CN106350566A - 一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺 - Google Patents

一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物专用抗生素原料药硫酸头孢喹肟的酶法工艺，采取在酶的催化作用下，使AE活性酯与7‑氨基头孢喹肟反应生成头孢喹肟，通过筛网过滤分离出含头孢喹肟的母液，经成盐和结晶得到硫酸头孢喹肟。本发明采用酶法合成硫酸头孢喹肟。与现有的化学法技术相比，首先催化合成方面，酶的选择性较高，副反应少，相应产生的杂质也较少，产品质量高，其次酶法工艺用水作反应溶剂，工艺过程中均使用低毒试剂，特别减少了废弃物的产生，在环保方面具有明显的优势，有利于保护环境，另外该工艺具有参数可控性强、反应条件温和、产品质量稳定等特点，且由于酶可以循环利用，该工艺在成本上要明显低于化学法，适合推广及工业化生产。

Description

一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺
技术领域
本发明涉及有机合成领域，具体涉及一种动物专用抗生素原料药硫酸头孢喹肟的酶法工艺。
技术背景
硫酸头孢喹肟是20世纪80年代由德国Hoechst公司开发的第四代动物专用头孢类抗生素，于1993年首次在德国批准上市，英国英特威公司(Intervet)于1994年也随之上市。硫酸头孢喹肟具有抗菌谱广、抗菌活性强、吸收快、低毒性、低残留等特点，对于革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、铜绿假单胞菌均有优良的抗菌活性，尤其对革兰阴性菌的活性更佳。硫酸头孢喹肟吸收快，达峰时间短，生物利用度高，药时曲线下面积大，表现分布容积大。头孢喹肟毒性低，在动物的可食用组织中残留低，安全性高，主要用于治疗牛和猪大肠杆菌引起的奶牛乳房炎，多杀性巴氏杆菌或胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病。
β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法(简称化学法)和酶半合成法(简称酶法)。
化学法需要较多的有机化学原料(如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺)，反应条件苛刻，如需无水条件，反应温度低(有的需低至零下90℃)，反应步骤多，产生大量的三废需处理。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。随着固定化酶技术进步，和对固定化酶在反应中失活原因的深人研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活(half-life)已经达到50-100批次。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。
目前，头孢喹肟的合成相关文献报道均为化学法，本发明涉及了一种硫酸头孢喹肟的酶法合成，本发明与现有技术相比具有工艺参数可控性强、反应条件温和等、产品产品质量稳定等特点，特别减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量稳定所含杂质极少，且工艺适合工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本申请提供了一种利用酶法制备硫酸头孢喹肟的方法。该方法将头孢菌素酰化酶固定在载体上，得到固定化的头孢喹肟合成酶，利用该合成酶催化硫酸头孢喹肟的合成，该方法提高了合成收率，并且使得产品的纯度大大提高。另外，酶固定化以后，可以进行从反应液中进行分离，循环利用。该工艺是一个绿色、环保、节能的新工艺。
为了实现上述目的，本申请所采用的技术方案如下：
一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，具体步骤如下：
(1)将头孢菌素酰化酶吸附于酶载体上，得到固定化头孢喹肟合成酶；
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢喹肟合成酶与AE活性酯在水中搅拌混合均匀后，调节pH值至7～8，控制混合液温度为20±5℃，加入7-氨基头孢喹肟，反应12～24h，直至7-氨基头孢喹肟残留小于0.1％；
(3)将步骤(2)所得的反应液通过筛网分离出滤液和固定化头孢喹肟合成酶，分离出来的固定头孢喹肟合成酶可以循环使用；
(4)将步骤(3)所得的滤液通过萃洗，再将所得水相用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5±0.5；
(5)将步骤(4)所得的滤液中加入丙酮进行结晶，得到硫酸头孢喹肟。
其反应机理为AE活性酯的硫代酯基在弱碱性条件下，经酶催化水解并与酶结合形成活性较高的中间态，再与7-氨基头孢喹肟的氨基经酰胺化反应生成头孢喹肟，反应过程如下：
步骤(1)所选酶载体为丙烯酸系大孔吸附树脂，其粒度为80～120目，孔径为200nm～1000nm。
步骤(1)中所述的固定化酶的制备过程，为将丙烯酸系大孔吸附树脂加入磷酸缓冲液中，再加入头孢菌素酰化酶，15～25℃搅拌24～48h，待固定化后，通过筛网过滤分离、洗涤得到，其中磷酸缓冲液的pH为6.0～8.0，固定温度为15～25℃。
步骤(2)中所述的固定化头孢喹肟合成酶在水中的浓度为10～50u/mL，AE活性酯在水中的浓度为0.05～0.5g/ml，7-氨基头孢喹肟与AE活性酯的摩尔比为1:1.1～1.5。
步骤(4)中所述的筛网为60-80目，所收集的固定化酶可以循环使用；
步骤(1)所得到的固定化头孢喹肟合成酶的酶活力为10000～40000u。
采用上述的技术方案具有以下技术效果：
本发明所述的一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，克服了现有的化学合成方法中的诸多问题，通常化学法中副反应及副产物较多，严重影响产品的提纯过程，产物损失较多，另外化学法中大量使用卤代物(如三甲基碘硅烷)等毒性较高的试剂，不利于环境保护，相应的在工艺的成本上较高；本发明使用的酶法工艺，由于酶对反应的选择性较高，且酶的载体树脂对反应中的杂质有一定的吸附作用，这带来了极其优良的效果，减少了副反应的产生，减少了产物提纯的繁杂程序，其次酶法工艺所用试剂均使用低毒试剂，特别减少了废弃物的产生，在环境保护反面具有明显的优势，由于所使用的物料和试剂价格低廉，酶在回收后经过活化还可以重新利用，在成本上也要明显的低于化学法，另外该酶法工艺还具有反应条件温和、参数可控性强、产品质量稳定等特点，适合工业化生产，对其他β-内酰胺抗生素药物的合成也有一定的参考价值。
具体实施方式
实施例一
在酶反应器中，加入20000u固定化酶和1L的去离子水，开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.65mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5.5。控制反应温度为20℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留0.05％。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液，固定化酶收集循环利用。将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取，水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5，加入1L丙酮，搅拌至析出晶体，0～5℃养晶1h后，抽滤，丙酮洗涤，55℃真空干燥，得到硫酸头孢喹肟289g，收率89.6％(HPLC检测最大单杂0.10％，总杂0.43％)。
实施例二
在酶反应器中，加入30000u固定化酶和1L的去离子水，开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.6mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至6。控制反应温度为25℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留0.09％。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液，将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取，水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.1，加入1L丙酮，搅拌至析出晶体，0～5℃养晶1h后，抽滤，丙酮洗涤，55℃真空干燥，得到硫酸头孢喹肟291g，收率90.3％(HPLC检测最大单杂0.08％，总杂0.39％)。
实施例三
在酶反应器中，加入10000u固定化酶和1L的去离子水，开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.55mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5。控制反应温度为15℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留小于0.1％。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液，将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取，水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.3，加入1L丙酮，搅拌至析出晶体，0～5℃养晶1h后，抽滤，丙酮洗涤，55℃真空干燥，得到硫酸头孢喹肟297g，收率92.1％(HPLC检测最大单杂0.09％，总杂0.51％)。
实施例四
在酶反应器中，加入40000u固定化酶和1L的去离子水，开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.7mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5.3。控制反应温度为20±5℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留小于0.1％。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液，将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取，水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.6，加入1L丙酮，搅拌至析出晶体，0～5℃养晶1h后，抽滤，丙酮洗涤，55℃真空干燥，得到硫酸头孢喹肟296g，收率91.8％(HPLC检测最大单杂0.13％，总杂0.62％)。

