CN110257356A

CN110257356A - 一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因

Info

Publication number: CN110257356A
Application number: CN201910428956.4A
Authority: CN
Inventors: 陈晶瑜; 孟娇; 于波; 张臻峰
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS; China Agricultural University
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; China Agricultural University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110257356B

Abstract

本发明公开了一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因。本发明提供的蛋白质，可作为β‑氨基肽酶催化肌肽的合成，其氨基酸序列如序列表的序列1所示，按照大肠杆菌系统的密码子偏好性对其编码基因进行密码子优化，优化后的β‑氨基肽酶编码基因如序列表的序列2所示。本发明采用生物催化合成法获取L‑肌肽，绿色、环保，具有广泛应用前景。

Description

一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因。

背景技术

肌肽，又名N-β-丙氨酰-L-组氨酸，是由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽，具有一个化学活性中心，是目前为止发现的结构最简单的生物活性肽之一。肌肽广泛存在于机体的各器官组织，特别在骨骼肌，脑，眼晶体状中含量较高。L-肌肽卓越的抗氧化性已得到共识，是继SOD和维生素E后又一被发现的天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂，含有肌肽的滴眼液现为某药厂开发的一类新药。此外，L-肌肽具有的其它功能如保护神经细胞，pH缓冲，螯合金属离子，抗脂质过氧化等已经基本得到共识。在食品领域，L-肌肽是一种理想的，有应用价值的食品抗氧化剂。

L-肌肽的制取方式主要有化学合成法和天然提取法。由于天然肌肽含量较低(最高为20mmol/L)，因此天然提取法成本较高，不适用于工业化生产。目前，肌肽较为普遍的生产方法为化学合成。近年来发展起来的一种收率较高的制备方法为丙氨酸氨基保护用丙氨酸酰氯盐酸盐与组氨酸盐酸盐在乙酸中反应得到L-肌肽。由于化学合成法生产过程中不可避免地生成有毒物质，安全性低，因此利用生物催化的方法生产L-肌肽不仅安全，而且符合绿色化学的要求。另一方面，化学合成过程需要首先对氨基酸非参与反应基团进行保护，反应完成后还需要去除保护基团，工艺繁杂，收率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因。

本发明首先提供了一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(a3)与序列表的序列1自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还保护所述蛋白质的基因。

所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的片段替换为了序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌是将所述基因导入宿主菌中得到的。

所述基因可通过含有所述基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。

所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护所述蛋白质在作为β-氨基肽酶中的应用。

本发明还保护所述蛋白质在制备肌肽中的应用。

本发明还保护含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备肌肽中的应用。

本发明还保护一种制备β-氨基肽酶的方法，包括如下步骤：培养以上任一所述的重组菌，从重组菌中得到β-氨基肽酶。

所述“从重组菌中得到β-氨基肽酶”具体可包括步骤(c1)和(c2)：

(c1)破碎所述重组菌菌体，得到含有β-氨基肽酶的粗提液；

(c2)分离所述粗提液中的β-氨基肽酶，得到6-磷酸葡萄糖异构酶。

所述分离所述粗提液中的β-氨基肽酶可采用亲和层析的方法对所述粗提液中的β-氨基肽酶进行纯化，具体可采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。

本发明还保护一种制备肌肽的方法，包括如下步骤：以β-丙胺酰氨和L-组氨酸为底物，采用所述蛋白质或所述重组菌进行催化反应合成肌肽。

所述方法中，当采用所述重组菌进行催化反应时，所述催化反应的反应体系中包括如下组分：OD600＝20-30的重组菌菌液、β-丙胺酰氨和L-组氨酸。β-丙胺酰氨在反应体系中的浓度为10mM，L-组氨酸在反应体系中的浓度为50mM。可采用Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液(60ml0.1M Na₂CO₃溶液与40ml 0.1M NaHCO₃溶液混合)(pH＝10)重悬所述重组菌菌体得到重组菌菌液。所述催化反应的反应条件为30℃、200rpm反应3-8h(具体可为6h)。反应结束后，从反应体系中取样1ml，加入100μl 6M盐酸溶液终止反应，将反应体系离心取上清液，将上清液过水系孔径为0.22μm的PES聚醚砜滤膜后得到反应产物(肌肽)。

