CN104928340A - 一种酶法合成头孢丙烯的工艺 - Google Patents

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林炳旺
乔浩
赵康
王玲
李建国
方军
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Abstract

本发明涉及一种药物的合成方法，具体来说是一种固定化头孢丙烯合成酶的筛选及一种酶法合成头孢丙烯的工艺方法。针对现有酶法合成头孢丙烯工艺中，固定化酶的筛选及评价困难，生产工艺步骤繁琐、控制点差、反应时间长，转化率低等问题，本发明提供了一种固定化头孢丙烯合成酶，及合成头孢丙烯的新工艺。

Description

一种酶法合成头孢丙烯的工艺
技术领域
本发明涉及一种药物的合成方法，具体来说是一种固定化头孢丙烯合成酶的筛选及一种酶法合成头孢丙烯的工艺方法。
背景技术
头孢丙烯是第二代头孢菌素类广谱抗菌药，对G+、G-菌和厌氧菌的抗菌活性均很强，对G+菌活性尤为突出。头孢丙烯安全性好，不良反应极低。1991年12月获FDA批准上市，临床用于敏感菌所致的轻、中度感染，包括上、下呼吸道感染，以及皮肤和皮肤软组织感染。
近年来，采用酶法合成头孢丙烯成为研究重点。酶法相比化学法在环保和成本上具有明显的优势。酶法制备头孢丙烯的工艺相对流程短，工艺简单，杂质的带入及产生较少，合成过程中无溶媒及有毒的试剂。
在酶法生产头孢丙烯的过程中，固定化头孢丙烯合成酶的选择是酶法工艺的关键。固定化头孢丙烯合成酶对产品的收率、杂质的含量、产品的质量等起着关键的作用。另外，固定化酶的稳定性决定其使用寿命和生产成本。
发明内容
针对现有酶法合成头孢丙烯工艺中，固定化酶的筛选及评价困难，生产工艺步骤繁琐、控制点差、反应时间长，转化率低等问题，本发明提供了一种固定化头孢丙烯合成酶，及合成头孢丙烯的新工艺。
本发明的内容是通过以下方案通过的：
一种酶法合成头孢丙烯的工艺，具体步骤如下：
(1)采用氨基环氧型载体固定化得到固定化头孢丙烯合成酶；
以戊二醛为交联剂，将假单胞菌(Pseudomonas sp.)来源的酰化酶，采用共价法固定化，得到固定化头孢丙烯合成酶，采用固定化头孢丙烯合成酶催化合成头孢丙烯，反应时间短，产品收率高，纯度高。
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢丙烯合成酶、7-APRA、D-对羟基苯甘氨酸衍生物加入至水中搅拌混合，得混合液；
7-APRA是7-氨基-3-丙烯基-头孢烷酸的英文简写；
所述的7-APRA与D-对羟基苯甘氨酸衍生物的摩尔比为1/1.05～1.20，固定化头孢丙烯合成酶在反应体系中的浓度为10～40u/mL；
(3)用3mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节步骤2)所得的混合液pH值为6.5-7.5，控制混合液温度为5-25℃，反应60-180min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-APRA残留浓度为0-1mg/mL，结束反应；
优选反应时间为100-120min，反应时间过短，转化率低，反应不完全；但反应时间过长，头孢丙烯开始水解。这个反应时间是酶催化时根据7-APRA最佳转化率考察出来的最佳反应时间。
(4)取步骤3)所得的混合液，通过筛网，分离出反应液和固定化酶；
所述的筛网为80-120目，优选90-110目；筛网目数过大，固定化酶就容易从筛网泄露；目数过小，头孢丙烯粗品从筛网放料就较困难；
(5)反应液用质量分数为30％的盐酸溶液溶清至pH为一定值，再用质量分数为20％的氨水溶液结晶至pH为一定值，养晶，洗涤，干燥，即得产品头孢丙烯。
步骤(1)中所述的氨基环氧型载体是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂中的一种或两种组合。
步骤(2)中所述的D-对羟基苯甘氨酸衍生物选自D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸乙酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐、D-对羟基苯甘氨酸乙酯盐酸盐中的一种或多种组合。
步骤(3)中所述的7-APRA残留浓度为0-0.5mg/mL。
步骤(4)中所述的筛网为80-120目。
步骤(5)中所述的用酸溶清pH值为1.0-1.2，碱结晶pH为5.0-5.5。
所述产品的头孢丙烯纯度99.5％以上，反应摩尔收率90％以上。
本发明所述的头孢丙烯合成酶是由山东鲁抗立科药业公司提供，而且在本申请中头孢丙烯合成酶又简称为头孢丙烯酶或酶。
本发明将固定化酶投入水相中，每次反应后仅需母液和去离子水清洗即可再用。7-APRA和D-对羟基苯甘氨酸衍生物按比例一次性加入，进行反应。反应完后，通过筛网放料。整个合成过程，工艺简单，操作方便，反应时间短、能耗低、污染少。所得产品质量好，收率高。因此，本发明是一种高效率的绿色生产工艺。
关于本发明的创新点，可以通过下述方面阐述：
(1)固定化的酶可以回收重复使用，降低了成本。另外固定化的酶性能更稳定。反应后，更易于分离。此外，还便于运输、储存及自动化操作。
(2)固定化的酶在催化反应过程中，反应时间更短，反应后的头孢丙烯产品质量更好，收率更高。
