WO2010130914A1 - Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles - Google Patents

Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles Download PDF

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WO2010130914A1
WO2010130914A1 PCT/FR2010/050824 FR2010050824W WO2010130914A1 WO 2010130914 A1 WO2010130914 A1 WO 2010130914A1 FR 2010050824 W FR2010050824 W FR 2010050824W WO 2010130914 A1 WO2010130914 A1 WO 2010130914A1
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WO
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specific
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dna
sequences
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Application number
PCT/FR2010/050824
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Inventor
Fabrice Armougom
Michel Drancourt
Mireille Henry-Mary
Didier Raoult
Original Assignee
Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii)
Assistance Publique - Hopitaux De Marseille
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and preferably quantifying DNA, preferably comprising prokaryotic DNA, extracted from a stool sample of an individual, in particular for the molecular determination of the composition of the intestinal flora in stool.
  • the present invention also relates to a DNA detection and quantification kit that is useful for implementing a method for detecting and quantifying DNA according to the invention.
  • microbiota here called gut microbiota
  • gut microbiota the composition of the intestinal flora in humans because this flora is involved in the physiological processes of the digestion of beverages and foods, and its role is suspected or substantiated in different pathological processes digestive and extradigestive.
  • the role of the gut microbiota in obesity is a hot topic [Turnbaugh PJ et al. - A core gut microbiome in obesity an lean twins. Nature 2009; 457: 480-4].
  • the weight status of an individual is the result of the number of calories ingested (role of the diet), the number of calories extracted during digestion (role of the gut microbiota), the number of calories stored (role of adipose tissue) and the number of calories expended (role of physical exertion).
  • a first study showed that the obese individuals had a bias of the ratio of the bacteria of the phylum Firmicutes compared to the bacteria of the phylum Bacteroidetes (ratio Firmicutes / Bacteroidetes or F / B) compared to the control individuals due mainly to the decrease of the Bacteroidetes in the subjects obese [Ley RE et al. - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006; 444: 1022-3].
  • Bacteroides thetaiotaomicron results in increased caloric conversion in xenobiotic mice [Samuel BS et al. -A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism.
  • pathologies in which the intestinal microbiota is known or suspected to play a role include the genesis of colonic cancers [Pique JM et al. - Methane production and colon cancer. Gastroentorology 1984; 87: 601-5] and other chronic inflammatory digestive conditions [Peled Y. et al. - Factors affecting methane production in humans. Gastrointestinal diseases and alterations of flora colony - Dig. Dis. Sci. 1987; 32: 267-71; Waever GA et al. - Incidence of methanogenic bacteria in sigmoidoscopy population: an association of methanogenic bacteria in diverticulosis. Gut 1986; 27: 698-704].
  • the SSU rDNA gene of M. smithii is detected and quantified in a single sample and is also not specific for M. smithii but is found in any other methanogenic archae.
  • the DNA extraction protocol used does not involve chemical lysis or lysis by heat.
  • the inventors have discovered that the extraction methods used in the state of the art to extract the DNA from the stool were not sufficiently effective to lead to reliable results in terms of quantification, in particular when seeks to quantify thick-walled Archae-type prokaryotes.
  • the inventors have developed a method for quantifying certain species of microorganisms and certain phyla of microorganisms, from a stool sample, routinely applicable in research laboratories and medical and veterinary diagnostic laboratories, and comprising a marker internal quality.
  • the inventors developed a method for the molecular quantification of bacteria of the phylum Firmicutes, specifically bacteria of the genus Lactobacillus, and bacteria of the phylum Bacteroidetes.
  • the choice of phyla firmicutes and bacteroidetes has been explained above.
  • the choice of the genus Lactobacillus, which is a genus of the phylum Firmicutes, is justified by the fact that the growth promoters and in particular Lactobacillus were associated in chickens with a very important weight gain especially in those which were supplemented in Lactobacillus during childhood [Khan M et al. Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens.
  • the inventors have developed a technique for determining and quantifying each of the species / phyla of interest by quantitative PCR using Archae Methanobrevibacter smithii as a control of the quality of prokaryotic DNA extraction from the stool sample.
  • Methanobrevibacter smithii a very difficult to extract microbe Archae, should be present in all human stool specimens because of its function in the detoxification of products derived from food processing in the intestine. by methane synthesis, and therefore its identification and quantification should constitute a positive control of the successful realization of the extraction and quantification of the sample.
