响酶在生产低聚异麦芽糖的催化活性，又能将固定化酶分配到有机相，有利于酶的重复性使用及产品的纯化。

发明内容

本发明的目的是借助现代分子生物学技术，选育可高效表达α-葡萄糖苷酶的生产菌种，建立α-葡萄糖苷酶的大宗制备工艺和固定化工艺，并形成高效制造高品质低聚异麦芽糖的技术。

为了实现上述目的：

本发明所采用的技术方案之一是，克隆黑曲霉中α-葡萄糖苷酶的编码基因agC,agD，并通过在毕赤酵母GS115中串联表达上述两个基因，获得可催化淀粉来源的麦芽糖浆形成低聚异麦芽糖占干物质比重显著提高的重组菌株；

所述编码基因agC核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述编码基因agD核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明所采用的技术方案之二是，使用技术方案一所述的重组菌株发酵生产α-葡萄糖苷酶，具体如下：

(1)种子培养：菌株经两级种子培养，OD₆₀₀测定为10时用于发酵罐接种；

(2)发酵培养：以BSM培养基为发酵培养基，接种量2～10％，接种同时加入微量元素PTM1母液，发酵温度为28～33℃，pH维持4～7，DO维持20％以上；

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约14～24h，甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长阶段；

补料生长阶段：流加50％甘油，每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液，初始流加速度为3.0～9.0mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段；

诱导产酶阶段：流加甲醇，每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液，初始流加速率为1.2～3.6mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min，2h后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min，诱导70～96h后发酵结束；

(3)发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品；或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。

本发明所采用的技术方案之三是，是提供一种技术方案二制备的α-葡萄糖苷酶的固定化酶，其固定化形式可以是丙烯酰胺、羟基琥珀酰亚胺、亚甲基(双丙烯酰胺)三元聚合物载体，也可以是大孔环氧基载体、非大孔环氧基载体及环氧基磁性载体。壳聚糖，聚碳酸乙烯撑脂(PVCA)载体，甲基丙烯酸类载体，二乙烯基苯交联下,丙烯酸胺(AM)、丙烯腈(AN)，AOT(二(2—乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠)/正庚烷/水/明胶组成的反相微乳凝胶，磁性高分子微球类载体，无机硅藻土或多孔玻璃为载体；

固定化步骤如下：

(1)固定化载体预处理：载体1～15g，加入2～60mL浓度为1M，pH为pH 4.0～9.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，20℃～45℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2～4遍；

(2)配制α-葡萄糖苷酶液：将方案二所产α-葡萄糖苷酶0.1～3g溶解于pH5.0～7.0的浓度为2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含α-葡萄糖苷酶的溶解液；

(3)α-葡萄糖苷酶的固定化：将步骤(2)配制的α-葡萄糖苷酶液中加入步骤(1)预处理好的固定化载体1g，于20℃～55℃，200r/min摇床反应24h，收集反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，用pH 2.0～8.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤滤渣2～5次，收集洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃～15℃冰箱，即制备出固定化α-葡萄糖苷酶。

进一步的，所述载体为环氧树脂载体—聚酰胺树脂ES-4；

进一步地，固定化所用载体的预处理条件为pH为7.5～8.5，温度20℃～30℃；

进一步地，α-葡萄糖苷酶固定化制备条件为pH 5.0～7.0，温度20℃～30℃。

本发明所采用的技术方案之四，是采用技术方案二所提供的α-葡萄糖苷酶发酵生产低聚异麦芽糖的方法，所述α-葡萄糖苷酶可以以游离酶形式存在，也可以以固定化酶形式存在，

当使用游离形式α-葡萄糖苷酶时，将淀粉经液化酶液化后，每Kg淀粉(干)加入游离型α-葡萄糖苷酶10000U～150000U，将酶按照换算好的总量加入到20％(w/v)的麦芽糖浆中，控制反应液在pH 5.0～7.0，温度在30℃～40℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应20～40h。

当使用固定化α-葡萄糖苷酶时，使用疏水性双向萃取工艺制备生产低聚异麦芽糖，按每Kg淀粉(干)加入制备好的固定酶10000U～150000U，将固定化酶加入到20％(w/v)的麦芽糖浆中，再加入用于固定化载体及固定化酶回收的萃取液，控制反应液在pH 5.0～7.0，温度在30℃～40℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应20～40h；进一步地，所述萃取液为甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，己酸乙酯，己酸己酯中的一种；