所述方法中，当采用所述蛋白质进行催化反应时，所述催化反应的反应体系中包括如下组分：100mM Na₂CO₃/NaHCO₃(pH＝10)缓冲液、所述蛋白质、β-丙胺酰氨和L-组氨酸。β-丙胺酰氨在反应体系中的浓度为10mM，L-组氨酸在反应体系中的浓度为50mM。所述蛋白质酶用量约为3.7mU。所述催化反应的反应条件为30℃、200rpm反应3-8h(具体可为7.5h)。反应结束后，加600mM盐酸终止反应。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述蛋白质或所述重组菌、β-丙胺酰氨和L-组氨酸；所述试剂盒的用途为制备肌肽。

以上任一所述肌肽具体可为L-肌肽。

本发明提供了一种可用于合成肌肽的酶，并按照大肠杆菌系统的密码子偏好性进行了相应的密码子优化，且对其进行了功能验证。本发明采用生物催化合成法获取L-肌肽，绿色、环保，具有广泛应用前景。

附图说明

图1为肌肽标准品和反应产物的反相色谱检测结果。

图2为肌肽标准品和反应产物的HPLC-MS联用检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET26b载体：序列表的序列3所示的环状质粒。

大肠杆菌BL21(DE3)：北京博迈德基因技术有限公司，货号:BC201-01。

β-丙胺酰氨：上海毕得医药科技有限公司，货号：BD21975。

L-组氨酸：北京华奥正生科技有限公司，货号:H0010。

肌肽标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：C106843。

Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0893。

实施例1、β-氨基肽酶的发现

对深海微生物宏基因组文库进行大量的序列分析和功能验证，发现了一种合成肌肽的β-氨基肽酶，如序列表的序列1所示。按照大肠杆菌系统的密码子偏好性对其编码基因进行密码子优化，优化后的β-氨基肽酶编码基因如序列表的序列2所示。

实施例2、β-氨基肽酶在合成肌肽中的应用

一、全细胞催化合成肌肽

1、将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的片段替换为了序列表的序列2所示的DNA分子，得到重组表达载体(已经测序验证)。

2、将步骤1得到的重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌液OD600＝0.6-0.8，向培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为0.02mM)，16℃、120rpm诱导过夜(12-14h)。

4、完成步骤3后，收集培养体系，离心收集菌体沉淀。

5、取步骤4得到的菌体沉淀，进行全细胞催化反应，步骤如下：

(1)将步骤4得到的菌体沉淀采用Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液(60ml 0.1M Na₂CO₃溶液与40ml 0.1M NaHCO₃溶液混合)(pH＝10)清洗两遍后，重悬，调整溶液OD600＝20-30，加入β-丙胺酰氨和L-组氨酸，组成催化反应体系。催化反应体系中，β-丙胺酰氨的浓度为10mM，L-组氨酸的浓度为50mM。

(2)将步骤(1)配置的反应体系在30℃、200rpm条件下反应不同时间(3h、4h、5h、6h、7h和8h)。

(3)完成步骤(2)后，从反应体系中取样1ml，加入100μl 6M盐酸溶液终止反应，将反应体系离心取上清液，将上清液过水系孔径为0.22μm的PES聚醚砜滤膜后得到反应产物。

6、取步骤5得到的反应产物，通过反相色谱法测定肌肽合成情况。

反相色谱条件如下：

固定相：NH₂色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈-40mM磷酸氢二钾溶液(乙腈和40mM磷酸氢二钾溶液的体积比为44：56，用磷酸调pH值为6.3)；

流速：1.0mL/min；

紫外检测波长：210nm。

采用肌肽标准品为参考。

肌肽标准品的出峰时间为12.13min，在相同条件下出峰位置为±0.08min以内，可以认定为同一物质。

结果如图1所示。图1A为标准品和不同时间的反应产物的色谱峰图。图1B为将图1A中不同时间的反应产物色谱峰方法后的结果图。图1B中，色谱峰由高到低依次对应反应时间6h、8h、7h、5h、4h和3h的反应产物。