  • the inventors have therefore first developed a technique for extracting DNA from microorganisms from the stool, which enabled them to verify by the constant presence of Archae Methanobrevibacter smithii in human stools the quality of this extraction process. Then, they developed a method for quantifying microorganisms of interest, with a view to developing a routine protocol allowing, from a stool sample in humans or animals, to quantify the presence of microorganisms. of interest, including Methanobrevibacter smithii, Lactobacillus spp., Firmicutes and Bacteroidetes.
  • the present invention thus provides a high performance protocol for the extraction of prokaryotic DNAs (Bacteria and Archaea) and for the relative quantification of the intestinal prokaryotic flora that is exhaustive, efficient, reproducible and easy to implement in a routine laboratory so as to facilitate the analysis. a large number of samples for both diagnostic and epidemiological purposes.
  • the inventors have developed a technique for extracting DNA by alternating mechanical lysis and enzymatic lysis, which they have controlled by introducing into a salt the control of the known quantities of prokaryotes (Bacteria). , Archaea) whose extraction of DNA is difficult because of the presence of a particularly thick cell wall such as Methanobrevibacter smithii. Indeed, there can be no reliable quantification without optimal DNA extraction.
  • the inventors have optimized all the steps of extraction of bacterial lysis until the choice of the extraction method is manual or automatic, taking into account the efficiency and reproducibility of the method. Finally, the inventors compared the extraction technique used with that used by the main authors published on this subject, as described in Example 1.
  • the DNA extraction method as well as the real-time PCR quantification tools developed by the inventors, enabled them to confirm that Methanobrevibacter smithii was present in 100% of individuals, at very variable rates, in particular according to their weight status.
  • the inventors have deduced the interest of systematically analyzing in salt the presence of Methanobrevibacter smithii, at least as a control of the quality of extraction of the stool DNA in the sample tested.
  • Methanosphaera stad manae was present only in the stools of 38% of individuals. It is this additional data which also led the inventors to propose the detection of Methanobrevibacter smithii as a control of a good extraction of DNA.
  • the number of DNA copies of at least one specific Methanobrevibacter smithii DNA sequence is quantitatively quantitated by quantitative PCR, selected from the following specific sequences:
  • the number of copies of said specific Methanobrevibacter smithii specific DNA is quantified by real-time PCR comprising PCR type enzymatic co-amplification of a specific sequence of methanobrevibacter smithii contained in a single molecule. in it it DNA extracted from the sample of salt them, and on the other hand in a sample of the synthetic DNA fragments serving as a calibration standard of quantification of DNA, said specific seq uence of Methanobrevibacter smithii being chosen among the following sequences or their complementary sequences: A sequence of the 16S RNA gene amplifiable by the following primer sequences:
  • Antisense primers SEQ. ID. N ° 7: 5'-
  • Methanobrevibacter smithii derived from the 16S RNA ribosomal gene and the rpoB gene are quantified.
  • the inventors have observed that detection of Metha nobrevibacter smithii in 100% of individuals requires detection of two genes, preferably the amount of M. smithii being quantified at a rate of at least 10 4 M organisms. smithii / ml in said salt sample.
  • a quantification of 10 4 organisms / ml of stool sample corresponds to only the detection sensitivity below which no DNA is detected with the SEQ primers. ID. nos. 6 and 7 for the rpoB gene of M. smithii and primers SEQ ID. No. 2 and 3 for the 16S RNA gene of M. smithii.
  • real-time PCR amplification and quantification reactions are carried out using specific hydrolysis probes of Methanobrevibacter smithii.
  • the Real-Time PCR technique consists of a classical PCR using direct and reverse sequence primers, and includes amplified product detection based on measurement. fluorescence emission proportional to the amount of amplified genes with a so-called "hydrolysis" probe.
  • said probe is labeled with a fluorescence emitter or 5 'fluorophore and a 3' fluorescence emission blocking agent.
  • This blocking agent absorbs the fluorescence emitted when the fluorophore and the blocking agent are close. When the fluorophore and the blocking agent are separated, the fluorescence emission is no longer absorbed by the blocking agent.
  • the Taq polymerase causes a hydrolysis of the probe and thus a release of nucleotides and fluorophore in solution. Fluorescence emission will therefore be proportional to the number of amplifiers.
