CN113767169A - 用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的修饰的单加氧酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可用于芳烃羟基化的新型单加氧酶。它们特别可用于分别由萘酚和7‑乙氧基香豆素生产1‑萘酚和7‑羟基香豆素。

Description

用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的修饰的单加 氧酶

本发明涉及可用于芳烃羟基化的新型单加氧酶。它们特别可用于分别由萘和7-乙氧基香豆素生产1-萘酚和7-羟基香豆素。

羟基化烃，特别是1-萘酚和7-羟基香豆素，是化学工业中重要的原料。目前，所述化合物通过纯化学方法来生产。目前使用的生产1-萘酚的化学方法主要分为三种类型。在大规模生产中最广泛使用的方法基于萘的氢化、氧化和脱氢。该方法的特征在于高质量和连续生产，但产率低。此外，目前制备萘酚的方法需要酸、碱和金属催化剂。这些化合物可能是昂贵的，或者如果没有适当处理可能引起环境问题。适当的处理可能是额外的成本因素。

生物技术方法对于化学品化合物的合成已经变得更受欢迎。通常，此类方法的特征在于温和的反应条件，因此节省能量，和高特异性，使得形成很少的不期望的副产物。已经从赤红球菌（Rhodococcus ruber）中分离出能够将羟基基团引入到各种芳烃中的P450单加氧酶(Liu等, 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 876-882)。原则上，该酶为制备羟基化芳烃的生物技术方法开辟了途径。然而，野生型酶具有对于经济上可行的生产方法而言不足够的低催化活性。

上述问题通过权利要求书和以下说明书中限定的实施方案来解决。

在第一实施方案中，本发明涉及修饰的P450单加氧酶，其中至少一个选自以下的氨基酸被丙氨酸取代：亮氨酸87、谷氨酸88、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208、谷氨酰胺209和缬氨酸210，其中所述功能性突变导致对芳烃羟基化的反应性提高。

SEQ ID NO. 1定义了原始衍生自赤红球菌的P450单加氧酶的氨基酸序列。“修饰的P450单加氧酶”具有与SEQ ID NO. 1中定义的氨基酸序列相差上文定义的取代中的至少一个的氨基酸序列。

除了本申请中上文和下文列出的序列修饰之外，本发明的修饰的P450单加氧酶的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所定义的野生型酶的氨基酸序列可以具有进一步的差异，条件是这些序列差异不影响其功能，即对芳烃(aromatic carbons)羟基化的反应性提高。本领域技术人员熟知，并非酶的氨基酸序列的所有部分都同等重要。不作为前述区的部分的序列区在许多情况下可以被改变或甚至缺失而不损害蛋白质的酶活性。

因此，本发明还涉及与SEQ ID No. 1所定义的氨基酸序列具有至少90%、更优选至少95%和最优选至少98%序列同一性的蛋白质，条件是此类蛋白质仍然具有提高的对芳烃羟基化的反应性。

本领域技术人员知道，自SEQ ID No. 1添加或缺失氨基酸可以改变本申请中所述的特定氨基酸位置。因此，本申请中基于野生型序列所指的任何氨基酸位置必须理解为是指通过缺失或添加氨基酸衍生自SEQ ID No. 1的蛋白质中的同源氨基酸位置。

具有上述序列同一性程度的SEQ ID No. 1的变体优选仅通过氨基酸的保守取代衍生自SEQ ID No. 1。“保守取代”是在一个氨基酸上被具有相似性质的不同氨基酸取代。优选地，它是将具有非极性侧链的氨基酸换成具有非极性侧链的另一种氨基酸，将具有酸性侧链的氨基酸换成具有酸性侧链的另一种氨基酸，将具有碱性侧链的氨基酸换成具有碱性侧链的另一种氨基酸，或将具有极性侧链的氨基酸换成具有极性侧链的另一种氨基酸。由于保守取代中侧链的性质没有太大变化，因此不会严重影响所得蛋白质的整体结构。