进一步地，所述萃取液与麦芽糖浆的体积比为2～40:60～98；

更进一步地本发明中的α-葡萄糖苷酶固定化酶可以连续进行多批次的反复催化制备低聚异麦芽糖浆。

本发明通过以下具体的方法步骤来实现的：

步骤1，以黑曲霉mRNA反转录制备的cDNA为模板，根据NCBI公布的agA、agB、agC、agD、agE、agF基因序列，设计上下游引物，并通过PCR的方法分别扩增上述基因；

步骤2，将步骤1中获得的基因片段分别克隆入整合表达载体pPIC9k的SnaBI位点，分别获得对应的重组质粒；

步骤3，以步骤2中的重组质粒为模板设计上下游引物，通过PCR扩增的方式获得带有来源于pPIC9k的启动子序列和终止子序列的α-葡萄糖苷酶相关基因片段，并分别克隆入步骤2中相关质粒的XbaI位点(相关质粒经XbaI酶切后pfu等DNA多聚酶补平，连接对应片段)，获得α-葡萄糖苷酶相关基因串联表达的重组质粒；

步骤4，将步骤2和步骤3所获得重组质粒经SalI或SacI线性化后电击转化入GS115细胞，并经组氨酸营养缺陷型和G418抗性筛选获得高拷贝的产α-葡萄糖苷酶重组菌株；

步骤5，将步骤4获得的重组菌株进行摇瓶发酵试验并通过麦芽糖为底物的酶解验证试验筛选出最优的α-葡萄糖苷酶产生菌；

步骤6，建立步骤5所筛选出的最优α-葡萄糖苷酶产生菌的发酵工艺和α-葡萄糖苷酶的制备工艺；

步骤7，在10m³～30m³体系下制备α-葡萄糖苷酶；

步骤8，将步骤7制备的α-葡萄糖苷酶与固定化载体偶联，制备α-葡萄糖苷酶固定化酶；

步骤9，将步骤7和步骤8制备的α-葡萄糖苷酶分别用于低聚异麦芽糖的制备。

步骤10，将步骤9中用于低聚异麦芽糖制备的α-葡萄糖苷酶固定化酶回收并用其二次制备低聚异麦芽糖，随后多批次重复回收α-葡萄糖苷酶固定化酶的回收和连续制备低聚异麦芽糖浆。

有益效果：

1、本发明提供了一种高品质低聚异麦芽糖的制造工艺，所制备的低聚异麦芽糖核心组成(IG₂+P+IG₃)占干物质的比例达到45％～58％甚至更高，发酵液中酶活达到70000-80000U/mL；

2、本发明的低聚异麦芽糖的制造工艺所涉及的α-葡萄糖苷酶采用了新型表达和组合表达方式，具有显著提高的催化性能，串联基因agCD表达酶活为2540U/mL，与单个基因agC的表达酶活155U/mL和agD的表达酶活1271U/mL相比效果显著，属于意料之外的技术效果；

3、本发明的α-葡萄糖苷酶固定化有助于α-葡萄糖苷酶在反复催化过程中保持较高的催化活性和极低的酶量损失，固定化酶制备的低聚异麦芽糖占干物质比例47.7～55％，可以进行多批次的连续使用,反复使用50批次后酶活力为初始值的95.7％；

4、本发明的低聚异麦芽糖制备工艺充分结合了α-葡萄糖苷酶的酶学特性和催化特定，可以高效完成糖浆的制备过程。

附图说明：

图1游离型α-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖样本HPLC解析图谱

图2固定化α-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖样本HPLC解析图谱

图3低聚异麦芽糖浆生产流程示意图

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进行进一步说明；下述实施例并不限定本发明，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：α-葡萄糖苷酶编码基因片段的获得

