CN115216485A - 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用 - Google Patents
耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细菌质粒技术领域，公开了一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB及其应用，耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB包括载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB，耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株；载体片段pET28a(+)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，基因片段rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。本发明利用重组质粒pET28a(+)‑rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择。本发明的质粒可以耐阿米卡星，利于对卡那霉素和氨苄西林耐药、阿米卡星敏感的受体菌株的分子克隆筛选。
Description
技术领域
本发明属于细菌质粒技术领域，尤其涉及一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用。
背景技术
目前，在原核表达系统中，许多使用大肠杆菌启动子系统(如lac、tac、trc)不易表达的基因可以在pET载体系统中稳定克隆和表达。pET载体已成为大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白应用最多且最有效的载体。pET载体中，目的基因被克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。pET28a、pET22a、pET32a通常作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)通常作为工程受体菌。但是为检测目的基因在野生或临床菌株中的基因功能，野生或临床菌株通常作为克隆和蛋白表达的受体菌。这部分菌株，特别是临床菌株对目前pET载体的抗性(如pET28a-卡那霉素、pET22a、pET32a-氨苄西林)表现出耐药，使目前可用的pET载体不能成功地在这部分耐药的临床菌株中作为筛选载体。研究发现这部分临床菌株对卡那霉素、氨苄西林耐药，但是对阿米卡星敏感。因此，耐阿米卡星的pET载体可以成功用于这部分对卡那霉素、氨苄西林耐药的临床菌株并作为筛选载体。
阿米卡星是半合成氨基糖苷类抗生素，旧称丁胺卡那霉素，对多种细菌具有较强的抗菌活性。包括rmtA、rmtB等基因的16S rRNA甲基化酶是由质粒介导的氨基糖苷类耐药决定因子。现有用于原核表达系统的质粒载体pET28a具有卡那霉素抗性，pET22a、pET32a具有氨苄西林抗性，但是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌以上质粒载体皆不适用。
同时，目前还没有具有阿米卡星抗性的质粒载体可用于原核生物的分子克隆。因此，针对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌亟需设计一种新的耐阿米卡星的重组质粒。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)部分临床菌株对pET载体的抗性(如pET28a-卡那霉素、pET22a、pET32a-氨苄西林)表现出耐药，使现有用于原核表达系统的质粒载体pET28a、pET22a、pET32a对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌以上质粒载体皆不适用。
(2)目前还没有具有阿米卡星抗性的质粒载体可用于原核生物分子克隆。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用。
本发明是这样实现的，一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB包括载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB。
进一步，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
进一步，所述载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，所述基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。
进一步，所述载体片段pET28a(+)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述基因片段rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法包括以下步骤：
步骤一，rmtB基因引物设计：根据一株对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物；
步骤二，rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增；
步骤三，pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)质粒4h，得到线性pET28a(+)质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
步骤四，pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16℃条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB。
进一步，所述上下游引物分别带上EcorI和SalI限制性内切酶序列；
其中，所述引物RmtB-UP-EcorI的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，所述引物RmtB-DW-SalI的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB构建得到的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的制备方法，所述重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的制备方法包括以下步骤：
(1)rmtB基因引物设计：根据一株对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物；
(2)rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增；
(3)pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)质粒4h，得到线性pET28a(+)质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
(4)pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16℃条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB；
(5)将步骤(4)中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB通过电穿孔克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。
本发明的另一目的在于提供一种所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB在原核生物的分子克隆中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21在表达rmtB蛋白中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明的质粒可以耐阿米卡星，利于对卡那霉素和氨苄西林耐药、阿米卡星敏感的受体菌株的分子克隆筛选。
