CN106350566A - 一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺 - Google Patents

一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物专用抗生素原料药硫酸头孢喹肟的酶法工艺,采取在酶的催化作用下,使AE活性酯与7‑氨基头孢喹肟反应生成头孢喹肟,通过筛网过滤分离出含头孢喹肟的母液,经成盐和结晶得到硫酸头孢喹肟。本发明采用酶法合成硫酸头孢喹肟。与现有的化学法技术相比,首先催化合成方面,酶的选择性较高,副反应少,相应产生的杂质也较少,产品质量高,其次酶法工艺用水作反应溶剂,工艺过程中均使用低毒试剂,特别减少了废弃物的产生,在环保方面具有明显的优势,有利于保护环境,另外该工艺具有参数可控性强、反应条件温和、产品质量稳定等特点,且由于酶可以循环利用,该工艺在成本上要明显低于化学法,适合推广及工业化生产。

Description

一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺
技术领域
本发明涉及有机合成领域,具体涉及一种动物专用抗生素原料药硫酸头孢喹肟的酶法工艺。
技术背景
硫酸头孢喹肟是20世纪80年代由德国Hoechst公司开发的第四代动物专用头孢类抗生素,于1993年首次在德国批准上市,英国英特威公司(Intervet)于1994年也随之上市。硫酸头孢喹肟具有抗菌谱广、抗菌活性强、吸收快、低毒性、低残留等特点,对于革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、铜绿假单胞菌均有优良的抗菌活性,尤其对革兰阴性菌的活性更佳。硫酸头孢喹肟吸收快,达峰时间短,生物利用度高,药时曲线下面积大,表现分布容积大。头孢喹肟毒性低,在动物的可食用组织中残留低,安全性高,主要用于治疗牛和猪大肠杆菌引起的奶牛乳房炎,多杀性巴氏杆菌或胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病。
β-内酰胺抗生素经过多年的发展,己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力,较低的毒副作用,在临床上广泛应用,其发展非常迅速。其中,青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初,经过30多年的发展,现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展,配套技术日益完善,具备了大规模工业化生产的条件。青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等,头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等,这些产品有化学半合成法(简称化学法)和酶半合成法(简称酶法)。
化学法需要较多的有机化学原料(如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺),反应条件苛刻,如需无水条件,反应温度低(有的需低至零下90℃),反应步骤多,产生大量的三废需处理。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成,不仅可减少反应步骤,而且还可减少废弃物的产生,有利于保护环境,降低生产成本,产品质量优异,所含杂质极少。近年来,随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展,酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。随着固定化酶技术进步,和对固定化酶在反应中失活原因的深人研究,固定化酶的使用寿命已经大大延长,半数失活(half-life)已经达到50-100批次。因此,21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。
目前,头孢喹肟的合成相关文献报道均为化学法,本发明涉及了一种硫酸头孢喹肟的酶法合成,本发明与现有技术相比具有工艺参数可控性强、反应条件温和等、产品产品质量稳定等特点,特别减少废弃物的产生,有利于保护环境,降低生产成本,产品质量稳定所含杂质极少,且工艺适合工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷,本申请提供了一种利用酶法制备硫酸头孢喹肟的方法。该方法将头孢菌素酰化酶固定在载体上,得到固定化的头孢喹肟合成酶,利用该合成酶催化硫酸头孢喹肟的合成,该方法提高了合成收率,并且使得产品的纯度大大提高。另外,酶固定化以后,可以进行从反应液中进行分离,循环利用。该工艺是一个绿色、环保、节能的新工艺。
为了实现上述目的,本申请所采用的技术方案如下:
一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,具体步骤如下:
(1)将头孢菌素酰化酶吸附于酶载体上,得到固定化头孢喹肟合成酶;
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢喹肟合成酶与AE活性酯在水中搅拌混合均匀后,调节pH值至7~8,控制混合液温度为20±5℃,加入7-氨基头孢喹肟,反应12~24h,直至7-氨基头孢喹肟残留小于0.1%;
(3)将步骤(2)所得的反应液通过筛网分离出滤液和固定化头孢喹肟合成酶,分离出来的固定头孢喹肟合成酶可以循环使用;
(4)将步骤(3)所得的滤液通过萃洗,再将所得水相用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5±0.5;
(5)将步骤(4)所得的滤液中加入丙酮进行结晶,得到硫酸头孢喹肟。
其反应机理为AE活性酯的硫代酯基在弱碱性条件下,经酶催化水解并与酶结合形成活性较高的中间态,再与7-氨基头孢喹肟的氨基经酰胺化反应生成头孢喹肟,反应过程如下:
步骤(1)所选酶载体为丙烯酸系大孔吸附树脂,其粒度为80~120目,孔径为200nm~1000nm。
步骤(1)中所述的固定化酶的制备过程,为将丙烯酸系大孔吸附树脂加入磷酸缓冲液中,再加入头孢菌素酰化酶,15~25℃搅拌24~48h,待固定化后,通过筛网过滤分离、洗涤得到,其中磷酸缓冲液的pH为6.0~8.0,固定温度为15~25℃。
步骤(2)中所述的固定化头孢喹肟合成酶在水中的浓度为10~50u/mL,AE活性酯在水中的浓度为0.05~0.5g/ml,7-氨基头孢喹肟与AE活性酯的摩尔比为1:1.1~1.5。
步骤(4)中所述的筛网为60-80目,所收集的固定化酶可以循环使用;
步骤(1)所得到的固定化头孢喹肟合成酶的酶活力为10000~40000u。
采用上述的技术方案具有以下技术效果:
本发明所述的一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,克服了现有的化学合成方法中的诸多问题,通常化学法中副反应及副产物较多,严重影响产品的提纯过程,产物损失较多,另外化学法中大量使用卤代物(如三甲基碘硅烷)等毒性较高的试剂,不利于环境保护,相应的在工艺的成本上较高;本发明使用的酶法工艺,由于酶对反应的选择性较高,且酶的载体树脂对反应中的杂质有一定的吸附作用,这带来了极其优良的效果,减少了副反应的产生,减少了产物提纯的繁杂程序,其次酶法工艺所用试剂均使用低毒试剂,特别减少了废弃物的产生,在环境保护反面具有明显的优势,由于所使用的物料和试剂价格低廉,酶在回收后经过活化还可以重新利用,在成本上也要明显的低于化学法,另外该酶法工艺还具有反应条件温和、参数可控性强、产品质量稳定等特点,适合工业化生产,对其他β-内酰胺抗生素药物的合成也有一定的参考价值。
具体实施方式
实施例一
在酶反应器中,加入20000u固定化酶和1L的去离子水,开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.65mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5.5。控制反应温度为20℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留0.05%。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液,固定化酶收集循环利用。将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取,水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5,加入1L丙酮,搅拌至析出晶体,0~5℃养晶1h后,抽滤,丙酮洗涤,55℃真空干燥,得到硫酸头孢喹肟289g,收率89.6%(HPLC检测最大单杂0.10%,总杂0.43%)。
实施例二
在酶反应器中,加入30000u固定化酶和1L的去离子水,开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.6mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至6。控制反应温度为25℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留0.09%。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液,将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取,水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.1,加入1L丙酮,搅拌至析出晶体,0~5℃养晶1h后,抽滤,丙酮洗涤,55℃真空干燥,得到硫酸头孢喹肟291g,收率90.3%(HPLC检测最大单杂0.08%,总杂0.39%)。
实施例三
在酶反应器中,加入10000u固定化酶和1L的去离子水,开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.55mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5。控制反应温度为15℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留小于0.1%。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液,将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取,水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.3,加入1L丙酮,搅拌至析出晶体,0~5℃养晶1h后,抽滤,丙酮洗涤,55℃真空干燥,得到硫酸头孢喹肟297g,收率92.1%(HPLC检测最大单杂0.09%,总杂0.51%)。
实施例四
在酶反应器中,加入40000u固定化酶和1L的去离子水,开启搅拌。加入0.5mol的7-氨基头孢喹肟和0.7mol的AE活性酯。滴加1mol/L的盐酸溶液调节pH值至5.3。控制反应温度为20±5℃。反应3h直至HPLC检测7-氨基头孢喹肟残留小于0.1%。将反应液通过筛网分离得到头孢喹肟母液,将所得的头孢喹肟母液用500ml乙酸乙酯萃取,水相中用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.6,加入1L丙酮,搅拌至析出晶体,0~5℃养晶1h后,抽滤,丙酮洗涤,55℃真空干燥,得到硫酸头孢喹肟296g,收率91.8%(HPLC检测最大单杂0.13%,总杂0.62%)。

