CN112626060B - 一种用于生产肌醇的固定化多酶体系以及生产肌醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其由多孔多巴胺微球与用于生产肌醇的多酶混合物均匀混合而成。本发明将淀粉转化为肌醇的酶法催化路径中的全部4个酶采用多孔微球同时进行固定化从而获得固定化多酶体系，利用该固定化多酶体系催化淀粉转化为肌醇，可以实现酶的可回收利用，从而大大降低了肌醇制备所需投入的酶用量，减少了生产成本。

Description

一种用于生产肌醇的固定化多酶体系以及生产肌醇的方法
技术领域
本发明涉及肌醇的生产领域，具体涉及一种用于生产肌醇的固定化多酶体系以及利用该固定化多酶将淀粉或其衍生物转化为肌醇的制备方法。
背景技术
肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素B族中的一种。肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前全球的需求量大概在每年10000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发，例如2013年全球饲料产量为9.6亿吨，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么饲料工业所需肌醇的产量应该达到每年190-480万吨。在这种情况下，目前中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求，目前肌醇的生产主要还是传统的高温加压水解植酸(六磷酸肌醇)，然后利用离子交换方法等去掉植酸水解产生的磷酸盐等。该工艺设备材质要求严格，由于离子交换树脂需要定期再生而造成大量的酸性或者碱性溶液排放进入环境，同时排出大量的磷酸盐，环境污染严重。
专利文献CN106148425A针对肌醇制备提供了一种肌醇的酶催化转化方法，通过体外多酶催化淀粉以及淀粉衍生物生产肌醇，该方法原料转化率高，肌醇产率高，步骤简捷，对环境影响小，可实现肌醇的规模化生产。但是该方法中多个酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能得到，代价较昂贵；而且这些水溶性酶分子在催化结束后较难回收，造成浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其将肌醇酶法催化转化的多酶采用多孔微球进行固定化，获得固定化多酶，并利用该固定化多酶催化生产肌醇，可以实现酶的可回收利用，从而大大降低了肌醇制备所需投入的酶用量，减少了生产成本。
具体而言，本发明提供了一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其是由多孔多巴胺微球与用于生产肌醇的多酶混合物均匀混合而成。
本发明采用多孔多巴胺微球做为多酶固定化载体。从固定化酶载体结构的角度出发，多孔的微球结构能够促进底物/产物的快速传递，赋予固定化多酶高的催化活性；从材料组分角度出发，多巴胺能够提供适宜的亲疏水性，赋予固定化多酶增强的稳定性；从酶的回用性出发，微球具有较大的粒径，可通过简单的离心进行固定化多酶的回收利用，降低多酶催化制备肌醇的酶使用量，从而降低生产成本。
所述多孔多巴胺微球可以采用包括如下步骤的方法制备而成：
(1)将碳酸钠水溶液迅速倒入氯化钙水溶液中进行搅拌反应，固液分离后，收集固体产物，即多孔碳酸钙微球；
(2)将所述多孔碳酸钙微球与多巴胺溶液混合反应，固液分离后，收集固体产物，即多巴胺-碳酸钙微球；
(3)将所述多巴胺-碳酸钙微球与乙二胺四乙酸混合反应去除碳酸钙，固液分离后，收集固体产物，即多孔多巴胺微球。
本发明对制备多孔多巴胺微球的方法进行优化，从而改进微球的结构、组成以及与酶的结合力，从而提高固定化多酶体系的催化和回收性能。
制备多孔多巴胺微球的步骤(1)中，原料的浓度以及搅拌速度决定了微球的基本结构和形态。本发明优选所述碳酸钠水溶液与氯化钙水溶液的浓度相等，更优选其浓度为0.1～1M；在实际操作时，优选将碳酸钠水溶液迅速倒入等体积的氯化钙水溶液中。步骤(1)中的搅拌速度对微球尺寸、形态、均匀性等有实质性影响，从而影响了固定化多酶的催化效果，本发明优选所述搅拌的速度为700～1500rpm，更优选为700～1000rpm。
制备多孔多巴胺微球的步骤(2)引入多巴胺，能够为微球提供适宜的亲疏水性，赋予固定化多酶增强的稳定性。本发明通过大量实践发现，当多巴胺溶液中多巴胺的质量与所述多孔碳酸钙微球的质量之比为1：3～5、优选为1：4时，可以使固定化多酶体系有良好的催化活性，尤其可以提高固定化多酶体系的回收利用率，确保固定化多酶体系经过多重复使用后仍能够维持较高的肌醇生产浓度。在实际使用时，为了提高多巴胺与多孔碳酸钙微球的结合效率，本发明优选所述多巴胺溶液是将多巴胺溶解于pH 8～9、浓度为40～60mM的Tris-HCl缓冲液配制而成。