本发明公开了一种重组质粒pET28a(+)-rmtB，包含载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB，载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。本发明还公开了一种重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。本发明还公开了重组质粒和重组菌株的制备方法和应用。本发明利用重组质粒pET28a(+)-rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择，特别是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌，因为针对这部分受体菌，常用的pET质粒载体不适用。如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明利用重组质粒pET28a(+)-rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择，特别是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌，因为针对这部分受体菌，常用的pET质粒载体不适用。如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：目前，现有用于原核表达系统的质粒载体pET28a(+)具有卡那霉素抗性，pET22a、pET32a具有氨苄西林抗性，但是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌以上质粒载体皆不适用。
同时，目前还没有具有阿米卡星抗性的质粒载体可用于原核生物的分子克隆。本发明利用重组质粒pET28a(+)-rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择，特别是对卡那霉素、氯霉素、氨苄西林等耐药的受体菌，因为针对这部分受体菌，常用的pET质粒载体不适用。如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：目前，现有用于原核表达系统的质粒载体pET28a(+)具有卡那霉素抗性，pET22a、pET32a具有氨苄西林抗性，但是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌以上质粒载体皆不适用。
同时，目前还没有具有阿米卡星抗性的质粒载体可用于原核生物的分子克隆。因此，针对常用的pET质粒载体不适用的受体菌。如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明的120027:收录编号:120027R1，WGS accession no：JAHESX000000000，BioSample：SAMN19316149；
140032:收录编号：140032R1，WGS accession no：JAMJWA000000000，BioSample：SAMN28537734。
本发明实施例提供的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB包括载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB，该重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO：1：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgaattcctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgaaaacgatttaggagacaccgatgaacatcaacgatgccctcacctccatcctggcctcaaaaaaataccgcgccctttgcccggataccgtgcggcgcatcctgactgaggaatgggggcggcataaatcccccaaacagaccgtagaggctgcacgcacccggctgcatggaatttgcggggcatatgtcaccccggaatcgctcaaggctgctgccgccgcgctttctgcgggcgatgtaaaaaaggcattgtcgctgcatgcctccaccaaggagcgactggccgagctggataccctgtacgattttatcttttcagccgaaactccccgccgcgtgctggatatcgcctgcggtcttaaccccttggcgctatacgagcgcggcattgcatccgtgtggggctgtgatatccaccagggattgggggatgtcatcaccccctttgctagggaaaaagattgggattttacctttgccctgcaggatgtgctgtgtgcgccgcccgccgaagccggcgacctggcgctgatttttaagcttttgcccctgctggagcgggagcaggccggttctgccatggcacttttacaatccctcaataccccgcgcatggctgtcagctttcccacgcgtagtttaggcgggcgtggaaaaggcatggaggcgaactacgccgcatggttcgagggcggcttgcccgccgagtttgagattgaggataaaaagaccatcggaacagaacttatatacttgataaaaaagaatggataagccaatcagaaggcaaatcatcgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat。
本发明实施例提供的载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，所述基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。
其中，载体片段pET28a(+)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2：
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat。
基因片段rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：3：
ctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgaaaacgatttaggagacaccgatgaacatcaacgatgccctcacctccatcctggcctcaaaaaaataccgcgccctttgcccggataccgtgcggcgcatcctgactgaggaatgggggcggcataaatcccccaaacagaccgtagaggctgcacgcacccggctgcatggaatttgcggggcatatgtcaccccggaatcgctcaaggctgctgccgccgcgctttctgcgggcgatgtaaaaaaggcattgtcgctgcatgcctccaccaaggagcgactggccgagctggataccctgtacgattttatcttttcagccgaaactccccgccgcgtgctggatatcgcctgcggtcttaaccccttggcgctatacgagcgcggcattgcatccgtgtggggctgtgatatccaccagggattgggggatgtcatcaccccctttgctagggaaaaagattgggattttacctttgccctgcaggatgtgctgtgtgcgccgcccgccgaagccggcgacctggcgctgatttttaagcttttgcccctgctggagcgggagcaggccggttctgccatggcacttttacaatccctcaataccccgcgcatggctgtcagctttcccacgcgtagtttaggcgggcgtggaaaaggcatggaggcgaactacgccgcatggttcgagggcggcttgcccgccgagtttgagattgaggataaaaagaccatcggaacagaacttatatacttgataaaaaagaatggataagccaatcagaaggcaaatcatc。
作为优选实施例，本发明实施例提供的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法包括以下步骤：