通过添加氨基酸衍生自该序列并具有上述序列同一性程度的SEQ ID No. 1的变体优选通过在C-末端和/或N-末端添加至多35个、更优选至多20个和最优选至多10个氨基酸来衍生自SEQ ID No. 1。向蛋白质的典型添加是添加使得表达的蛋白质的纯化更容易的氨基酸序列。一种特别优选的修饰是添加若干组氨酸，即所谓的“组氨酸标签(his-tag)”。还优选添加肽接头。

通过缺失氨基酸衍生自该序列并具有上述序列同一性程度的SEQ ID No. 1的变体优选通过在C-末端和/或N-末端缺失至多35个、更优选至多20个和最优选至多10个氨基酸来衍生自SEQ ID No. 1。

如本申请所理解的“极性氨基酸”或“具有极性侧链的氨基酸”是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和酪氨酸。

如本申请所理解的“非极性氨基酸”“具有极性侧链的氨基酸”是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。

如本申请所理解的具有酸性侧链的氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸。

如本申请所理解的具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

在本发明的一个优选实施方案中，属于由谷氨酸88、赖氨酸89、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、天冬酰胺199、精氨酸203、脯氨酸204和谷氨酰胺209组成的组的极性氨基酸中的至少一个被丙氨酸取代。

如果意欲将萘转化为1-萘酚，则在根据本发明的修饰的P450单加氧酶中，属于由谷氨酸88、天冬酰胺199、精氨酸203和谷氨酰胺209组成的组的极性氨基酸中的至少一个被丙氨酸取代。

如果意欲将7-乙氧基香豆素转化为羟基香豆素，则在根据本发明的修饰的P450单加氧酶中，属于由谷氨酸88、赖氨酸89、亮氨酸101、精氨酸103、天冬酰胺199、精氨酸203、脯氨酸204和谷氨酰胺209组成的组的极性氨基酸中的至少一个被丙氨酸取代。

由于谷氨酸88、天冬酰胺199、精氨酸203和谷氨酰胺209的取代对这两种转化都起到很好的作用，因此在特别优选的修饰的P450单加氧酶中，将至少一个选自该组的氨基酸换成非极性氨基酸。

在根据本发明的特别优选的修饰的单加氧酶中，将上述极性氨基酸中的至少两个换成丙氨酸。优选的组合是谷氨酸88和天冬酰胺199的组合，谷氨酸88和精氨酸203的组合，谷氨酸88和谷氨酰胺209的组合，天冬酰胺199和精氨酸203的组合，天冬酰胺199和谷氨酰胺209的组合或精氨酸203和谷氨酰胺209的组合。

在根据本发明的另一特别优选的修饰的单加氧酶中，将上述极性氨基酸中的至少三个换成非极性氨基酸。优选的组合是谷氨酸88、天冬酰胺199和精氨酸203的组合，天冬酰胺199、精氨酸203和谷氨酰胺209的组合，谷氨酸88、精氨酸203和谷氨酰胺209的组合，或谷氨酸88、天冬酰胺199和谷氨酰胺209的组合。

在根据本发明的另一特别优选的修饰的单加氧酶中，将谷氨酸88、天冬酰胺199、精氨酸203和谷氨酰胺209换成非极性氨基酸。

第209位处的取代

在本发明的一个优选实施方案中，修饰的P450单加氧酶具有在第209位处的丙氨酸。

优选地，另外选自以下的其它氨基酸中的至少一个被丙氨酸取代：亮氨酸87、谷氨酸88、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208和缬氨酸210。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，除了第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代外，第88位处的谷氨酸被选自丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺的氨基酸取代。更优选地，第88位处的谷氨酸被选自丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸取代。通过这些取代，酶对萘以及7-乙氧基香豆素的催化活性增加。最优选地，第88位处的谷氨酸被选自丙氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸取代。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，除了第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代外，SEQ ID NO: 1所定义的P450单加氧酶第199位处的天冬酰胺被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代。优选地，修饰的P450单加氧酶在第199位处带有谷氨酰胺。

在该实施方案中，特别优选除了第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代外，第88位处的谷氨酸和第199位处的天冬酰胺均如上定义那样被取代。