采用液氮研磨法提取黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88菌株的mRNA，在逆转录酶的作用下用Oligo(dT)作为引物进行RT-PCR，反转录制备cDNA。以此cDNA为模板，根据NCBI公布的α-葡萄糖苷酶相关基因——agA，agB，agC，agD，agE，agF基因序列，设计上下游引物AGA-1(SEQ ID NO:3)和AGA-2(SEQ ID NO:4)、AGB-1(SEQ ID NO:5)和AGB-2(SEQ IDNO:6)、AGC-1(SEQ ID NO:7)和AGC-2(SEQ ID NO:8)、AGD-1(SEQ ID NO:9)和AGD-2(SEQ IDNO:10)、AGE-1(SEQ ID NO:11)和AGE-2(SEQ ID NO:12)、AGF-1(SEQ ID NO:13)和AGF-2(SEQ ID NO:14)，并通过PCR的方法分别扩增获得大小为1815bp的agA，2892bp的agB，2229bp的agC，2958bp的agD，1764bp的agE和1968bp的agF基因片段。

实施例2：α-葡萄糖苷酶单基因整合表达载体的构建

将实施例1中获得基因片段克隆入pPIC9k质粒的SnaBI位点，分别获得重组质粒pPIC9k-agA，pPIC9k-agB，pPIC9k-agC，pPIC9k-agD，pPIC9k-agE，pPIC9k-agF。

实施例3：α-葡萄糖苷酶双基因串联整合表达载体的构建

以实施例2中的重组质粒为模板设计上下游通用引物AOX1(SEQ ID NO:15)和AOX2(SEQ ID NO:16)，通过PCR扩增的方式获得带有来源于pPIC9k的启动子序列和终止子序列的α-葡萄糖苷酶相关基因片段，AOX-agA，AOX-agB，AOX-agC，AOX-agD，AOX-agE，AOX-agF。并分别克隆入步骤2中对应质粒的XbaI位点(对应质粒经XbaI酶切后pfu等DNA多聚酶补平，连接对应片段)，获得α-葡萄糖苷酶相关基因串联表达的重组质粒pPIC9k-agAB，pPIC9k-agAC，pPIC9k-agAD，pPIC9k-agAE，pPIC9k-agAF，pPIC9k-agBC，pPIC9k-agBD，pPIC9k-agBE，pPIC9k-agBF，pPIC9k-agCD，pPIC9k-agCE，pPIC9k-agCF，pPIC9k-agDE，pPIC9k-agDF，pPIC9k-agEF。

实施例4：产α-葡萄糖苷酶重组菌的构建

将实施例2和实施例3中的重组质粒经SalI或SacI线性化后电击转化入GS115细胞，并经组氨酸营养缺陷型和G418抗性筛选获得高拷贝的产α-葡萄糖苷酶重组菌株，分别命名为GS115-agA，GS115-agB，GS115-agC，GS115-agD，GS115-agE，GS115-agF，GS115-agAB，GS115-agAC，GS115-agAD，GS115-agAE，GS115-agAF，GS115-agBC，GS115-agBD，GS115-agBE，GS115-agBF，GS115-agCD，GS115-agCE，GS115-agCF，GS115-agDE，GS115-agDF，GS115-agEF。

实施例5：α-葡萄糖苷酶最优产生菌的筛选

将实施例4中的重组菌接种G418抗性平板(G418终浓度0.5～4mg/mL)，单菌落接种液体YPD培养基(250mL三角瓶装液量30mL)30℃，230r/min培养过夜，转接过夜培养物于BMGY培养基(设平行)30℃，230r/min培养至OD₆₀₀＝2-6，根据OD值取合适体积的菌液于50mL离心管中，5000r/min离心5min取菌体，重悬至BMMY培养基使重悬培养基OD₆₀₀＝1，30℃，230r/min培养5d,每隔24h补加甲醇至终浓度0.5％，发酵结束取样按照QBT 2525-2001测定酶活，并依据GB/T 20881-2007进行麦芽糖为底物的转化试验筛选最优菌株。筛选结果见表1。

表1 不同α-葡萄糖苷酶产生菌转化麦芽糖为低聚异麦芽糖的HPLC分析结果

结果表明，通过克隆表达六个α-葡萄糖苷酶基因筛选出了最优的基因agD，通过组合式表达，获得了最优的组合表达方案agCD，催化活性大幅度提升，成功获得α-葡萄糖苷酶的高产菌株GS115-agCD。