1、rmtB基因引物设计：根据一株对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物。上下游引物分别带上EcorI和SalI限制性内切酶序列。
其中，引物RmtB-UP-EcorI的核苷酸序列为SEQ ID NO：4：
RmtB-UP-EcorI：AAAAAAGAATTCCTAGGTGAAGATCCTTTTTG；
引物RmtB-DW-SalI的核苷酸序列为SEQ ID NO：5：
RmtB-DW-SalI：AAAAAAGTCGACGATGATTTGCCTTCTGATTGG。
2、rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增。
3、pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)质粒4小时，得到线性pET28a(+)质粒。跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用。
4、pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16度条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB。
作为优选实施例，本发明实施例提供的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的制备方法包括以下步骤：
1、rmtB基因引物设计：根据一株对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物。上下游引物分别带上EcorI和SalI限制性内切酶序列。
RmtB-UP-EcorI：AAAAAAGAATTCCTAGGTGAAGATCCTTTTTG；
RmtB-DW-SalI：AAAAAAGTCGACGATGATTTGCCTTCTGATTGG。
2、rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增。
3、pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)质粒4小时，得到线性pET28a(+)质粒。跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用。
4、pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16度条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB。
5、将步骤4中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB通过电穿孔克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
本发明公开了一种重组质粒pET28a(+)-rmtB，包含载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB，载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，基因片段rmtB来自一株对阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。本发明还公开了一种重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。本发明还公开了重组质粒和重组菌株的制备方法和应用。本发明利用重组质粒pET28a(+)-rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择，特别是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌常用的质粒载体不适用，如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
本发明的质粒可以耐阿米卡星，利于对卡那霉素和氨苄西林耐药、阿米卡星敏感的受体菌株的分子克隆筛选。
本发明实施例提供的载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，所述基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。质粒图谱如图1所示。
本发明利用重组质粒pET28a(+)-rmtB，为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择，特别是对卡那霉素、氨苄西林等耐药的受体菌常用的质粒载体不适用，如果对阿米卡星敏感，则可以选择pET28a(+)-rmtB载体进行分子克隆。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明人在对肠杆菌属细菌对多粘菌素的异质性耐药机制分析中，通过WGS数据与参考基因组进行比对，发现阴沟肠杆菌120027_1B、120027_2B、120027_4B、120027_5B、120027_6B菌株中发生phoQ基因的SNP错义突变，120027_3B发生phoP基因的SNP错义突变。phoPQ基因被报道与多粘菌素耐药相关。phoQ基因编码的PhoQ蛋白具有组氨酸激酶活性，通过磷酸化活化PhoP。PhoPQ可通过调节arnBCADTEF操纵子来控制脂多糖(LPS)修饰，以合成4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)和磷酸乙醇胺(pEtN)并将其添加到脂多糖(LPS)的脂质A上。
为分析以上SNP突变是否导致多粘菌素耐药，因为120027对卡那霉素、氨苄西林耐药，对阿米卡星敏感，可使用耐阿米卡星的pET28a(+)-rmtB质粒作为筛选载体。因此，本发明针对以上SNP突变使用耐阿米卡星的pET28a(+)-rmtB载体进行了克隆验证，将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株120027_A中，原始菌株120027_A对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实这些SNP突变可介导120027_B对多粘菌素耐药。从而成功解释了异质性耐药细菌120027表现出异质性耐药的耐药机制。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
1、设计引物：根据120027_1B、120027_2B、120027_3B、120027_4B、120027_5B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物。上下游引物分别带上NotI和XhoI限制性内切酶序列。
PhoPQ_NotI_Up：AAAAAAGCGGCCGCccaggctcaggtcaacatact；
PhoPQ_XhoI_Dw：AAAAAACTCGAGattccgcaggctcttactga。
2、目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增。分别得到120027_1B_phoPQG1375T、120027_2B_phoPQT749A、120027_3B_phoPQC58A、120027_4B_phoPQG1175A、120027_5B_phoPQG1154A、120027_6B_phoPQG881A。
3、pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4小时，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒。跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用。
4、pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16度条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A、pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A。
5、将步骤4中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到受体菌株阴沟肠杆菌120027_A中，分别得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A。