Claims (5)

1.一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，其特征在于，所述方法如下：
(1)将头孢菌素酰化酶吸附于酶载体上，得到固定化头孢喹肟合成酶；
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢喹肟合成酶与AE活性酯在水中搅拌混合均匀后，调节pH值至7～8，控制混合液温度为20±5℃，加入7-氨基头孢喹肟，反应12～24h，直至7-氨基头孢喹肟残留小于0.1％；
(3)将步骤(2)所得的反应液通过筛网分离出滤液和固定化头孢喹肟合成酶；
(4)将步骤(3)所得的滤液通过萃洗，再将所得水相用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5±0.5；
(5)将步骤(4)所得的滤液中加入丙酮进行结晶，得到硫酸头孢喹肟。
2.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，其特征在于，步骤(1)所选酶载体为丙烯酸系大孔吸附树脂，其粒度为80～120目，孔径为200nm～1000nm。
3.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，其特征在于，步骤(2)中所述的固定化头孢喹肟合成酶在水中的浓度为10～50u/mL，AE活性酯在水中的浓度为0.05～0.5g/ml，7-氨基头孢喹肟与AE活性酯的摩尔比为1:1.1～1.5。
4.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，其特征在于，步骤(4)中所述的筛网为60-80目。
5.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺，其特征在于，步骤(1)所得到的固定化头孢喹肟合成酶的酶活力为10000～40000u。
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