Claims (5)

1.一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,其特征在于,所述方法如下:
(1)将头孢菌素酰化酶吸附于酶载体上,得到固定化头孢喹肟合成酶;
(2)将步骤(1)所得的固定化头孢喹肟合成酶与AE活性酯在水中搅拌混合均匀后,调节pH值至7~8,控制混合液温度为20±5℃,加入7-氨基头孢喹肟,反应12~24h,直至7-氨基头孢喹肟残留小于0.1%;
(3)将步骤(2)所得的反应液通过筛网分离出滤液和固定化头孢喹肟合成酶;
(4)将步骤(3)所得的滤液通过萃洗,再将所得水相用1mol/L的硫酸溶液调节pH至1.5±0.5;
(5)将步骤(4)所得的滤液中加入丙酮进行结晶,得到硫酸头孢喹肟。
2.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,其特征在于,步骤(1)所选酶载体为丙烯酸系大孔吸附树脂,其粒度为80~120目,孔径为200nm~1000nm。
3.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,其特征在于,步骤(2)中所述的固定化头孢喹肟合成酶在水中的浓度为10~50u/mL,AE活性酯在水中的浓度为0.05~0.5g/ml,7-氨基头孢喹肟与AE活性酯的摩尔比为1:1.1~1.5。
4.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,其特征在于,步骤(4)中所述的筛网为60-80目。
5.如权利要求1所述的合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺,其特征在于,步骤(1)所得到的固定化头孢喹肟合成酶的酶活力为10000~40000u。
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