结果表明，反应产物中存在肌肽，且产量随着反应时间的延长而增高，在反应6h之后量随之降低，在6h的时候产生的量最多，大约在0.5mM左右。

为了确认图1这个的色谱峰确实为肌肽峰，采用HPLC-MS联用技术来进一步鉴定。

HPLC-MS联用检测条件如下：

色谱柱：C18柱(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱；

流动相：0.2％(体积百分含量)甲酸溶液-乙腈(0.2％甲酸溶液和乙腈的体积比为65∶35)；

流速：0.5mL/min；

柱温：25℃。

采用肌肽标准品为参考。

结果为图2所示。图2A为标准品的结果图，图2B为反应6h的产物的结果图。

肌肽标品离子峰m/z为225，采用负离子模式，与已知肌肽相对分子量226.23相符。

上述结果表明，本发明发现的β-氨基肽酶可用于催化肌肽的合成。

二、蛋白纯化及催化反应

1、取步骤一的4收集的菌体沉淀，置冰上超声破碎后得到全细胞裂解液。

2、取步骤1的得到的全细胞裂解液，12000rpm离心10分钟，收集上清液(粗酶液)。

3、取步骤2得到的粗酶液进行酶活测定。

酶活测定方法采用HPLC测定，条件方法同步骤一的6。

酶活U＝产量(μmol)/时间(min)。

经过检测，粗酶液酶活约为0.49mU。

4、取步骤2得到的粗酶液，采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化(具体方法参照试剂盒操作手册)，杂蛋白用洗脱液Ⅰ(pH 7.9 Tris-HCl 4mmol/L，咪唑60mmol/L，NaCl 0.1mol/L)进行洗脱，目的蛋白用洗脱液Ⅱ(pH 7.9 Tris-HCl 4mmol/L，咪唑300mmol/L，NaCl 0.1mol/L)洗脱并通过超滤管脱盐、浓缩后于-80℃保存)，得到纯化后的β-氨基肽酶溶液(约0.03U/mg)。

5、取步骤4得到的β-氨基肽酶溶液，以β-丙胺酰氨和L-组氨酸为底物进行催化反应。反应体系(1ml)：100mM Na₂CO₃/NaHCO₃(pH＝10)缓冲液,10mMβ-丙胺酰氨,50mM L-组氨酸，β-氨基肽酶用量约为3.7mU。将反应体系在30℃、200rpm条件下反应7.5h后加600mM盐酸终止反应。

反应结束后，采用反相色谱法测定肌肽合成情况(方法同步骤一的6)。

结果显示，反应7.5h的肌肽产量约为1.7mM。

序列表

<110> 中国农业大学

中国科学院微生物研究所

<120> 一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Ile Ile Ser Ser Val Ser Ala Ala Glu Pro Ile Arg Ala Arg Asp

1 5 10 15

Leu Gly Ile Pro Phe Asp Gly Gln Pro Gly Ser Leu Asn Ala Ile Thr

20 25 30

Asp Val Ala Gly Val Glu Val Gly Gln Val Thr Leu Ile Asp Gly Glu

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Val Gly Ser Gly Pro Val Arg Thr Gly Val Thr Val

50 55 60

Ile His Pro Arg Gly Arg Asn Ser Thr Asp Val Phe Ala Gly Trp Phe

65 70 75 80

Ala Leu Asn Ala Ser Gly Glu Met Thr Gly Thr Thr Trp Leu Glu Glu

85 90 95

Arg Gly Met Val Asp Gly Pro Ile Ala Ile Thr Asn Thr His Ser Val

100 105 110

Gly Val Val Arg Asp Ala Ala Val Ala Trp Met Val Glu Gln Gly Trp

115 120 125

Pro Ala Asp Trp His Ala Pro Val Val Ala Glu Thr Tyr Asp Gly Gly

130 135 140

Leu Asn Asp Ile Asn Gly Phe His Val Thr Arg Glu His Ala Leu Glu

145 150 155 160

Ala Met Ala Lys Ala Arg Thr Gly Val Val Glu Glu Gly Val Val Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Gly Met Val Cys Asn Gly Phe Lys Gly Gly Ile Gly Thr

