CN116497039B - 一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，公开了一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法，phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A五种突变中的一种；phoQ基因突变体的核苷酸序列为SEQIDNO：1～5。本发明将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升4～8倍，证实了SNP突变可介导多粘菌素耐药；通过检测phoQ突变基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，尤其涉及一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法。
背景技术
目前，多粘菌素(polymyxin)是从多粘杆菌培养液中获得的一种多肽类抗生素，包括5种不同的类型(多粘菌素A，B，C，D和E)，目前仅多粘菌素B(polyB)和多粘菌素E(polyE)用于临床。多粘菌素带有5个游离氨基，在生理pH下呈正电荷，能够与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖(LPS)的带负电荷的磷酸根产生静电吸引，导致Ca2+，Mg2+离子不能在LPS表面稳定存在，致使细菌外膜结构混乱，渗透性增加；然后多粘菌素进入细菌外膜，损伤细胞质膜，导致内含物外泄，使细菌死亡。且多粘菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效，与其他抗生素之间交叉耐药较少。20世纪40年代得到认可，20世纪50年代后期应用于临床。但在20世纪70年代时，由于它们潜在的肾毒性和神经毒性以及其他毒性较低的抗生素的出现，使得多粘菌素的使用频率降低。近些年，多粘菌素在其他药物治疗无效的革兰氏阴性杆菌感染如多重耐药细菌(MDR)和泛耐药细菌(XDR)的挽救性治疗方案中扮演着重要的角色。
phoQ基因编码的PhoQ蛋白具有组氨酸激酶活性，通过磷酸化活化PhoP，PhoPQ通过调节arnBCADTEF操纵子来控制脂多糖(LPS)修饰，以合成4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)和磷酸乙醇胺(pEtN)并将其添加到脂多糖(LPS)的脂质A上。这种修饰增加了多粘菌素初始靶标LPS的电荷，因此降低了与多粘菌素的结合，导致这些菌株对多粘菌素的耐药。
PhoPQ双组分调控系统可通过脂多糖修饰途径介导多粘菌素耐药。目前已报道phoQ基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoQ基因的c.1375G>T、c.749T>A、c.1154G>A、c.1175G>A、c.881G>A这5个突变位点。本发明针对以上SNP突变进行了克隆验证，将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实了这些SNP突变可介导多粘菌素耐药。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前已报道phoQ基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoQ基因的c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A这5个突变位点。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法。
本发明是这样实现的，一类phoQ基因突变体，所述phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A五种突变中的一种。
进一步，所述phoQ基因突变体的突变基因120027_1B_phoPQG1375T的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，突变基因120027_2B_phoPQT749A的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，突变基因120027_4B_phoPQG1175A的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，突变基因120027_5B_phoPQG1154A的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，突变基因120027_6B_phoPQG881A的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
本发明的另一目的在于提供一种所述的phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒中的应用。
进一步，所述用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒通过检测所述phoQ基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述phoQ基因突变体的phoQ基因突变体的验证方法，所述phoQ基因突变体的验证方法包括以下步骤：
步骤一，设计引物：根据多粘菌素耐药突变株120027_1B、120027_2B、120027_4B、120027_5B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物；
步骤二，目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_1B_phoPQG1375T、120027_2B_phoPQT749A、120027_4B_phoPQG1175A、120027_5B_phoPQG1154A、120027_6B_phoPQG881A；
步骤三，pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4h，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
步骤四，pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16℃条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A；
步骤五，将步骤四中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到对多粘菌素E敏感的受体菌株120027_A中，分别得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A；