  • the principle of real-time PCR is based on the ability of Taq polymerase during the elongation step to hydrolyze a hybridized probe on the DNA to be copied, this hydrolysis allowing the fluorescence emission, which allows it to quantification.
  • two different targets can be quantified by introducing into the reaction mixture two probes and one probe directed against a first target, and two other primers and probes directed against the other target. Both probes are labeled with different fluorophores.
  • a large synthetic DNA fragment is used as the calibration standard for quantifying DNA, said large fragment of synthetic DNA comprising said specific sequences of each of said bacteria or species, respectively. prokaryotic whose concentrations are quantified.
  • the presence of several molecular targets on the same nucleic fragment makes it possible to quantify different targets in the same sample and to homogenize them in a homogeneous manner, the quantization using the same standard of calibration of several molecular species. These allow comparison of the effectiveness of different PCR reactions between them and from one determination to another over time and avoids biases related to the positive control.
  • DNA fragment is meant a DNA or oligonucleotide fragment whose sequences are written hereinafter in the 5 ' ⁇ 3' direction.
  • an amplification and quantification reaction is carried out by PCR in real time, using specific hydrolysis probes respectively of each of said specific Methanobrevibacter smithii sequences, namely:
  • SEQ. ID NO: 4 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3 '
  • SEQ. ID NO: 8 5'-ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3 '
  • a large synthetic DNA fragment serving as a DNA quantization calibration standard
  • said large synthetic DNA fragment grouping specific sequence dies, preferably in the form of a plasmid, with a plurality of samples of large synthetic DNA fragment of different known concentrations.
  • sequences of the amplified molecular targets have the following structure, with the ordered primer sequences and the framed probe sequences and in italic iq ue:
  • the inventors have therefore developed a quantification tool that targets sequences that make it possible to quantify specifically and faithfully: (I) - Firmicutes (Fi), (2) - Bacteroidetes (Ba), (3) - Lactobacillus (La) in order to know by quantitative real-time PCR the relative composition of the intestinal microbiota of obese subjects, thin subjects and subjects with anorexia nervosa.
  • Fi Firmicutes
  • Ba Bacteroidetes
  • La Lactobacillus
  • specific sequence is understood to mean a sequence of the genome of said species Methanobrevibacter smithii, of said Lactobacillus gene or phylum Bacteroidetes or Firmicutes, which is not found in any other genome of microorganisms or living organisms.
  • specific consensus sequence is understood to mean a sequence of the genome of said species Methanobrevibacter smithii, of said genus Lactobacillus or, respectively, of said phylum Bacteroidetes or phylum Firmicutes, which is found in all said strains of said species said genus or said phylum and not found in any other microorganism genome or living organism.
  • the inventors have searched in silico for the 16S portion of the gene encoding the ribosomal RNAs for the mplification of almost all Bacteroidetes on the one hand and Firmicutes on the other hand eliminating all risks of cross-reactivity between the two groups.
  • These different primers and probes systems being chosen in agreement with the experimental contingencies, the cross reactivities were tested in silico then experimentally using the DNAs extracted from stem bacteria.
  • the primers and probes systems used to recognize Bacteroidetes do not recognize experimentally any DNA from Firmicutes strains and vice versa.
  • the inventors chose the target on the tuf gene and a couple of primers and a probe were chosen according to the technical constraints of the real-time PCR. From the DNA of 20 strains of Lactobacillus not recognized by the pair of ace and the probe corresponding to the molecular target chosen, 20 tuff gene sequences not deposited in Genbanks were amplified and sequenced, consensus sequences Primers and probes were selected and tested on 96 DNA Lactobacillus strains. This system has probes and probes that allows the amplification of the maximum amount of Lactobacillus strains that is preserved.
  • Lactobacillus sp selected have a greater sensitivity and recognize a greater number of bacteria than those described in the prior art.
  • a quantitative amplification method is carried out by PCR using the following primers:
  • SEQ. ID NO: 13 5'-TACATYCCAACHCCAGAACG-3 '
  • SEQ. ID NO: 14 5 'AAGCAACAGTACCACGACCA -3'.
  • SEQ. ID NO: 17 5'-GTCAGCTCGTGTCGTGA-3 '
  • K is G or T and Y is C or T.
  • SEQ. ID NO: 15 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3 ', where R is A or G.
  • N designates either I or one of A, T, C or G.
  • variable nucleotides As defined above.