作为本发明的一种优选方案，所述多孔多巴胺微球采用包括如下步骤的方法制备而成：
(1)分别配制0.3～0.5M的氯化钙水溶液和碳酸钠水溶液，在700～1000rpm的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的氯化钙溶液中，反应20～40秒，用去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，2500～3500rpm离心分离，得到多孔碳酸钙微球；
(2)配制质量浓度为4～6mg/ml的多巴胺-Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl缓冲液为pH8～9、浓度40～60mM的Tris-HCl缓冲液，将多巴胺溶液150～250ml与上述得到的多孔碳酸钙微球2～5g均匀混合，搅拌4～6h，2500～3500rpm离心分离，水洗至上清液为无色，得到多巴胺-碳酸钙微球；
(3)将上述得到的多巴胺碳酸钙微球与浓度40～60mM的乙二胺四乙酸溶液均匀混合，除去碳酸钙，2500～3500rpm离心分离，去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔多巴胺微球。
本发明涉及的用于生产肌醇的酶包括葡聚糖磷酸化酶(αGP)，葡萄糖磷酸变位酶(PGM)，肌醇-3-磷酸合成酶(IPS)和肌醇单磷酸酶(IMP)。当将上述四种酶共同固化到所述多孔多巴胺微球上，可以在确保酶本身催化效率的基础上，实现酶的反复使用，从而显著降低成本。本发明优选每克所述多孔多巴胺微球上附着有葡聚糖磷酸化酶1500～2500U、葡萄糖磷酸变位酶1500～2500U、肌醇-3-磷酸合成酶1500～2500U以及肌醇单磷酸酶1500～2500U，更优选每克所述多孔多巴胺微球上附着有葡聚糖磷酸化酶2000U、葡萄糖磷酸变位酶2000U、肌醇-3-磷酸合成酶2000U以及肌醇单磷酸酶2000U，从而确保在实际生产肌醇时，固定化多酶在投料量合理的情况下可以实现良好的催化效率以及多次回收使用。
为了确保多酶在微球上均匀分布，所述固定化多酶可以由多孔多巴胺微球与用于生产肌醇的多酶混合物溶液充分搅拌混合后得到。作为本发明的一种优选实施方案，所述多酶混合物溶液中含有葡聚糖磷酸化酶1.5～2.5U/ml，葡萄糖磷酸变位酶1.5～2.5U/ml，肌醇-3-磷酸合成酶1.5～2.5U/ml以及肌醇单磷酸酶1.5～2.5U/ml，优选含有葡聚糖磷酸化酶2U/ml，葡萄糖磷酸变位酶2U/ml，肌醇-3-磷酸合成酶2U/ml以及肌醇单磷酸酶2U/ml，所述多孔多巴胺微球与所述多酶混合物溶液的质量体积比为1g：(1.5～2.5)L。
本发明进一步保护利用所述固定化多酶体系生产肌醇的方法，该方法是以淀粉或其衍生物为原料，利用所述固定化多酶，通过酶催化转化法制备肌醇。
作为本发明的一种优选实施方案，所述方法具体为：取淀粉或淀粉衍生物5～15g/L，pH值为7～7.5的HEPES缓冲液80～120mM，无机磷酸根8～12mM，二价镁离子3～7mM，锌离子或锰离子0.3～0.7mM，异淀粉酶0.8～1.2U/ml，固定化多酶0.8～1.2mg/ml反应液，在65～75℃进行酶催化转化反应。
上述反应结束后，进行固液分离，收集所述固定化多酶，可以循环利用于制备肌醇。所述固定化酶循环利用1～7次、优选循环利用1～4次时，能够保持较高的催化活性。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其具有优异的催化活性以及良好的稳定性，尤其可通过简单的离心进行回收利用。采用所述多孔多巴胺微球固定化多酶体系生产肌醇，过程简便，条件温和，实现了酶的多次循环使用，大大降低了多次肌醇制备所需投入的酶用量，减少了生产成本。
附图说明
图1为采用实施例1提供的固定化多酶体系制备肌醇的转化曲线。
图2为采用对比例1提供的未固定化多酶混合物制备肌醇的转化曲线。
图3为采用对比例2提供的固定化单酶混合物制备肌醇的转化曲线。
图4为采用实施例1提供的固定化多酶体系制备肌醇多次循环使用柱状图。
图5为采用实施例2提供的固定化多酶体系制备肌醇多次循环使用柱状图。
图6为采用实施例3提供的固定化多酶体系制备肌醇多次循环使用柱状图。
图7为制备固定化多酶体系以及采用该固定化多酶体系生产肌醇的流程示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种固定化多酶体系生产肌醇的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