步骤六，多粘菌素MIC：对通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测多粘菌素E的MIC；另外，通过Crispr-Cas9系统对120027_A菌株敲除phoPQ基因，得到120027_A_ΔphoPQ敲除菌株，再将120027_4B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因成功克隆进pET28a(+)-rmtB载体，并通过电穿孔转化至120027_A_ΔphoPQ受体菌，分别得到120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A重组菌株，检测多粘菌素E的MIC。
进一步，所述步骤一中的上下游引物分别带上NotI和XhoI限制性内切酶序列；其中，所述上游引物PhoPQ_NotI_Up的核苷酸序列为SEQ ID NO：6，下游引物PhoPQ_XhoI_Dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：7。
进一步，所述phoQ基因突变体的验证方法还包括：经过克隆验证，所述phoQ基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值从1mg/L升高至4～8mg/L。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述phoQ基因突变体的基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法，所述基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法包括：
(1)对120027菌株的phoQ基因突变位点的两端分别在primer3网站设计引物；
(2)进行高保真PCR产物扩增，最终扩增得到PCR产物；
(3)将包含120027菌株的phoQ基因突变位点的PCR产物进行Sanger一代测序；
(4)将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
进一步，所述步骤(1)中，phoQ基因测序引物120027_1B_phoQ_up的核苷酸序列为SEQ ID NO：8，引物120027_1B_phoQ_dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，引物120027_2B_phoQ_up的核苷酸序列为SEQ ID NO：10，引物120027_2B_phoQ_dw的核苷酸序列为SEQ IDNO：11，引物120027_4B_phoQ_up的核苷酸序列为SEQ ID NO：12，引物120027_4B_phoQ_dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：13，引物120027_5B_phoQ_up的核苷酸序列为SEQ ID NO：14，引物120027_5B_phoQ_dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：15，引物120027_6B_phoQ_up的核苷酸序列为SEQ ID NO：16，引物120027_6B_phoQ_dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：17。
所述步骤(2)中，引物120027_1B_phoQ最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ ID NO：18，引物120027_2B_phoQ最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ ID NO：19，引物120027_4B_phoQ最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ ID NO：20，引物120027_5B_phoQ最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ ID NO：21，引物120027_6B_phoQ最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ IDNO：22。
进一步，所述步骤(2)中的高保真PCR产物扩增包括：
PCR反应体系为25μL，包括高保真PCR聚合酶12.5μL，ddH2O 8.5μL，引物_up 1μL，引物_dw 1μL，DNA模板2μL。
所述PCR反应条件包括：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，变性-退火-延伸共30个循环，再延伸72℃5min。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明公开了基因突变体及其应用。其中，该基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A五种突变中的一种。经过克隆验证这些突变体可以导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)。因此，本发明通过检测这些突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明通过检测phoQ突变基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
第三，本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：目前，已报道phoQ基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoQ基因的c.1375G>T、c.749T>A、c.1154G>A、c.1175G>A、c.881G>A这5个突变位点。本发明针对以上SNP突变进行了克隆验证，将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实了这些SNP突变可介导多粘菌素耐药。通过检测phoQ突变基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一类phoQ基因突变体、应用及其验证方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的phoQ基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A五种突变中的一种。其中，本发明实施例提供的5个phoQ突变基因序列如下：
SEQ ID NO：1：>120027_1B_phoPQG1375T