特别优选的修饰的P450单加氧酶带有下列取代：

(i) 第88位处的选自丙氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；

(ii) 第199位处的选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸，优选谷氨酰胺；以及

(iii) 第209位处的丙氨酸。

第88位处的取代

在本发明的一个优选实施方案中，修饰的P450单加氧酶在第88位处具有丙氨酸。

优选地，另外选自以下的其它氨基酸中的至少一个被丙氨酸取代：亮氨酸87、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208、谷氨酰胺209和缬氨酸210。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，除了第88位处的谷氨酸被丙氨酸取代外，SEQ ID NO: 1所定义的P450单加氧酶第199位处的天冬酰胺被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代。优选地，修饰的P450单加氧酶在第199位处带有谷氨酰胺。

术语“与烃的反应性”是指酶将羟基基团引入到选自萘、7-乙氧基香豆素、苊、芴(fluorine)、茚、甲苯、乙苯和间二甲苯的烃化合物中的能力。优选地，本发明的修饰的P450单加氧酶具有提高的对萘和/或7-乙氧基香豆素的羟基化的反应性。

用本发明的P450单加氧酶进行上述底物的反应羟基化可参见如下：

优选地，在含有0.15 g/l待测试的烃的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中测定对芳烃羟基化的反应性。优选地，所述烃取自3 g/l的DMSO储备溶液。在30℃下的优选培养时间是2小时。然后用甲基叔丁基醚萃取产物，并通过HPLC分析，优选使用C18反相柱。酶在上述测定中其比活高于SEQ ID NO. 1所定义的野生型酶的比活方面对所述烃表现出“提高的反应性”。优选地，使用相同浓度的纯化酶测定比活。然而，也可以使用实施例中所述的全细胞测定。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码上文定义的修饰的P450单加氧酶中的任一种的核酸序列。本发明还涉及具有与上述核酸序列互补的序列的核酸序列。

在又一个实施方案中，本发明涉及表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的如上定义的权利要求5的核酸序列。

术语“表达构建体”是本领域技术人员熟知的。“表达构建体”是包含蛋白质编码区和能够转录该蛋白质编码区的调节序列的核酸分子。合适的调节序列取决于意欲用于蛋白质重组表达的宿主细胞。本领域技术人员能够基于其关于所选宿主细胞中转录过程的常识来选择合适的调节区。用于在大肠杆菌(E. coli)中重组表达根据本发明的修饰的P450单加氧酶的优选表达构建体具有SEQ ID NO. 2所定义的核酸序列。

在又一个实施方案中，本发明涉及载体，其包含如上定义的核酸或如上定义的表达构建体。

术语“载体”是本领域技术人员熟知的。它是可以在宿主细胞中复制的核酸序列。因此，它必须包含在所选宿主细胞中成功复制所需的所有遗传元件。本领域技术人员知道对于特定宿主细胞要使用哪些载体。

在又一个实施方案中，本发明涉及包含如上定义的核酸或如上定义的表达构建体或如上定义的载体的微生物。

原则上，可以使用允许转基因重组表达的任何微生物。因此，合适的微生物是对于该微生物已知如上定义的调节元件并且对于该微生物可以构建如上定义的载体的微生物。优选地，该微生物是原核生物，更优选地是细菌。优选的细菌属于红球菌(Rhodococcus)属或埃希氏菌(Escherichia)属。优选的酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。最优选地，该微生物是大肠杆菌、赤红球菌(R. ruber)或巴斯德毕赤酵母。

在又一个实施方案中，本发明涉及用于制备本申请中如上定义的修饰的P450单加氧酶的方法，其包括在适于单加氧酶表达的条件下培养如上定义的重组微生物的步骤。

本领域技术人员知道，不同的微生物对培养基的组成、能量和碳源以及温度和氧供应具有不同的要求。他完全能够基于其对微生物生理学的知识选择合适的条件。如果诱导型启动子用作表达构建体中的调节元件，则本领域技术人员知道诱导翻译所需的条件。