本实施例提供了一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其是由多酶混合物溶液200ml与多孔多巴胺微球3.5g以转速300rpm搅拌混合2.5h后得到。
其中，多酶混合物溶液中含有如下成分：葡聚糖磷酸化酶2U/ml，葡萄糖磷酸变位酶2U/ml，肌醇-3-磷酸合成酶2U/ml以及肌醇单磷酸酶2U/ml。
其中，所述多孔多巴胺微球采用如下方法制备而成：
(1)分别配制0.33M的氯化钙水溶液和碳酸钠水溶液，在700rpm的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的氯化钙溶液中，反应30秒，用去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，3000rpm离心分离，得到多孔碳酸钙微球；
(2)配制质量浓度为6mg/ml的多巴胺-Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl缓冲液为pH8.5、浓度50mM的Tris-HCl缓冲液，将多巴胺溶液200ml与上述得到的多孔碳酸钙微球3.5g均匀混合，搅拌5h，3000rpm离心分离，水洗至上清液为无色，得到多巴胺-碳酸钙微球；
(3)将上述得到的多巴胺碳酸钙微球与浓度50mM的乙二胺四乙酸溶液均匀混合，除去碳酸钙，3000rpm离心分离，去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔多巴胺微球，即酶固定化载体。
实施例2
本实施例提供了一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，与实施例1相比，区别仅在于：制备所述多孔多巴胺微球时，多巴胺的质量浓度由6mg/ml变为2mg/ml。
实施例3
本实施例提供了一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，与实施例1相比，区别仅在于：制备所述多孔多巴胺微球时，在1500rpm的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的氯化钙溶液中。
对比例1
本对比例提供了一种用于生产肌醇的未固定化多酶混合物，其与实施例1中的多酶混合物溶液组成相同。
对比例2
本对比例提供了一种用于生产肌醇的固定化单酶混合物，与实施例1相比，区别仅在于：将葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-3-磷酸合成酶以及肌醇单磷酸酶分别固定于多孔多巴胺微球上，再将四种固定化单酶混合。
其中，每种酶的用量、多孔多巴胺微球的用量以及具体固定方法均与实施例1相同。
实施例4
分别采用实施例1～3提供的固定化多酶、或对比例1提供的多酶混合物、或对比例2提供的固定化多酶，通过如下方法制备肌醇：
取淀粉或淀粉衍生物10g/L，pH值为7.2的HEPES缓冲液100mM，无机磷酸根10mM，二价镁离子5mM，锌离子或锰离子0.5mM，异淀粉酶1U/ml，以上各实施例或对比例提供的固定化多酶(或多酶混合物)，在70℃下进行反应，通过高效液相色谱对肌醇的浓度进行检测。
采用实施例1提供的固定化多酶进行制备，反应8小时后所产生的肌醇浓度为7.9g/L，转化率为79％，8小时内的肌醇转化率如图1所示。
采用实施例2提供的固定化多酶进行制备，反应8小时后所产生的肌醇浓度为6.4g/L，转化率为64％。
采用实施例3提供的固定化多酶进行制备，反应8小时后所产生的肌醇浓度为5.4g/L，转化率为54％
采用对比例1提供的多酶混合物进行制备，反应8小时后所产生的肌醇浓度为8.3g/L，转化率为83％，8小时内的肌醇转化率如图2所示。
采用对比例2提供的固定化多酶进行制备，反应8小时后所产生的肌醇浓度为3.1g/L，转化率为31％，8小时内的肌醇转化率如图3所示。
实施例5
通过实施例4提供的方法制备肌醇后，进行固液分离，收集固定化多酶，循环利用于制备肌醇。通过高效液相色谱对每次循环过程中产生的肌醇的浓度进行检测，结果以相对肌醇生产浓度表示，将第一次循环反应产生的肌醇浓度设定为100％。
采用实施例1提供的固定化多酶体系进行制备，经过7次重复使用后，固定化多酶维持了50.5％的相对肌醇生产浓度，结果如图4。
采用实施例2提供的固定化多酶体系进行制备，经过7次重复使用后，固定化多酶维持了30.9％的相对肌醇生产浓度，结果如图5。