atgaaagggatattgcgccacattttacccctttcgctgcgggttcgctttttgctggcaaccgccgccgtcgtgctggtgctgtcgctctcttacgggatggtggcgttggtcggttatagcgtgagcttcgataaaaccaccttccgcctgcttcgcggcgaaagtaacctgttttataccctggcgaagtgggagaacaaccgaatcaccgtcgagatgccggaaaacctgaatcagcagagcccgacgctggcgctgatctatgatgaaaaagggaaattgctgtgggcccagcgcgatgtcccgtggttgaaaaagcgcatccgtccggaatggctgaaaaccaacggttttcatgaaatagaagccgacctcaactccaccagcagcctgctgcgtgacgatcgcgccttacagatcaagcttaatgagatccgtgccgaagatgacgacacggagatgacccactctgtggccatcaacctttaccccgccaccctgaacatgccgcagttaaccattgtggtgatcgataccataccggttgagctgaaacgctcgtatatggtctggaactggtttgtgtatgttctggctgccaacctgctgctggtgatccctctcctgtgggttgctgcgtggtggagcctccgcccgattgaatcccttgccaaagaggtgcgcgagctggaggaacatcaccgcgagaagctaaacccggagaccacgcgtgagctgaccagcctggtgcgcaacctcaaccgcctgctgaaaagcgaacgtgaacgctacgacaagtatcgcacgacgctcaccgaccttacgcacagcctgaaaaccccgctggccgtgatgcagagtaccctgcgttccatgcgcagttcgaaaatgagcgtggatgacgccgagccggtgatgctggaacaaatcagccgtatttcacagcagatcggctattacctgcaccgcgcgagcatgcgttccggaagcgctctgttgagccgtgaactgcacccggtagccccgctgctggataacctcacctctgcgctgaacaaggtgtaccagcgtaaaggggtcaacatcagtctggatatctcaccggaaattagctttgtcggtgagaaaaatgactttatggaagtgatgggaaacctgctcgataacgcctgcaaatattgtctggagtttgtcgaggtgtccgcgcgggtaacggataacgaactgcatattatcgttgaggatgatggtcctggcattccccgtaataaacgcgaagtggtgttcgatcgcggccagcgcgccgatacgctgcggccaggccagggcgtcggattatccgtcgccagggaaatcgtcgatcagtacgagtgcaagattgaaaccggtgaaagtttgctgggcggtgcccgtatggaagtcatttttggccgccagcatcccgtatcgaacgatagttga
SEQ ID NO：2：>120027_2B_phoPQT749A
atgaaagggatattgcgccacattttacccctttcgctgcgggttcgctttttgctggcaaccgccgccgtcgtgctggtgctgtcgctctcttacgggatggtggcgttggtcggttatagcgtgagcttcgataaaaccaccttccgcctgcttcgcggcgaaagtaacctgttttataccctggcgaagtgggagaacaaccgaatcaccgtcgagatgccggaaaacctgaatcagcagagcccgacgctggcgctgatctatgatgaaaaagggaaattgctgtgggcccagcgcgatgtcccgtggttgaaaaagcgcatccgtccggaatggctgaaaaccaacggttttcatgaaatagaagccgacctcaactccaccagcagcctgctgcgtgacgatcgcgccttacagatcaagcttaatgagatccgtgccgaagatgacgacacggagatgacccactctgtggccatcaacctttaccccgccaccctgaacatgccgcagttaaccattgtggtgatcgataccataccggttgagctgaaacgctcgtatatggtctggaactggtttgtgtatgttctggctgccaacctgctgctggtgatccctctcctgtgggttgctgcgtggtggagcctccgcccgattgaatcccttgccaaagaggtgcgcgagctggaggaacatcaccgcgagaagctaaacccggagaccacgcgtgagctgaccagccaggtgcgcaacctcaaccgcctgctgaaaagcgaacgtgaacgctacgacaagtatcgcacgacgctcaccgaccttacgcacagcctgaaaaccccgctggccgtgatgcagagtaccctgcgttccatgcgcagttcgaaaatgagcgtggatgacgccgagccggtgatgctggaacaaatcagccgtatttcacagcagatcggctattacctgcaccgcgcgagcatgcgttccggaagcgctctgttgagccgtgaactgcacccggtagccccgctgctggataacctcacctctgcgctgaacaaggtgtaccagcgtaaaggggtcaacatcagtctggatatctcaccggaaattagctttgtcggtgagaaaaatgactttatggaagtgatgggaaacctgctcgataacgcctgcaaatattgtctggagtttgtcgaggtgtccgcgcgggtaacggataacgaactgcatattatcgttgaggatgatggtcctggcattccccgtaataaacgcgaagtggtgttcgatcgcggccagcgcgccgatacgctgcggccaggccagggcgtcggattatccgtcgccagggaaatcgtcgatcagtacgagggcaagattgaaaccggtgaaagtttgctgggcggtgcccgtatggaagtcatttttggccgccagcatcccgtatcgaacgatagttga
SEQ ID NO：3：>120027_4B_phoPQG1175A