在又一个实施方案中，本发明涉及用于芳烃羟基化的方法，其包括以下步骤

a1) 使根据本发明的修饰的P450单加氧酶中的至少一种与所述芳烃混合并反应，并使所述芳烃由此羟基化；或

a2) 使如上定义的重组微生物中的至少一种与所述芳烃混合并反应。

本领域技术人员能够通过简单的实验找到合适的反应条件。优选的反应温度是30℃。优选的pH是7.4。优选地，反应在钾离子(25 mM)的存在下进行。优选的底物浓度是0.12g/L。如果使用全细菌细胞(实施方案a2)，则OD₆₀₀应当为30。本领域技术人员熟知在一个或多个参数方面偏离上述条件的条件下，酶保留至少一些活性。因此，本发明的方法不限于这些参数，并且上文公开的特定参数仅提供本发明的若干实施方案中的一个。使用本申请中公开的方法，本领域技术人员可以容易地测试在不同反应条件下的酶活性。

如果使用根据a2)的方法，则优选在将微生物与所述芳烃混合之前，在适于表达修饰的P450单加氧酶的条件下培养该微生物。还优选在将微生物与芳烃混合之前，在合适的缓冲液中洗涤该微生物，以限制不期望的副产物的存在。

关于本发明的修饰的P450单加氧酶、本申请中上文进一步给出的合适的烃和宿主细胞的所有定义也适用于该实施方案。

在又一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的修饰的P450单加氧酶用于芳烃羟基化的用途。

上文给出的所有定义也适用于该实施方案。

下面的实施例仅意在举例说明本发明。它们不应以任何方式限制权利要求的范围。

实施例

编码修饰的P450单加氧酶的核酸的构建

使用下列引物合成编码P450蛋白质的全长基因并通过PCR扩增：5-ctgGAATTCATGAGTGCATCAGTTCCGGCGT-3' (SEQ ID NO: 3)和5-catcAAGCTTTCAGAGTCGCAGGGCCA-3' (SEQ ID NO: 4)。引物序列中的EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶位点用下划线标出。PCR产物被EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶分离和消化，克隆到pET28a (+)载体中，并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。随后通过测序确认插入DNA的序列。

如本领域中公知的那样，通过设计合适的引物并进行全质粒PCR来实施诱变。此后，原始质粒被DpnI消化。

修饰的P450单加氧酶的重组表达

在37℃和120 rpm下，使含有表达构建体的大肠杆菌BL21(DE3)在100 mL Luria-Bertani培养基中生长，该培养基补充有50 μg ml⁻¹卡那霉素。用0.25 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达，并将细胞在18℃下培养24小时。通过离心(~10,000 × g)收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并重悬于PBS中。在反应前将细胞终浓度调节至OD₆₀₀ 20。

重组P450单加氧酶的活性评估

通过将来自3 g/L DMSO储备液的0.15 g/L PAH添加到10 mL小瓶中的2 mL工作体积中来引发全细胞反应。2小时后，在剧烈涡旋5分钟后，用2 mL甲基叔丁基醚(MTBE)萃取产物。离心后，将有机相转移到新的玻璃管中并蒸发至干。剩余的残余物用甲醇再溶解。使用Alltech系列1500仪器通过HPLC定量样品，该仪器装备有常用的 C18反相柱，其保持在25℃。对于检测，以1.0 mL min^-1的流量施加50%甲醇作为流动相。通过监测272 nm处的吸光度来检测产物。

表1：修饰的P450单加氧酶及其活性

序列表

<110> Covestro Deutschland AG

<120> 用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的新型单加氧酶

<130> 14213

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 771

<212> PRT

<213> 赤红球菌

<400> 1

Met Ser Ala Ser Val Pro Ala Ser Ala Cys Pro Val Asp His Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Gly Gly Cys Pro Val Ser Thr Asn Ala Ala Ala Phe Asp Pro

20 25 30

Phe Gly Pro Ala Tyr Gln Ala Asp Pro Ala Glu Ser Leu Arg Trp Ser

35 40 45

Arg Asp Glu Glu Pro Val Phe Tyr Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Trp Val