实施例6：α-葡萄糖苷酶最优菌株25L发酵系统发酵工艺和酶的制备工艺的建立

甘油管接种YPD平板，30℃培养40h；单菌落接种YPD液体培养基，250mL三角瓶装液量30mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体YPD)，500mL三角瓶装液量100mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，OD₆₀₀测定为10时用于发酵罐接种；

发酵罐准备：按照11L初始装液量配制发酵培养基(BSM)，氨水调节pH至5.0,搅拌充分后，121℃ 30min灭菌，同时准备补料瓶等，并配制50％甘油5.5L用于补料。

接种：按照10％接种量接种，将131.59mL微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0，DO维持20％以上。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。

补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)，初始流加速度为4.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速率为1.8mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至4.3mL/min。2h后流加甲醇速率提高至8.5mL/min，诱导90h后发酵结束。发酵结束酶活力为78000U/mL。

发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液后添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。

实施例7：10m³～30m³体系下α-葡萄糖苷酶的制备

将实施例6的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。

补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素母液)，初始流加速度为8.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素母液)。初始流加速率为3.6mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至7.3mL/min。2h后流加甲醇速率提高至10.9mL/min，诱导75h后发酵结束。发酵结束酶活力为80000U/mL。

发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品。

实施例8：10m³～30m³体系下使用游离型α-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖浆

淀粉经液化酶液化后，制备体系如下按每Kg淀粉(干)加入实施例7制备好的游离型α-葡萄糖苷酶12000U，将酶按照换算好的总量加入到20％(w/v)的麦芽糖浆中，控制反应液在pH 6.0，温度在35℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应30h。反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，低聚异麦芽糖占干物质比例可达58％。所制备低聚异麦芽糖浆HPLC解析图谱见附图1。生产流程示意图见图3。

实施例9：α-葡萄糖苷酶的固定化

固定化方式:对环氧树脂进行预处理，与α-葡萄糖苷酶共混制备成固定化的α-葡萄糖苷酶。

树脂预处理：固定化选用树脂型号为GT-4。称取树脂样品10g，加入30mL K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(1M，pH＝8.0)，30℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作3遍，即树脂预处理好。

配制α-葡萄糖苷酶液：将葡萄糖转移酶1.5g溶解于pH 5.0的2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含α-葡萄糖苷酶的溶解液。

α-葡萄糖苷酶的固定化：配制α-葡萄糖苷酶液中加入预处理好的环氧树脂的质量(湿重)1g，于30℃，200r/min摇床反应24h，用于α-葡萄糖苷酶的固定化，收集反应液。进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，对于收集的滤渣，用pH 6.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤3次，分别收集洗涤液和洗涤渣进行含量分析，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃冰箱，即制备出固定化α-葡萄糖苷酶，酶活力回收率平均高达95.7％。

实施例10：固定化α-葡萄糖苷酶催化麦芽糖制备低聚异麦芽糖浆

固定化后的α-葡萄糖苷酶用于低聚异麦芽糖浆的制备。淀粉来源麦芽糖浆液的制备按实施例8中的条件制备。制备体系如下按每Kg淀粉(干)加入第(4)步制备好的固定酶13000U，将固定化酶加入到20％(w/v)的麦芽糖浆中，再按乙酸乙酯：麦芽糖浆＝15:75(v/v)加入乙酸乙酯，控制反应液在pH 5.5，温度在30℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应30h。反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，低聚异麦芽糖占干物质比例55％。所制备低聚异麦芽糖浆HPLC解析图谱见附图2。生产流程示意图见图3。

实施例11：α-葡萄糖苷酶固定化酶的重复利用和低聚异麦芽糖浆的连续制备

固定化α-葡萄糖苷酶的分离：实施例10中固定化α-葡萄糖苷酶会自动分配到乙酸乙酯溶剂相(上相)，直接从容器底部排出产物低聚异麦芽糖液(下相)。然后继续补加底物料液，重复上述制备低聚异麦芽糖的操作，直到酶活下降幅度超过10％，可实现重复批次50批以上。

Claims (9)