(3)1)反应时间短，相比市售相似产品，平均反应时间缩短一半；2)产品纯度高，能达到99.5％以上；3)收率高，摩尔收率相比目前市售产品，能提高10％。
附图说明
图1为对照品酶和固定化酶催化时7-APRA转化率随批次的变化关系；
图2为对照品酶和固定化酶代表衰减性能的反应时间(达到最高转化率所需的反应时间)随批次的变化关系；
具体实施方式
本发明通过比较例和实施例来阐明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一
在反应器中，将3900u的固定化头孢丙烯合成酶加入至130mL的去离子水中，开启搅拌。加入0.04mol的7-APRA和0.046mol的D-对羟基苯甘氨酸甲酯。加入氢氧化钠，调反应pH值至6.8。保持反应温度为19-20℃。反应100min。将反应液与固定化头孢丙烯合成酶分离。所得产物用质量分数为30％盐酸调pH至1.1-1.2溶解，过滤，再用质量分数为20％的氨水溶液调pH值结晶，终点pH5.0-5.2。在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢丙烯成品。
实施例二
在反应器中，将2600u的固定化头孢丙烯合成酶加入至130mL的去离子水中，开启搅拌。加入0.04mol的7-APRA和0.048mol的D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐。加入氢氧化钠，调反应pH值至7.0。保持反应温度为14-15℃。反应120min。将反应液与固定化头孢丙烯合成酶分离。所得产物用质量分数为30％盐酸调pH至1.1-1.2溶解，过滤，再用质量分数为20％的氨水溶液调pH值结晶，终点pH5.0-5.2。在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢丙烯成品。
实施例三
在反应器中，将3000u的固定化头孢丙烯合成酶加入至130mL的去离子水中，开启搅拌。加入0.04mol的7-APRA和0.044mol的D-对羟基苯甘氨酸甲酯。加入氢氧化钠，调反应pH值至7.1。保持反应温度为10-11℃。反应120min。将反应液与固定化头孢丙烯合成酶分离。所得产物用质量分数为30％盐酸调pH至1.1-1.2溶解，过滤，再用质量分数为20％的氨水溶液调pH值结晶，终点pH5.0-5.2。在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢丙烯成品。
实施例四
在反应器中，将3300u的固定化头孢丙烯合成酶加入至130mL的去离子水中，开启搅拌。加入0.04mol的7-APRA和0.045mol的D-对羟基苯甘氨酸乙酯。加入氢氧化钠，调反应pH值至6.8。保持反应温度为19-20℃。反应100min。将反应液与固定化头孢丙烯合成酶分离。所得产物用质量分数为30％盐酸调pH至1.1-1.2溶解，过滤，再用质量分数为20％的氨水溶液调pH值结晶，终点pH5.0-5.2。在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢丙烯成品。
实施例五
在反应器中，将3600u的固定化头孢丙烯合成酶加入至130mL的去离子水中，开启搅拌。加入0.04mol的7-APRA和0.046mol的D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐。加入氢氧化钠，调反应pH值至7.3。保持反应温度为16-17℃。反应105min。将反应液与固定化头孢丙烯合成酶分离。所得产物用质量分数为30％盐酸调pH至1.1-1.2溶解，过滤，再用质量分数为20％的氨水溶液调pH值结晶，终点pH5.0-5.2。在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢丙烯成品。
实验例
1，固定化酶的催化性能考察
固定化酶与对照品(目前市场用量最大的PGA酶)催化性能的对比：
(1)对照品固定化酶：
对照品PGA酶进行了多批次催化合成头孢丙烯的性能，7-APRA转化率随批次的变化关系如下图1所示。对照品PGA酶代表衰减性能的最佳反应时间随批次的变化如图2所示。从图1可知，对照品PGA酶7-APRA转化率随批次的变化总体平稳，平均转化率为96.36％。从图2看出，达到最大转化率时的最佳反应时间需逐步延长，表明衰减较快。
(2)固定化头孢丙烯合成酶：
固定化酶催化合成头孢丙烯时，7-APRA转化率随批次的变化关系如下图1所示。固定化酶代表衰减性能的最佳反应时间随批次的变化如图2所示。由图1可知，固定化酶催化时7-APRA转化率比较稳定，平均转化率为99.03％。由图2可知，发白时间延长较慢，更稳定。
从上述对比看出，固定化酶催化反应时，7-APRA转化率高于对照品，反应批次多，衰减慢，更为稳定。
2，对实施例一～五所得的头孢丙烯产品进行性能测试
纯度、单杂、总杂主要用HPLC检测。
检测结果如下表所示：
7-APRA摩尔收率％ 纯度％ 单杂％ 总杂％
实施例一 90.2 99.62 0.15 0.35
实施例二 90.5 99.71 0.14 0.28
实施例三 90.3 99.66 0.07 0.29
实施例四 90.3 99.70 0.12 0.26
实施例五 90.2 99.57 0.09 0.37
从以上结果可知：本发明工艺简单，操作方便，反应时间短、能耗低、污染少。所得产品质量好，收率高。因此，本发明是一种高效率的绿色生产工艺。