50 55 60

Val Thr Arg Tyr Glu Asp Val Lys Ala Val Phe Arg Asp Asn Leu Val

65 70 75 80

Phe Ser Pro Ala Ile Ala Leu Glu Lys Ile Thr Pro Val Ser Glu Glu

85 90 95

Ala Thr Ala Thr Leu Ala Arg Tyr Asp Tyr Ala Met Ala Arg Thr Leu

100 105 110

Val Asn Glu Asp Glu Pro Ala His Met Pro Arg Arg Arg Ala Leu Met

115 120 125

Asp Pro Phe Thr Pro Lys Glu Leu Ala His His Glu Ala Met Val Arg

130 135 140

Arg Leu Thr Arg Glu Tyr Val Asp Arg Phe Val Glu Ser Gly Lys Ala

145 150 155 160

Asp Leu Val Asp Glu Met Leu Trp Glu Val Pro Leu Thr Val Ala Leu

165 170 175

His Phe Leu Gly Val Pro Glu Glu Asp Met Ala Thr Met Arg Lys Tyr

180 185 190

Ser Ile Ala His Thr Val Asn Thr Trp Gly Arg Pro Ala Pro Glu Glu

195 200 205

Gln Val Ala Val Ala Glu Ala Val Gly Arg Phe Trp Gln Tyr Ala Gly

210 215 220

Thr Val Leu Glu Lys Met Arg Gln Asp Pro Ser Gly His Gly Trp Met

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Ile Arg Met Gln Gln Gln Met Pro Asp Val Val Thr Asp

245 250 255

Ser Tyr Leu His Ser Met Met Met Ala Gly Ile Val Ala Ala His Glu

260 265 270

Thr Thr Ala Asn Ala Ser Ala Asn Ala Phe Lys Leu Leu Leu Glu Asn

275 280 285

Arg Pro Val Trp Glu Glu Ile Cys Ala Asp Pro Ser Leu Ile Pro Asn

290 295 300

Ala Val Glu Glu Cys Leu Arg His Ser Gly Ser Val Ala Ala Trp Arg

305 310 315 320

Arg Val Ala Thr Thr Asp Thr Arg Ile Gly Asp Val Asp Ile Pro Ala

325 330 335

Gly Ala Lys Leu Leu Val Val Asn Ala Ser Ala Asn His Asp Glu Arg

340 345 350

His Phe Asp Arg Pro Asp Glu Phe Asp Ile Arg Arg Pro Asn Ser Ser

355 360 365

Asp His Leu Thr Phe Gly Tyr Gly Ser His Gln Cys Met Gly Lys Asn

370 375 380

Leu Ala Arg Met Glu Met Gln Ile Phe Leu Glu Glu Leu Thr Thr Arg

385 390 395 400

Leu Pro His Met Glu Leu Val Pro Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Leu Pro

405 410 415

Asn Thr Ser Phe Arg Gly Pro Asp His Val Trp Val Gln Trp Asp Pro

420 425 430

Gln Ala Asn Pro Glu Arg Thr Asp Pro Ala Val Leu Gln Arg Gln His

435 440 445

Pro Val Thr Ile Gly Glu Pro Ser Thr Arg Ser Val Ser Arg Thr Val

450 455 460

Thr Val Glu Arg Leu Asp Arg Ile Val Asp Asp Val Leu Arg Val Val

465 470 475 480

Leu Arg Ala Pro Ala Gly Asn Ala Leu Pro Ala Trp Thr Pro Gly Ala

485 490 495

His Ile Asp Val Asp Leu Gly Ala Leu Ser Arg Gln Tyr Ser Leu Cys

500 505 510

Gly Ala Pro Asp Ala Pro Thr Tyr Glu Ile Ala Val Leu Leu Asp Pro

515 520 525

Glu Ser Arg Gly Gly Ser Arg Tyr Val His Glu Gln Leu Arg Val Gly

530 535 540

Gly Ser Leu Arg Ile Arg Gly Pro Arg Asn His Phe Ala Leu Asp Pro

545 550 555 560

Asp Ala Glu His Tyr Val Phe Val Ala Gly Gly Ile Gly Ile Thr Pro

565 570 575

Val Leu Ala Met Ala Asp His Ala Arg Ala Arg Gly Trp Ser Tyr Glu

580 585 590

Leu His Tyr Cys Gly Arg Asn Arg Ser Gly Met Ala Tyr Leu Glu Arg

595 600 605

Val Ala Gly His Gly Asp Arg Ala Ala Leu His Val Ser Ala Glu Gly

610 615 620

Thr Arg Val Asp Leu Ala Ala Leu Leu Ala Thr Pro Val Ser Gly Thr

625 630 635 640

Gln Ile Tyr Ala Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ala Gly Leu Glu Asp