180 185 190

Ser Ser Arg Val Phe Asp Ala Leu Gly Arg Ser Phe Thr Val Gly Ile

195 200 205

Leu Val Gln Cys Asn Tyr Asn Trp Asp Gly Glu Gln Asp Leu Arg Ile

210 215 220

Gly Gly Lys Asn Met Ser Gly Leu Leu Pro Val Gly Lys His Cys Phe

225 230 235 240

Ile Tyr Arg Asp Val Pro Arg His Val Asn Trp Tyr Pro Tyr Cys Asp

245 250 255

Asp Ser Ser Ala Asn Asp Glu Leu Asp Lys Pro Thr Arg Asp Gly Ser

260 265 270

Ile Ile Ile Ile Val Ala Thr Asp Ala Pro Leu Leu Pro His Gln Leu

275 280 285

Arg Arg Leu Ala Lys Arg Pro Ala Leu Gly Leu Gly Arg Leu Gly Gly

290 295 300

Ile Ser Ser Asp Gly Ser Gly Asp Ile Phe Leu Ala Phe Ser Thr Ala

305 310 315 320

Ser Pro Gly Leu Ile Asn Glu Asn Glu Glu Ser Thr Ile Ser Met Phe

325 330 335

Pro Asn Asn Gly Leu Ser Val Val Phe Glu Ala Ala Val Gln Ala Thr

340 345 350

Glu Glu Ala Ile Val Asn Ala Met Val Ala Ala Glu Thr Val Val Gly

355 360 365

Ala Ser Gly Leu Gln Val Glu Glu Met Pro Glu Asp Gln Leu Arg Ala

370 375 380

Ile Phe Leu Asp

385

<210> 2

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgatcatct cttctgtttc tgctgctgaa ccgatccgtg ctcgtgacct gggtatcccg 60

ttcgacggtc agccgggttc tctgaacgct atcaccgacg ttgctggtgt tgaagttggt 120

caggttaccc tgatcgacgg tgaaggtgct ctgctggttg gttctggtcc ggttcgtacc 180

ggtgttaccg ttatccaccc gcgtggtcgt aactctaccg acccggtttt cgctggttgg 240

ttcgctctga acgcttctgg tgaaatgacc ggtaccacct ggctggaaga acgtggtatg 300

gttgacggtc cgatcgctat caccaacacc cactctgttg gtgttgttcg tgacgctgct 360

gttgcttgga tggttgaaca gggttggccg gctgactggc acgctccggt tgttgctgaa 420

acctacgacg gtggtctgaa cgacatcaac ggtttccacg ttacccgtga acacgctctg 480

gaagctatgg ctaaagctcg taccggtgtt gttgaagaag gtgttgttgg tggtggtacc 540

ggtatggttt gcaacggttt caaaggtggt atcggtacct cttctcgtgt tttcgacgct 600

ctgggtcgtt ctttcaccgt tggtatcctg gttcagtgca actacaactg ggacggtgaa 660

caggacctgc gtatcggtgg taaaaacatg tctggtctgc tgccggttgg taaacactgc 720

ttcatctacc gtgacgttcc gcgtcacgtt aactggtacc cgtactgcga cgactcttct 780

gctaacgacg aactggacaa accgacccgt gacggttcta tcatcatcat cgttgctacc 840

gacgctccgc tgctgccgca ccagctgcgt cgtctggcta aacgtccggc tctgggtctg 900

ggtcgtctgg gtggtatctc ttctgacggt tctggtgaca tcttcctggc tttctctacc 960

gcttctccgg gtctgatcaa cgaaaacgaa gaatctacca tctctatgtt cccgaacaac 1020

ggtctgtctg ttgttttcga agctgctgtt caggctaccg aagaagctat cgttaacgct 1080

atggttgctg ctgaaaccgt tgttggtgct tctggtctgc aggttgaaga aatgccggaa 1140

gaccagctgc gtgctatctt cctggac 1167

<210> 3

<211> 5360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

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agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

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tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

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ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaaatac ctgctgccga ccgctgctgc 5100

tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc gatggccatg gatatcggaa ttaattcgga 5160

tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca 5220

ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga 5280

gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa 5340

aggaggaact atatccggat 5360

Claims

1.蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述的蛋白质在作为β-氨基肽酶中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白质在制备肌肽中的应用。

7.权利要求2或3所述的基因，或，权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备肌肽中的应用。

8.一种制备β-氨基肽酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求4所述的重组菌，从重组菌中得到β-氨基肽酶。

9.一种制备肌肽的方法，包括如下步骤：以β-丙胺酰氨和L-组氨酸为底物，采用权利要求1所述的蛋白质或权利要求4所述的重组菌进行催化反应合成肌肽。

10.一种试剂盒，包括权利要求1所述的蛋白质或权利要求4所述的重组菌、β-丙胺酰氨和L-组氨酸；所述试剂盒的用途为制备肌肽。