6、多粘菌素MIC：对以上通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测其多粘菌素E的MIC，结果如下：120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实这些SNP突变可介导120027_1B、120027_2B、120027_3B、120027_5B对多粘菌素耐药。从而成功解释了异质性耐药细菌120027表现出异质性耐药的耐药机制。
但是120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A对多粘菌素的MIC值只上升2倍，考虑到120027_A菌株本身含有未突变的phoPQ基因对重组菌组的影响，本发明人首先通过Crispr-Cas9系统对120027_A菌株敲除phoPQ基因，得到120027_A_ΔphoPQ敲除菌株。然后再按1-5的方法将120027_4B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因成功克隆进pET28a(+)-rmtB载体，并通过电穿孔转化至120027_A_ΔphoPQ受体菌，分别得到120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A重组菌株，在对其检测多粘菌素E的MIC，发现其对多粘菌素的MIC值上升4倍(MIC从1mg/L升高至4mg/L)，证实120027_4B、120027_6B的phoPQ基因的SNP突变的可介导120027_4B、120027_6B对多粘菌素耐药(见表1)。
表1菌株及其对应的多粘菌素E_MIC
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 王成成
<120> 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6241
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160
ggtcgcggat ccgaattcct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 5220
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgaa aacgatttag gagacaccga 5280
tgaacatcaa cgatgccctc acctccatcc tggcctcaaa aaaataccgc gccctttgcc 5340
cggataccgt gcggcgcatc ctgactgagg aatgggggcg gcataaatcc cccaaacaga 5400
ccgtagaggc tgcacgcacc cggctgcatg gaatttgcgg ggcatatgtc accccggaat 5460
cgctcaaggc tgctgccgcc gcgctttctg cgggcgatgt aaaaaaggca ttgtcgctgc 5520
atgcctccac caaggagcga ctggccgagc tggataccct gtacgatttt atcttttcag 5580
ccgaaactcc ccgccgcgtg ctggatatcg cctgcggtct taaccccttg gcgctatacg 5640
agcgcggcat tgcatccgtg tggggctgtg atatccacca gggattgggg gatgtcatca 5700
ccccctttgc tagggaaaaa gattgggatt ttacctttgc cctgcaggat gtgctgtgtg 5760
cgccgcccgc cgaagccggc gacctggcgc tgatttttaa gcttttgccc ctgctggagc 5820
gggagcaggc cggttctgcc atggcacttt tacaatccct caataccccg cgcatggctg 5880
tcagctttcc cacgcgtagt ttaggcgggc gtggaaaagg catggaggcg aactacgccg 5940
catggttcga gggcggcttg cccgccgagt ttgagattga ggataaaaag accatcggaa 6000
cagaacttat atacttgata aaaaagaatg gataagccaa tcagaaggca aatcatcgtc 6060
gacaagcttg cggccgcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac 6120
aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc 6180
cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga 6240
t 6241
<210> 2
<211> 5369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
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agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
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cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
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ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
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tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160
ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca 5220
ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 5280
caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 5340
tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5369
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 60
ccactgagcg tcagaccccg aaaacgattt aggagacacc gatgaacatc aacgatgccc 120
tcacctccat cctggcctca aaaaaatacc gcgccctttg cccggatacc gtgcggcgca 180
tcctgactga ggaatggggg cggcataaat cccccaaaca gaccgtagag gctgcacgca 240
cccggctgca tggaatttgc ggggcatatg tcaccccgga atcgctcaag gctgctgccg 300
ccgcgctttc tgcgggcgat gtaaaaaagg cattgtcgct gcatgcctcc accaaggagc 360
gactggccga gctggatacc ctgtacgatt ttatcttttc agccgaaact ccccgccgcg 420
tgctggatat cgcctgcggt cttaacccct tggcgctata cgagcgcggc attgcatccg 480
tgtggggctg tgatatccac cagggattgg gggatgtcat cacccccttt gctagggaaa 540
aagattggga ttttaccttt gccctgcagg atgtgctgtg tgcgccgccc gccgaagccg 600
gcgacctggc gctgattttt aagcttttgc ccctgctgga gcgggagcag gccggttctg 660