atgaaagggatattgcgccacattttacccctttcgctgcgggttcgctttttgctggcaaccgccgccgtcgtgctggtgctgtcgctctcttacgggatggtggcgttggtcggttatagcgtgagcttcgataaaaccaccttccgcctgcttcgcggcgaaagtaacctgttttataccctggcgaagtgggagaacaaccgaatcaccgtcgagatgccggaaaacctgaatcagcagagcccgacgctggcgctgatctatgatgaaaaagggaaattgctgtgggcccagcgcgatgtcccgtggttgaaaaagcgcatccgtccggaatggctgaaaaccaacggttttcatgaaatagaagccgacctcaactccaccagcagcctgctgcgtgacgatcgcgccttacagatcaagcttaatgagatccgtgccgaagatgacgacacggagatgacccactctgtggccatcaacctttaccccgccaccctgaacatgccgcagttaaccattgtggtgatcgataccataccggttgagctgaaacgctcgtatatggtctggaactggtttgtgtatgttctggctgccaacctgctgctggtgatccctctcctgtgggttgctgcgtggtggagcctccgcccgattgaatcccttgccaaagaggtgcgcgagctggaggaacatcaccgcgagaagctaaacccggagaccacgcgtgagctgaccagcctggtgcgcaacctcaaccgcctgctgaaaagcgaacgtgaacgctacgacaagtatcgcacgacgctcaccgaccttacgcacagcctgaaaaccccgctggccgtgatgcagagtaccctgcgttccatgcgcagttcgaaaatgagcgtggatgacgccgagccggtgatgctggaacaaatcagccgtatttcacagcagatcggctattacctgcaccgcgcgagcatgcgttccggaagcgctctgttgagccgtgaactgcacccggtagccccgctgctggataacctcacctctgcgctgaacaaggtgtaccagcgtaaaggggtcaacatcagtctggatatctcaccggaaattagctttgtcggtgagaaaaatgactttatggaagtgatgggaaacctgctcgataacgcctacaaatattgtctggagtttgtcgaggtgtccgcgcgggtaacggataacgaactgcatattatcgttgaggatgatggtcctggcattccccgtaataaacgcgaagtggtgttcgatcgcggccagcgcgccgatacgctgcggccaggccagggcgtcggattatccgtcgccagggaaatcgtcgatcagtacgagggcaagattgaaaccggtgaaagtttgctgggcggtgcccgtatggaagtcatttttggccgccagcatcccgtatcgaacgatagttga
SEQ ID NO：4：>120027_5B_phoPQG1154A
atgaaagggatattgcgccacattttacccctttcgctgcgggttcgctttttgctggcaaccgccgccgtcgtgctggtgctgtcgctctcttacgggatggtggcgttggtcggttatagcgtgagcttcgataaaaccaccttccgcctgcttcgcggcgaaagtaacctgttttataccctggcgaagtgggagaacaaccgaatcaccgtcgagatgccggaaaacctgaatcagcagagcccgacgctggcgctgatctatgatgaaaaagggaaattgctgtgggcccagcgcgatgtcccgtggttgaaaaagcgcatccgtccggaatggctgaaaaccaacggttttcatgaaatagaagccgacctcaactccaccagcagcctgctgcgtgacgatcgcgccttacagatcaagcttaatgagatccgtgccgaagatgacgacacggagatgacccactctgtggccatcaacctttaccccgccaccctgaacatgccgcagttaaccattgtggtgatcgataccataccggttgagctgaaacgctcgtatatggtctggaactggtttgtgtatgttctggctgccaacctgctgctggtgatccctctcctgtgggttgctgcgtggtggagcctccgcccgattgaatcccttgccaaagaggtgcgcgagctggaggaacatcaccgcgagaagctaaacccggagaccacgcgtgagctgaccagcctggtgcgcaacctcaaccgcctgctgaaaagcgaacgtgaacgctacgacaagtatcgcacgacgctcaccgaccttacgcacagcctgaaaaccccgctggccgtgatgcagagtaccctgcgttccatgcgcagttcgaaaatgagcgtggatgacgccgagccggtgatgctggaacaaatcagccgtatttcacagcagatcggctattacctgcaccgcgcgagcatgcgttccggaagcgctctgttgagccgtgaactgcacccggtagccccgctgctggataacctcacctctgcgctgaacaaggtgtaccagcgtaaaggggtcaacatcagtctggatatctcaccggaaattagctttgtcggtgagaaaaatgactttatggaagtgatggaaaacctgctcgataacgcctgcaaatattgtctggagtttgtcgaggtgtccgcgcgggtaacggataacgaactgcatattatcgttgaggatgatggtcctggcattccccgtaataaacgcgaagtggtgttcgatcgcggccagcgcgccgatacgctgcggccaggccagggcgtcggattatccgtcgccagggaaatcgtcgatcagtacgagggcaagattgaaaccggtgaaagtttgctgggcggtgcccgtatggaagtcatttttggccgccagcatcccgtatcgaacgatagttga
SEQ ID NO：5：>120027_6B_phoPQG881A
