CN107217048A - 一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用。所述氨肽酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制备，首先构建生物酶的基因工程菌株，将全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性内切酶SalⅠ线性化重组质粒。本发明构建的基因工程菌，适合高密度培养，生物合成胞外酶，固液分离、超滤浓缩获得酶液，常温、常压水溶液中可催化组氨酸和β丙氨酸高效合成肌肽，具有反应环境友好，生产成本低，转化时间短、工艺操作简单，反应体系杂质含量低，易后处理，具有大规模工业应用的广泛前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成肌肽的方法，尤其是采用高效的氨肽酶催化和现代化的分离技术的肌肽合成方法，具体是一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法。
背景技术
L-肌肽1900年首次在牛肉中发现，在哺乳动物的大脑、肌肉和其他组织中广泛存在，其结构主要由β-丙氨酸和L-组氨酸两部分组成，是一种天然的活性二肽，在水、0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠中易溶，在甲醇、乙腈、无水乙醇、三氯甲烷和丙酮中几乎不溶。研究证明L-肌肽有抗氧化作用，有抗衰老功能，对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有治疗效果，还有抗肿瘤等生物活性，可延缓皮肤衰老。与其他抗氧化剂相比，L-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用的优点，并有多种生理活性，在医药、保健、卫生、美容等领域有广泛的应用前景。目前，L-肌肽新的生理活性与机制的探索仍是热点。文献报道的L-肌肽的化学合成方法较多，主要有两大类：（1）有β-丙氨酸参与的反应。大致的方法是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸反应，然后脱掉保护基团得到产品肌肽。（2）无β-丙氨酸直接参与的反应。大致方法为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体反应生成肽键，再经进一步反应转换为肌肽。在本发明中使用氨肽酶催化L-组氨酸与β-丙氨酸合成肌肽，制酶成本低，合成时间短、转化率高、环境友好，工艺操作简单、安全等，具有大规模工业应用的广泛前景。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成肌肽的氨肽酶。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述催化合成肌肽的氨肽酶的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种催化合成肌肽的氨肽酶的制备方法。
本发明提供肌肽的氨肽合成采用氨肽酶法催化一步合成肌肽；
本发明采用酶高效催化组氨酸和β丙氨酸生成肌肽，并采用现代化的先进分离技术，使肌肽的工业化生产成本大大降低。
本发明的技术方案如下：
一种催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
根据本发明所述催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。
根据本发明所述催化肌肽的生物合成的氨肽酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。
本发明还提供一种编码所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明还提供一种所述的氨肽酶基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
（1）首先构建氨肽酶的基因工程菌株，将上述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；
（2）取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养40h；
（3）在平板上挑取单菌落转移至液体培养基中，30℃，振荡培养24小时，OD600增长至4～5；
（4）以10%的接种量接种至液体培养基的摇瓶中，30℃，200rpm振荡培养，约24小时后OD600生长至12左右；
（5）将发酵培养基配制好后，转移至发酵罐中，121℃灭菌30min；降温至30±2℃，使用氨水调节pH值至5.0；
（6）将培养好的菌种液接种至发酵罐，接种量5%；
（7）根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30%以上，诱导发酵96小时后，放罐；
（8）离心，收集清液；
（9）将清液超滤浓缩后冻干，得到合成肌肽用氨肽酶的冻干粉。
采用上述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步骤：
1）β-丙氨酸甲酯盐酸盐合成：
1.1）向反应釜中加入甲醇，控温0～20℃将氯化亚砜滴入其中，滴加完毕，加入β-丙氨酸，30～60℃保温搅拌；
1.2）30～50℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩，浓缩至无馏分流出，得β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2）酶催化反应：