Claims (6)

1.一种酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，具体步骤如下：
(1)采用氨基环氧型载体固定化得到固定化头孢丙烯合成酶；
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢丙烯合成酶、7-氨基-3-丙烯基-头孢烷酸、D-对羟基苯甘氨酸衍生物加入至水中搅拌混合，得混合液；
所述的7-APRA与D-对羟基苯甘氨酸衍生物的摩尔比为1/1.05～1.20，固定化头孢丙烯合成酶在反应体系中的浓度为10～40u/mL；
(3)用3mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节步骤2)所得的混合液pH值为6.5-7.5，控制混合液温度为5-25℃，反应60-180min，直至7-APRA残留浓度为0-1mg/mL，结束反应；
(4)取步骤3)所得的混合液，通过筛网，分离出反应液和固定化酶；
(5)反应液用质量分数为30％的盐酸溶液溶清至pH为一定值，再用质量分数为20％的氨水溶液结晶至pH为一定值，养晶，洗涤，干燥，即得产品头孢丙烯。
2.如权利要求1所述的酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的氨基环氧型载体是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂中的一种或两种组合。
3.如权利要求1所述的酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，步骤(2)中所述的D-对羟基苯甘氨酸衍生物选自D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸乙酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐、D-对羟基苯甘氨酸乙酯盐酸盐中的一种或多种组合。
4.如权利要求1所述的酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述的7-APRA残留浓度为0-0.5mg/mL。
5.如权利要求1所述的酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，步骤(4)中所述的筛网为80-120目。
6.如权利要求1所述的酶法合成头孢丙烯的工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的用酸溶清pH值为1.0-1.2，碱结晶pH为5.0-5.5。
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