ccatggcact tttacaatcc ctcaataccc cgcgcatggc tgtcagcttt cccacgcgta 720
gtttaggcgg gcgtggaaaa ggcatggagg cgaactacgc cgcatggttc gagggcggct 780
tgcccgccga gtttgagatt gaggataaaa agaccatcgg aacagaactt atatacttga 840
taaaaaagaa tggataagcc aatcagaagg caaatcatc 879
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaagaat tcctaggtga agatcctttt tg 32
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaaagtcg acgatgattt gccttctgat tgg 33
Claims (10)
1.一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB，其特征在于，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB包括载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB。
2.如权利要求1所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB，其特征在于，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
3.如权利要求1所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB，其特征在于，所述载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+)，所述基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株。
4.如权利要求1所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB，其特征在于，所述载体片段pET28a(+)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述基因片段rmtB的核苷酸序列为SEQ IDNO：3。
5.一种实施如权利要求1～4任意一项所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法，其特征在于，所述耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法包括以下步骤：
步骤一，rmtB基因引物设计：根据对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物；
步骤二，rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增；
步骤三，pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)质粒4h，得到线性pET28a(+)质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
步骤四，pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16℃条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB。
6.如权利要求5所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB的构建方法，其特征在于，所述上下游引物分别带上EcorI和SalI限制性内切酶序列；
其中，所述引物RmtB-UP-EcorI的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，所述引物RmtB-DW-Sal I的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
7.一种实施如权利要求1～4任意一项所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB构建得到的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。
8.一种实施如权利要求7所述的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的制备方法，其特征在于，所述重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)的制备方法包括以下步骤：
(1)rmtB基因引物设计：根据对阿米卡星耐药、经二代测序获得全基因组序列、包含rmtB基因的大肠杆菌菌株140032的rmtB基因序列用primer3在线网站设计针对rmtB基因的上下游引物；
(2)rmtB基因PCR扩增：使用rmtB基因的上下游引物通过PCR仪针对rmtB基因进行PCR扩增；
(3)pET28a(+)质粒双酶切和胶回收纯化：使用EcorI和SalI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)质粒4h，得到线性pET28a(+)质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
(4)pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB连接：使用T7连接酶将pET28a(+)线性质粒和目的基因rmtB在16℃条件下过夜连接，得到重组质粒pET28a(+)-rmtB；
(5)将步骤(4)中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB通过电穿孔克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)。
9.一种如权利要求1～4任意一项所述的耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB在原核生物的分子克隆中的应用。
10.一种如权利要求7所述的重组菌株pET28a(+)-rmtB/BL21(DE3)在表达rmtB蛋白中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210618462.4A CN115216485A (zh) | 2022-06-01 | 2022-06-01 | 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用 |
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| CN202210618462.4A CN115216485A (zh) | 2022-06-01 | 2022-06-01 | 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116497039A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-07-28 | 四川大学华西医院 | 一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法 |
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| CN105039357A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-11-11 | 王冬国 | 携带qepA3新基因的质粒片段 |
| CN109913399A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-21 | 贵州省水产研究所 | 一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用 |
-
2022
- 2022-06-01 CN CN202210618462.4A patent/CN115216485A/zh active Pending
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