2.1 向反应釜中加入L-组氨酸、去离子水、上述反应制备的β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2.2 在15～45℃温度下，用碱性溶液调节pH值至7.0～9.0；
2.3 加入如权利要求4所述制备的氨肽酶，该氨肽酶的用量为反应液体积的1%～3%，25～45℃搅拌反应，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在7.0～9.0；
3）肌肽粗品制备：
3.1 反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；
3.2 将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；
3.3 将得到的超滤透析液通过纳滤机进行纳滤，收集纳滤浓缩液；
3.4 将纳滤浓缩液上离子树脂柱，树脂柱的径高比为0.05～0.2，上样pH值为5.0～7.0；
3.5 用纯化水冲洗树脂柱；
3.6 用1%～5%的氨水洗脱解吸附树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；
3.7 将收集的洗脱液50～80℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩肌肽含量至20～40%；
3.8 加入析晶溶剂，0～25℃，搅拌析晶10～24h；
3.9 析晶完毕，放料离心，30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥6～8h，得肌肽粗品。
作为优选，所述的析晶溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。
作为优选，所述的超滤机的滤膜孔径为8000～10000道尔顿。
作为优选，所述的纳滤机的滤膜孔径为200～300道尔顿。
有益的效果：在本发明中使用氨肽酶催化L-组氨酸与β-丙氨酸合成肌肽，相比传统化学法，其污染小、反应周期短，能耗低，酶反应生成率高，可到达95%以上，更利于产业化。本发明采用滤膜孔径为8000-10000道尔顿的超滤机，可在酶反应后有效去除反应液中残留的大分子酶，减少成品的杂质。本发明采用滤膜孔径为200-300道尔顿的纳滤机，可有效去除反应液中的小分子无机盐，减少成品的杂质，且污染小，成本低，适于酶催化合成肌肽工艺的产业化。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅由于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：氨肽酶的基因工程菌株构建
将全基因合成的生物酶片段（序列如SEQ ID NO：1所示，由常州基宇生物科技有限公司合成），经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ（购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作）酶切后重组到酵母表达载体pPIC9k（invitrogen公司），转化到E.coli Top10感受态（购自北京全式金生物技术有限公司），将E.coli Top10置于LB液体培养基中，37℃、160rpm转振荡培养过夜，提取重组质粒。利用限制性内切酶SalⅠ（购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作）线性化重组质粒。
巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞（invitrogen公司）：将Pichia Pastoris GS115单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的Pichia GS115按0.5%的接种量接入50mlYPD培养基中30℃培养至对数期，离心获得的菌体用20ml无菌水洗2次，再用20ml无菌1M山梨醇洗2次，加入1ml1M山梨醇溶液重悬菌体获得巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞。
将线性化片段加入到80μl巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中冰浴5分钟，电转化后加入800μl山梨醇将细胞洗至1.5ml无菌离心管中，25℃温育2小时后，离心涂MD平板，30℃培养至长出菌落后，划线分离出单菌落。将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase（购自sigma公司）后37℃温育1小时消化细胞壁，取部分消化产物加入PCR体系检测阳性克隆。
将阳性克隆挑入YPD液体培养基后转接入BMGY液体培养基中，培养至OD为1.0时接入1%甲醇诱导，诱导72小时，每24小时补加一次甲醇用于表达本发明的生物酶。
实施例2：氨肽酶的发酵制备
取原种菌种在YPD划线，30℃，倒置培养过夜。在平板上挑取单菌落（直径1mm）至50mlYPD液体培养基（酵母粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，加水定容至1L）中，30℃，200rpm振荡培养过夜（24h），OD600增长至4-5。以10%的接种量接种至含300mlYPD液体培养基（1L三角瓶）摇瓶中，30℃、200rpm摇床振荡培养，约24小时后OD600长到12左右。将发酵培养基配制完成后，转入发酵罐（30L），121℃灭菌30min；降温至30℃，使用氨水调节pH值至5.0。将培养好的菌种液接种至发酵罐，接种量5%。根据溶氧调节转速和通气，控制溶氧在30%以上。培养24小时左右，待溶氧突变上升，此时湿重约为140g/L，开始补料50%（w/v）甘油水溶液，补料速度约为15ml/L发酵液/小时，补料速度控制溶氧保持在30%以上；待菌种湿重长至180 g/L左右，停止补加甘油，以7.2 ml/L发酵液/小时流速流加100%甲醇，诱导10小时后，pH值调节为6.0，诱导24小时，pH调节为7.0，补料速度保持不变，根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30%以上。诱导96小时菌体湿重约为340g/L左右放罐。离心，收集清液，超滤浓缩后冻干，得到合成肌肽用生物酶冻干粉。