1.一种基因工程重组菌，其特征在于，所述重组菌是通过克隆α-葡萄糖苷酶的编码基因agC,agD，并在毕赤酵母GS115中串联表达上述两个基因而获得，所述重组菌能够催化淀粉来源的麦芽糖浆生成低聚异麦芽糖；

所述编码基因agC、agD的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；表达载体为pPIC9k。

2.如权利要求1所述的一种基因工程重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：

(1)以黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88mRNA反转录制备的cDNA为模板，设计上下游引物，并通过PCR的方法分别扩增上述基因；

(2)将步骤(1)中获得的基因片段分别克隆入整合表达载体pPIC9k的SnaBI位点，分别获得对应的重组质粒；

(3)以步骤(2)中含有agD基因的重组质粒为模板设计上下游引物，通过PCR扩增的方式获得带有来源于pPIC9k的启动子序列和终止子序列的agD基因片段，并克隆入步骤(2)中含有agC基因的重组质粒的XbaI位点，获得agC、agD基因串联表达的重组质粒；

(4)将步骤(3)所获得重组质粒经SalI或SacI线性化后电击转化入GS115细胞，并经组氨酸营养缺陷型和G418抗性筛选获得高拷贝的产α-葡萄糖苷酶重组菌株。

3.一种利用权利要求1所述重组菌发酵生产α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，具体如下：

(1)种子培养：菌株经两级种子培养，OD₆₀₀测定为10时用于发酵罐接种；

(2)发酵培养：以BSM培养基为发酵培养基，接种量2-10％，接种同时加入微量元素，发酵温度为28-33℃，pH维持4.0-7.0，DO维持20％以上；

①菌体生长阶段：菌体生长14-24h，甘油耗尽后，DO快速上升，进入补料生长阶段；

②补料生长阶段：流加50％甘油，初始流加速度为3.0～9.0mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段；

③诱导产酶阶段：流加甲醇，初始流加速率为1.2～3.6mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min，2h后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min，诱导70～96h后发酵结束；

(3)发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液，添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品；或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。

4.一种权利要求3所述方法生产的α-葡萄糖苷酶的固定化酶，其特征在于，制备步骤如下：

(1)固定化载体预处理：载体1～15g，加入2～60mL浓度为1M，pH为4～9的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，20℃～45℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2～4遍；

(2)配制α-葡萄糖苷酶液：将α-葡萄糖苷酶0.1～3g溶解于pH 5.0～7.0的浓度为2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含α-葡萄糖苷酶的溶解液；

(3)α-葡萄糖苷酶的固定化：将步骤(2)配制的α-葡萄糖苷酶液中加入步骤(1)预处理好的固定化载体1g，于20℃～55℃，200r/min摇床反应24h，收集反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，用pH2.0-8.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤滤渣2～5次，收集洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃～15℃冰箱，即制备出固定化α-葡萄糖苷酶。

5.如权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶的固定化酶，其特征在于，所述固定化载体预处理的条件为pH为7.5～8.5，温度20℃～30℃；α-葡萄糖苷酶固定化制备条件为pH 5.0～7.0，温度20℃～30℃。

6.一种利用权利要求3所述方法生产的α-葡萄糖苷酶发酵生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，具体如下：将淀粉经液化酶液化后，每Kg干淀粉加入α-葡萄糖苷酶10000U～150000U，将酶加入到质量体积比为20％的麦芽糖浆中，控制反应液在pH 5.0～7.0，温度在30℃～40℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应20～40h。

7.一种利用权利要求4所述α-葡萄糖苷酶的固定酶发酵生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述方法使用疏水性双向萃取工艺，具体如下：将淀粉经液化酶液化后，按每Kg干淀粉加入制备好的固定酶10000U～150000U，将固定化酶加入到质量体积比为20％的麦芽糖浆中，再加入用于固定化载体及固定化酶回收的萃取液，控制反应液在pH 5.0～7.0，温度在30℃～40℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应20～40h。

8.如权利要求7所述的α-葡萄糖苷酶的固定酶发酵生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述萃取液为甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，己酸乙酯，己酸己酯中的一种。

9.如权利要求7所述的α-葡萄糖苷酶的固定酶发酵生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述萃取液与麦芽糖浆的体积比为2～40:60～98。