atgaaagggatattgcgccacattttacccctttcgctgcgggttcgctttttgctggcaaccgccgccgtcgtgctggtgctgtcgctctcttacgggatggtggcgttggtcggttatagcgtgagcttcgataaaaccaccttccgcctgcttcgcggcgaaagtaacctgttttataccctggcgaagtgggagaacaaccgaatcaccgtcgagatgccggaaaacctgaatcagcagagcccgacgctggcgctgatctatgatgaaaaagggaaattgctgtgggcccagcgcgatgtcccgtggttgaaaaagcgcatccgtccggaatggctgaaaaccaacggttttcatgaaatagaagccgacctcaactccaccagcagcctgctgcgtgacgatcgcgccttacagatcaagcttaatgagatccgtgccgaagatgacgacacggagatgacccactctgtggccatcaacctttaccccgccaccctgaacatgccgcagttaaccattgtggtgatcgataccataccggttgagctgaaacgctcgtatatggtctggaactggtttgtgtatgttctggctgccaacctgctgctggtgatccctctcctgtgggttgctgcgtggtggagcctccgcccgattgaatcccttgccaaagaggtgcgcgagctggaggaacatcaccgcgagaagctaaacccggagaccacgcgtgagctgaccagcctggtgcgcaacctcaaccgcctgctgaaaagcgaacgtgaacgctacgacaagtatcgcacgacgctcaccgaccttacgcacagcctgaaaaccccgctggccgtgatgcagagtaccctgcgttccatgcacagttcgaaaatgagcgtggatgacgccgagccggtgatgctggaacaaatcagccgtatttcacagcagatcggctattacctgcaccgcgcgagcatgcgttccggaagcgctctgttgagccgtgaactgcacccggtagccccgctgctggataacctcacctctgcgctgaacaaggtgtaccagcgtaaaggggtcaacatcagtctggatatctcaccggaaattagctttgtcggtgagaaaaatgactttatggaagtgatgggaaacctgctcgataacgcctgcaaatattgtctggagtttgtcgaggtgtccgcgcgggtaacggataacgaactgcatattatcgttgaggatgatggtcctggcattccccgtaataaacgcgaagtggtgttcgatcgcggccagcgcgccgatacgctgcggccaggccagggcgtcggattatccgtcgccagggaaatcgtcgatcagtacgagggcaagattgaaaccggtgaaagtttgctgggcggtgcccgtatggaagtcatttttggccgccagcatcccgtatcgaacgatagttga
本发明实施例提供的菌种属于现有，来源于本实验室，已上传NCBI：
本发明涉及1株细菌120027：收录编号：120027R1；
WGS accession no：JAHESX000000000；
BioSample：SAMN19316149。
本发明实施例提供的phoQ基因突变体的验证方法包括以下步骤：
(1)设计引物：根据120027_1B、120027_2B、120027_4B、120027_5B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物；
(2)目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_1B_phoPQG1375T、120027_2B_phoPQT749A、120027_4B_phoPQG1175A、120027_5B_phoPQG1154A、120027_6B_phoPQG881A；
(3)pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4小时，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
(4)pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16度条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A；
(5)将步骤(4)中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到受体菌株阴沟肠杆菌120027_A中，分别得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A；
(6)多粘菌素MIC：对通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测多粘菌素E的MIC；通过Crispr-Cas9系统对120027_A菌株敲除phoPQ基因，得到120027_A_ΔphoPQ敲除菌株，再将120027_4B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因成功克隆进pET28a(+)-rmtB载体，并通过电穿孔转化至120027_A_ΔphoPQ受体菌，分别得到120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A重组菌株，检测多粘菌素E的MIC。
如图1所示，本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法包括以下步骤：
S101，对120027菌株的phoQ基因突变位点的两端分别在primer3网站设计引物；
S102，进行高保真PCR产物扩增，最终扩增得到PCR产物；
S103，将包含120027菌株的phoQ基因突变位点PCR产物进行Sanger一代测序；
S104，将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
本发明实施例提供的phoQ基因突变体的验证方法还包括：经过克隆验证，所述phoQ基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值上升4～8倍。
本发明实施例提供的phoQ基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值从1mg/L升高至4～8mg/L。
本发明实施例提供了一种phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的试剂盒中的应用。
本发明实施例通过检测phoQ基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用的应用实施例。
本发明的应用实施例提供了基因突变体及其应用；其中，该基因突变体与野生型phoQ基因相比，分别具有以下c.1375G>T、c.749T>A、c.1175G>A、c.1154G>A、c.881G>A五种突变中的一种。经过克隆验证这些突变体可以导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)。因此，本发明通过检测这些突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