实施例3 氨肽酶催化合成肌肽
包括如下步骤：
1）β-丙氨酸甲酯盐酸盐合成：
1.1）向反应釜中加入甲醇，控温0～20℃将氯化亚砜滴入其中，滴加完毕，加入β-丙氨酸，30～60℃保温搅拌；
1.2）30～50℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩，浓缩至无馏分流出，得β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2）酶催化反应：
2.1 向反应釜中加入L-组氨酸、去离子水、上述反应制备的β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2.2 在15～45℃温度下，用碱性溶液调节pH值至7.0～9.0；
2.3 加入如权利要求4所述制备的氨肽酶，该氨肽酶的用量为反应液体积的1%～3%，25～45℃搅拌反应，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在7.0～9.0；
3）肌肽粗品制备：
3.1 反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；
3.2 将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；
3.3 将得到的超滤透析液通过纳滤机进行纳滤，收集纳滤浓缩液；
3.4 将纳滤浓缩液上离子树脂柱，树脂柱的径高比为0.05～0.2，上样pH值为5.0～7.0；
3.5 用纯化水冲洗树脂柱；
3.6 用1%～5%的氨水洗脱解吸附树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；
3.7 将收集的洗脱液50～80℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩肌肽含量至20～40%；
3.8 加入析晶溶剂，0～25℃，搅拌析晶10～24h；
3.9 析晶完毕，放料离心，30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥6～8h，得肌肽粗品。
本实施例中，所述的析晶溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。
本发明所述的超滤机的滤膜孔径为8000～10000道尔顿；所述的纳滤机的滤膜孔径为200～300道尔顿。
在本发明中使用氨肽酶催化L-组氨酸与β-丙氨酸合成肌肽，相比传统化学法，其污染小、反应周期短，能耗低，酶反应生成率高，可到达95%以上，更利于产业化。本发明采用滤膜孔径为8000-10000道尔顿的超滤机，可在酶反应后有效去除反应液中残留的大分子酶，减少成品的杂质。本发明采用滤膜孔径为200-300道尔顿的纳滤机，可有效去除反应液中的小分子无机盐，减少成品的杂质，且污染小，成本低，适于酶催化合成肌肽工艺的产业化。
SEQ ID NO：1
ATGCGTATTCGCGATCTGCTGCCGAATCTGCGTCTGGGTCGTCATTCACCGGGTCCGCTGAATAGTCTGACCGACGTTCCGGGCGTACTGGTTCATACCCAGAGCGTTATCCTGCCGAAAACCGCACATCATCACGAAGTTAATACCGGCGTCACCTGTATTCTGCCGCGTCGCGATTTTGTTGATCAGGGCTGTTACGCGAGCGTTTTTCGCTTTAACGGTTGCGGCGAAATGACCGGTAGTCATTGGATTGACGAAACGGGTCTGCTGAACAGCCCGATTGTTCTGACCAACAGCTACAGCGTTGGCGCAGCATATAGCGGCATTTATCAGCATTGCCGTAGTCAGCTGGCTGTTAAACAGGGTCCGGAAAAAGGTCTGTGCAACGGTTTCATTCTGCCGGTTGTCAGCGAAACCTTCGACGGTTATCTGAGCGATATTGGCGCAATGGCAGTTACCCCGGAACACGTTGCACAAGGTATTGAGTCTGCCTCTGCGATGCAAGTTCCGGAAGGTAATACCGGCGGCGGTACCGGTACCATTTGTCAGGGCTTTAAAGGCGGTACCGGTTCTAGCAGCCGCGTTATTGACGGTCTGATTTCTGAAGGCGGCGAAGGTAGTAAACCGGTTAAATACACCATTGCGGCACTGGTTCAGACCAACTTTGGTACCAGTCGCGATCTGCGCGTTGGTGGCGTTCCGGTTGGTCAGCTGATGAAAGAAGAAGTCATTGCAGAAGCAACCACCCGTCGTGAAGACGAAGGCGTTAAAGACGGTAGCATTATTGTAGTTCTGGCAACCGACGCACCGCTGCATCCGCTGCAACTGCAACGCGTTGCAAAACGTGCGGCAGTTGGTTTTTCTCGCGTTGGTGGTTGGGGTAGTAATAGCTCAGGCGATATCTTCCTGGCGTTTAGCACCAGCCATCATATTCCGCGCGATCCGGTATTTAGCTGGAAACCGACCGTTGGTCAGAGCGTGCAGGTTGTTCAGGACGTTACCAGCAACGCACTGTTTGAAGCAGCAGCAGACGTTACCGAAGAAGCAATTTATAACGCGCTGTGTTGCGCCCAAGATATGCGCGGTCCGGCAGGTCGTTTTGTTCGCGCACTGGATCTGGAGAAACTGAAAAGCATCGTCGAGAAATACCTGTGA