645 650 655

Ala Ser Arg His Trp Pro Asp Gly Ala Leu His Val Glu His Phe Thr

660 665 670

Ser Ser Leu Thr Ala Leu Asp Pro Asp Val Glu His Ala Phe Asp Leu

675 680 685

Asp Leu Arg Asp Ser Gly Leu Thr Val Arg Val Glu Pro Thr Gln Thr

690 695 700

Val Leu Asp Ala Leu Arg Ala Asn Asn Ile Asp Val Pro Ser Asp Cys

705 710 715 720

Glu Glu Gly Leu Cys Gly Ser Cys Glu Val Thr Val Leu Glu Gly Glu

725 730 735

Val Asp His Arg Asp Thr Val Leu Thr Lys Ala Glu Arg Ala Ala Asn

740 745 750

Arg Gln Met Met Thr Cys Cys Ser Arg Ala Cys Gly Asp Arg Leu Thr

755 760 765

Leu Arg Leu

770

<210> 2

<211> 7672

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达构建体

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcat gagtgcatca gttccggcgt cggcgtgtcc cgtcgatcac 5220

gcggccctgg ccggcggctg tccggtgtcg acgaacgccg cggcgttcga tccgttcggg 5280

cccgcgtacc aggccgatcc ggccgagtcg ctgcgctggt cccgcgacga ggagccggtg 5340

ttctacagcc ccgaactcgg ctactgggtg gtcacccgct acgaggatgt gaaggcggtg 5400

ttccgcgaca acctcgtgtt ctcaccggcc atcgccctcg agaagatcac cccggtctcc 5460

gaggaggcca ccgccaccct cgcccgctac gactacgcca tggcccggac cctcgtgaac 5520

gaggacgagc ccgcccacat gccgcgccgc cgcgcactca tggacccgtt caccccgaag 5580

gaactggcgc accacgaggc gatggtgcga cggctcacgc gcgaatacgt cgaccgcttc 5640

gtcgaatccg gcaaggccga cctggtggac gagatgctgt gggaggtacc gctcaccgtc 5700

gccctgcact tcctcggcgt gccggaggag gacatggcga cgatgcgcaa gtactcgatc 5760

gcccacaccg tgaacacctg gggccgcccc gcgcccgagg agcaggtcgc cgtcgccgag 5820

gcggtcggca ggttctggca gtacgcgggc acggtgctcg agaagatgcg ccaggacccc 5880

tcggggcacg gctggatgcc ctacgggatc cgcatgcagc agcagatgcc ggacgtcgtc 5940

accgactcct acctgcactc gatgatgatg gccggcatcg tcgccgcgca cgagaccacg 6000

gccaacgcgt ccgcgaacgc gttcaagctg ctgctcgaga accgcccggt gtgggaggag 6060

atctgcgcgg atccgtcgct gatccccaac gccgtcgagg agtgcctgcg ccactcggga 6120

tcggtcgcgg cgtggcgacg ggtggccacc accgacaccc gcatcggcga cgtcgacatc 6180

cccgccggcg caaagctgct cgtcgtcaac gcctccgcca accatgacga gcggcacttc 6240

gaccgtcccg acgagttcga catccggcgc ccgaactcga gcgaccacct caccttcggg 6300

tacggcagcc atcagtgcat gggcaagaac ctggcccgca tggagatgca gatcttcctc 6360

gaggaactga ccacgcggct tccccacatg gaactcgtac ccgatcagga gttcacctac 6420

ctgccgaaca cctcgttccg cggtcccgat cacgtgtggg tgcagtggga tccgcaggcg 6480

aaccccgagc gcaccgaccc ggccgtgctg caacggcagc atcccgtcac catcggcgag 6540

ccctccaccc ggtcggtgtc acgcaccgtc accgtcgagc gcctggaccg gatcgtcgac 6600

gacgtgctgc gcgtcgtcct acgggctcct gcaggaaatg cgttgcccgc gtggactcct 6660

ggcgcccaca tcgatgtcga cctcggtgcg ctgtcgcggc agtactccct gtgcggtgcg 6720

cccgacgcgc ccacctacga gatcgccgtt ctgctggacc ccgagagccg cggtggctcg 6780

cgctacgtcc acgaacagct ccgggtgggg ggatcgctcc ggattcgcgg gccccggaac 6840

cacttcgcgc tcgaccccga cgccgagcac tacgtgttcg tggccggcgg catcggcatc 6900