采用实施例3提供的固定化多酶体系进行制备，经过7次重复使用后，固定化多酶维持了40.9％的相对肌醇生产浓度，结果如图6。
本发明制备上述固定化多酶体系以及采用该固定化多酶体系生产肌醇的流程示意图如图7所示。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种用于生产肌醇的固定化多酶体系，其特征在于，由多孔多巴胺微球与用于生产肌醇的多酶混合物均匀混合而成；
所述多孔多巴胺微球采用包括如下步骤的方法制备而成：
（1）将碳酸钠水溶液倒入氯化钙水溶液中进行搅拌，固液分离后，收集固体产物，即多孔碳酸钙微球；
（2）将所述多孔碳酸钙微球与多巴胺溶液混合，固液分离后，收集固体产物，即多巴胺-碳酸钙微球；
（3）将所述多巴胺-碳酸钙微球与乙二胺四乙酸混合反应去除碳酸钙，固液分离后，收集固体产物，即多孔多巴胺微球；
步骤（1）所述搅拌的速度为700~1000rpm；
所述多巴胺溶液中多巴胺的质量与所述多孔碳酸钙微球的质量之比为1：3~5；
所述碳酸钠水溶液与氯化钙水溶液的浓度相等；
所述碳酸钠水溶液与氯化钙水溶液的浓度为0.1~1M；
所述多酶混合物是淀粉酶法生产肌醇的过程中采用的多酶混合物；
所述多酶混合物包括：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶以及肌醇单磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的固定化多酶体系，其特征在于，所述多巴胺溶液是将多巴胺溶解于pH 8~9、浓度为40~60 mM的Tris-HCl缓冲液配制而成。
3.根据权利要求1所述的固定化多酶体系，其特征在于，所述多孔多巴胺微球采用包括如下步骤的方法制备而成：
（1）分别配制0.3~0.5M的氯化钙水溶液和碳酸钠水溶液，在700~1000rpm的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的氯化钙溶液中，反应20~40秒，用去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，2500~3500 rpm离心分离，得到多孔碳酸钙微球；
（2）配制质量浓度为6mg/ml的多巴胺-Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl缓冲液为pH8~9、浓度40~60 mM的Tris-HCl缓冲液，将多巴胺溶液200ml与上述得到的多孔碳酸钙微球5g均匀混合，搅拌4~6h，2500~3500 rpm离心分离，水洗至上清液为无色，得到多巴胺-碳酸钙微球；
（3）将上述得到的多巴胺碳酸钙微球与浓度40~60mM的乙二胺四乙酸溶液均匀混合，除去碳酸钙，2500~3500 rpm离心分离，去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔多巴胺微球。
4.根据权利要求1所述的固定化多酶体系，其特征在于，每克所述多孔多巴胺微球上附着有葡聚糖磷酸化酶1500~2500U、葡萄糖磷酸变位酶1500~2500U、肌醇-3-磷酸合成酶1500~2500U以及肌醇单磷酸酶1500~2500U。
5.根据权利要求1所述的固定化多酶体系，其特征在于，所述固定化多酶是由多孔多巴胺微球与用于生产肌醇的多酶混合物溶液充分搅拌混合后得到。
6.根据权利要求5所述的固定化多酶体系，其特征在于，所述多孔多巴胺微球与所述多酶混合物溶液的质量体积比为1g：（1.5~2.5）L；
所述多酶混合物溶液中含有葡聚糖磷酸化酶2U/ml，葡萄糖磷酸变位酶2U/ml，肌醇-3-磷酸合成酶2U/ml以及肌醇单磷酸酶2U/ml。
7.利用权利要求1~6任意一项所述固定化多酶体系生产肌醇的方法，其特征在于，以淀粉或其衍生物为原料，利用所述固定化多酶体系，通过酶催化转化法制备肌醇。
8.根据权利要求7所述的生产肌醇的方法，其特征在于，所述方法具体为：取淀粉或淀粉衍生物5~15 g/L，pH值为7~7.5的HEPES缓冲液80~120mM，无机磷酸根8~12mM，二价镁离子3~7mM，锌离子或锰离子0.3~0.7mM，异淀粉酶0.8~1.2U/ml，固定化多酶0.8~1.2mg/ml反应液，在65~75℃进行酶催化转化反应。
9.根据权利要求7所述的生产肌醇的方法，其特征在于，反应结束后进行固液分离，收集所述固定化多酶体系，循环利用于制备肌醇。
10.根据权利要求9所述的生产肌醇的方法，其特征在于，所述固定化多酶体系循环利用1~7次。
11.根据权利要求10所述的生产肌醇的方法，其特征在于，所述固定化多酶体系循环利用1~4次。
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