SEQ ID NO：2
MRIRDLLPNLRLGRHSPGPLNSLTDVPGVLVHTQSVILPKTAHHHEVNTGVTCILPRRDFVDQGCYASVFRFNGCGEMTGSHWIDETGLLNSPIVLTNSYSVGAAYSGIYQHCRSQLAVKQGPEKGLCNGFILPVVSETFDGYLSDIGAMAVTPEHVAQGIESASAMQVPEGNTGGGTGTICQGFKGGTGSSSRVIDGLISEGGEGSKPVKYTIAALVQTNFGTSRDLRVGGVPVGQLMKEEVIAEATTRREDEGVKDGSIIVVLATDAPLHPLQLQRVAKRAAVGFSRVGGWGSNSSGDIFLAFSTSHHIPRDPVFSWKPTVGQSVQVVQDVTSNALFEAAADVTEEAIYNALCCAQDMRGPAGRFVRALDLEKLKSIVEKYL
Claims (8)
1.一种催化合成肌肽的氨肽酶，所述氨肽酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述催化合成肌肽的氨肽酶，其特征在于，所示氨肽酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。
3.一种编码权利要求1所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种权利要求1所述的氨肽酶的制备方法，包括如下步骤：
1）首先构建氨肽酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；
2）取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养40h；
3）在平板上挑取单菌落转移至液体培养基中，30℃，振荡培养24小时，OD600增长至4～5；
4）以10%的接种量接种至液体培养基的摇瓶中，30℃，200rpm振荡培养，约24小时后OD600生长至12左右；
5）将发酵培养基配制好后，转移至发酵罐中，121℃灭菌30min；降温至30±2℃，使用氨水调节pH值至5.0；
6）将培养好的菌种液接种至发酵罐，接种量5%；
7）根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30%以上，诱导发酵96小时后，放罐；
8）离心，收集清液；
9）将清液超滤浓缩后冻干，得到合成肌肽用氨肽酶的冻干粉。
5.采用权利要求1所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步骤：
1）β-丙氨酸甲酯盐酸盐合成
1.1）向反应釜中加入甲醇，控温0～20℃将氯化亚砜滴入其中，滴加完毕，加入β-丙氨酸，30～60℃保温搅拌；
1.2）30～50℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩，浓缩至无馏分流出，得β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2）酶催化反应
2.1 向反应釜中加入L-组氨酸、去离子水、上述反应制备的β-丙氨酸甲酯盐酸盐；
2.2 在15～45℃温度下，用碱性溶液调节pH值至7.0～9.0；
2.3 加入如权利要求4所述制备的氨肽酶，该氨肽酶的用量为反应液体积的1%～3%，25～45℃搅拌反应，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在7.0～9.0；
3）肌肽粗品制备
3.1 反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；
3.2 将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；
3.3 将得到的超滤透析液通过纳滤机进行纳滤，收集纳滤浓缩液；
3.4 将纳滤浓缩液上离子树脂柱，树脂柱的径高比为0.05～0.2，上样pH值为5.0～7.0；
3.5 用纯化水冲洗树脂柱；
3.6 用1%～5%的氨水洗脱解吸附树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；
3.7 将收集的洗脱液50～80℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩肌肽含量至20～40%；
3.8 加入析晶溶剂，0～25℃，搅拌析晶10～24h；
3.9 析晶完毕，放料离心，30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥6～8h，得肌肽粗品。
6.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的析晶溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。
7.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的超滤机的滤膜孔径为8000～10000道尔顿。
8.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的纳滤机的滤膜孔径为200～300道尔顿。
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| PCT/CN2018/094838 WO2019011192A1 (zh) | 2017-07-10 | 2018-07-06 | 一种催化合成二肽的氨肽酶及其制备方法 |
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