acccccgtcc tggccatggc cgaccacgcc cgcgcccggg ggtggagcta cgaactgcac 6960

tactgcggcc ggaaccgttc cgggatggcc tatctcgagc gggtcgccgg gcacggggac 7020

cgcgccgccc tgcacgtctc ggcggaaggc acccgggtcg acctcgccgc cctcctcgcg 7080

acgccggtgt ccggcaccca gatctacgcg tgcgggcccg gacggctgct cgccggactc 7140

gaggacgcga gccggcactg gcccgacggt gcgctgcacg tcgagcactt cacctcgtcc 7200

ctcacggcac tcgacccgga cgtcgagcac gccttcgacc tcgacctgcg cgactcggga 7260

ctcaccgtgc gggtcgagcc cacccagacc gtcctcgacg cgttgcgcgc caacaacatc 7320

gacgtgccca gcgactgcga ggaaggcctc tgcggctcct gcgaggtcac cgtcctcgaa 7380

ggcgaggtcg accaccgcga caccgtgctc accaaggccg agcgggcggc gaaccggcag 7440

atgatgacct gctgctcgcg tgcctgcggc gaccgactga ccctccgact ctgaaagctt 7500

gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga 7560

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 7620

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg at 7672

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 3

ctggaattca tgagtgcatc agttccggcg t 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 4

catcaagctt tcagagtcgc agggcca 27

Claims (18)

1.修饰的P450单加氧酶，其中至少一个选自以下的氨基酸被丙氨酸取代：亮氨酸87、谷氨酸88、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208、谷氨酰胺209和缬氨酸210，其中所述功能性突变导致对芳烃羟基化的反应性提高。

2.根据权利要求1所述的修饰的P450单加氧酶，其中第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代。

3.根据权利要求2所述的修饰的P450单加氧酶，其还包括以下取代中的至少一个

a) 第88位处的谷氨酸被选自丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺的氨基酸取代；和/或

b) 第199位处的天冬酰胺被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代。

4.根据权利要求1所述的修饰的P450单加氧酶，其中第88位处的谷氨酸被丙氨酸取代。

5.根据权利要求4所述的修饰的P450单加氧酶，其还包括以下取代中的至少一个

a) 第199位处的谷氨酸被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代；和/或

b) 第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其在N-末端和/或C-末端具有至多35个氨基酸的添加。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其在N-末端和/或C-末端具有至多35个氨基酸的缺失。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其中对选自萘、7-乙氧基-羟基香豆素、苊、芴、茚、甲苯和乙苯的至少一种烃具有增加的活性。

9.编码根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的P450单加氧酶中的任一种的核酸序列及其互补核酸序列。

10.表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的权利要求9的核酸序列。

11.载体，其包含权利要求9的核酸序列或权利要求10的表达构建体。

12.微生物，其包含权利要求9的核酸或权利要求10的表达构建体或根据权利要求11所述的载体。

13.根据权利要求12所述的微生物，其中所述微生物属于红球菌属或埃希氏菌属。

14.用于制备权利要求1至8中任一项的修饰的p450单加氧酶的方法，其包括在适于单加氧酶表达的条件下培养根据权利要求12或13所述的重组微生物的步骤。

15.用于芳烃羟基化的方法，其包括以下步骤

a1) 使根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的P450单加氧酶中的至少一种与所述芳烃混合并反应，并使所述芳烃由此羟基化；或

a2) 使根据权利要求12或13所述的重组微生物中的至少一种与所述芳烃混合并反应。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述芳烃选自萘、7-乙氧基-羟基香豆素、苊、芴、茚、甲苯、乙苯及其混合物。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中羟基化芳烃选自1-萘酚、7-羟基香豆素、1-苊烯、9-本芴醇、茚醇、苄醇、3-甲基苄醇及其混合物。

18.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的P450单加氧酶用于芳烃羟基化的用途。