实施例1
本发明实施例提供的phoQ基因突变体的验证方法包括以下步骤：
1、设计引物：根据120027_1B、120027_2B、120027_4B、120027_5B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物。上下游引物分别带上NotI和XhoI限制性内切酶序列。
SEQ ID NO：6：PhoPQ_NotI_Up：aaaaaagcggccgcccaggctcaggtcaacatact；
SEQ ID NO：7：PhoPQ_XhoI_Dw：aaaaaactcgagattccgcaggctcttactga。
2、目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增。分别得到120027_1B_phoPQG1375T、120027_2B_phoPQT749A、120027_4B_phoPQG1175A、120027_5B_phoPQG1154A、120027_6B_phoPQG881A。
3、pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4小时，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒。跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用。
4、pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16度条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A。
5、将步骤4中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到受体菌株阴沟肠杆菌120027_A中，分别得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A。
6、多粘菌素MIC：对以上通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测其多粘菌素E的MIC，结果如下：120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_1B_phoPQG1375T、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_2B_phoPQT749A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_5B_phoPQG1154A对多粘菌素的MIC值上升4～8倍(MIC从1mg/L升高至4～8mg/L)，证实这些SNP突变可介导120027_1B、120027_2B、120027_5B对多粘菌素耐药。但是120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A对多粘菌素的MIC值只上升2倍，考虑到120027_A菌株本身含有未突变的phoPQ基因对重组菌组的影响，本发明人首先通过Crispr-Cas9系统对120027_A菌株敲除phoPQ基因，得到120027_A_ΔphoPQ敲除菌株。然后再按步骤1～5的方法将120027_4B、120027_6B含有SNP突变的phoPQ基因成功克隆进pET28a(+)-rmtB载体，并通过电穿孔转化至120027_A_ΔphoPQ受体菌，分别得到120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_4B_phoPQG1175A、120027_A_ΔphoPQ::pET28a(+)-rmtB_120027_6B_phoPQG881A重组菌株，在对其检测多粘菌素E的MIC，发现其对多粘菌素的MIC值上升4倍(MIC从1mg/L升高至4mg/L)，证实120027_4B、120027_6B的phoPQ基因的SNP突变的可介导120027_4B、120027_6B对多粘菌素耐药(见表1)。
表1菌株及其对应的多粘菌素E_MIC
实施例2
本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoQ突变基因检测方法包括：
(1)对120027菌株的phoQ基因突变位点的两端设计引物；
本发明针对120027菌株的phoQ基因的不同突变位点两端分别在primer3网站上设计以下引物：引物设计具体步骤如下：
1)打开“Primer3 Input 0.4.0”站点(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。
2)粘贴模板序列。在“Paste source sequence below(5'->3'…”下面的大空框里粘贴模板序列。
3)重要参数设定。设置“Product Size Ranges”为250～300，其他均为默认值。
4)点击Pickprimers，得到符合大小预期的primer。
5)引物设计检验：使用OligoCalc在线网站(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)检验引物的GC含量、TM值、发夹结构等；择优选取合适引物。
PCR引物：由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，具体序列见表2；
表2 phoQ基因测序引物表
(2)进行高保真PCR产物扩增；
1、PCR反应体系(25μL)：
2、PCR反应条件：
变性-退火-延伸共30个循环
再延伸 72℃ 5min
3、最终扩增得到的PCR产物序列(见表3)；
表3最终扩增得到的PCR产物序列
(3)将包含120027菌株的phoQ基因突变位点的PCR产物进行Sanger一代测序。
(4)将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是否对多粘菌素E耐药的试剂盒中的应用，其特征在于，所述phoQ基因突变体的突变基因>120027_1B_phoPQG1375T的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述phoQ基因突变体在制备用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素E耐药的试剂盒中的应用，其特征在于，所述用于检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素E耐药的试剂盒通过检测所述phoQ基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素E耐药的检测。
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