  • Oligonucleotides of Seq. ID. No. 10, 13, 15, 18 and 19 are therefore implemented, in fact, in the form of equimolar mixtures of oligonucleotides of different sequences, the oligonucleotide dice of different sequences answering each SEQ sequence. ID. No. 10, 13, 15, 18 and 19 to the various possible definitions of sequences Nos. 10, 13, 15, 18 and 19 respectively, namely:
  • the step of hybridization of the primers and elongation at 48 ° C. is carried out.
  • a large synthetic DNA fragment is used as a quantification standard, which contains the specific sequences of the different molecular targets selected previously.
  • the presence of multiple targets on the same fragment makes it possible to quantify different targets in the same sample and co-quantify them homogeneously using the same calibration range to detect different molecular targets in the measurement. where the constraints of the choice of primers and the probe allow it.
  • This range of calibration maintained over time is the guarantor of the stability of the quantification system.
  • This calibrator is diluted from 10 7 to 1 of each of the molecular targets to 5 .mu.l of DNA sample.
  • said concentrations Fi (bacterium of phyla Firmicutes), Ba (bacteria of phyla Bacteroidetes) or La (bacterium Lactobacillus sp) are determined by enzymatic amplification of PCR type in real time and quantification of the DNA of said DNA fragments of seq. specific bacteria of the phylum Firmicutes and Bacteroidetes and the genus Lactobacillus.
  • said bacterial concentrations are determined by enzymatic co-amplification of the real-time PCR type of said DNA fragments of specific seq uences of the phylum Firmicutes and Bacteroidetes and of the genus Lactobacil, respectively, contained in a par t in said DNA extracted from the sample, and on the other hand in synthetic DNA samples each comprising said specific sequences of said standard bacteria.
  • calibration of quantification of DNA, said DNA fragments of specific sequences respectively of the phylum Firmicutes and Bacteroidetes and of the genus Lactobacillus having a size of 70 to 150 nucleotides, preferably 90 to 120 nucleotides.
  • the detection and the quantification of said amplified fragments are carried out using probes labeled with sequences distinct from and amplified by the amplification primers, for each of said DNA fragments of specific sequences respectively of the phylum Firmicutes and Bacteroidetes and of the genus Lactobacillus, the markers of the different probes are markers that are different from each other, in particular the known fluorescent markers of the VIC and FAM type.
  • consensus sequences specific for said bacteria are derived from:
  • Bacteroidetes the fragment of positions 537 to 721 of the 16S ribosomal RNA gene of Bacteroides fragilis whose accession number in the RDP-II ribosomal library is S000000037.
  • Lactobacillus bacteria for the bacteria of the genus Lactobacillus bacteria, a sequence of 90 bases, common to the bacteria Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri and Lactobacillus acidophilus within the tuf gene coding for the elongation factor at positions 253 to 343 of the GenBank reference gene AY 5621 91.1.
  • "Probe” is understood here to mean an oligonucleotide, more preferably 20 to 30 nucleotides, which hybridises specifically with said specific sequence and thus makes it possible to detect and quantify it specifically by measuring the increase in bound fluorescence of the PCR reaction.
  • the probe makes it possible to detect the amplified specific DNA and to quantify it by comparing the intensity of the signal with that of the standard of quantification.
  • primer is meant herein an oligonucleotide of preferably 15 to 25 nucleotides which specifically hybridizes with one of the two ends of the sequence that the DNA polymerase will amplify in the PCR reaction.
  • a method of determining the status of the intestinal flora of an individual advantageously comprises the quantification of the two phyla Bacteroides and Firmicutes, on the one hand, and, on the other hand, bacteria of the genus Lactobacillus and of the species Methanobrevibacter smithii.
  • a large synthetic DNA fragment is used as the calibration standard for quantification of DNA, said large synthetic DNA fragment grouping said specific sequences respectively of each of said prokaryotic bacteria.
  • the presence of several molecular targets on the same nucleic fragment makes it possible to quantify different targets in the same sample and co-quantify them in a homogeneous manner, the quantification using the same calibration range of several molecular species, allowing the comparison of the effectiveness of different PCR reactions between them and from one determination to another over time and avoids biases related to the positive control.
  • a large synthetic DNA fragment is used as a DNA quantification calibration standard, said large synthetic DNA fragment containing such specific sequences as Methanobrevibacter smithii, respectively. , of the genus Lactobacillus, of phylum Bacteroidetes, and preferably of Phylu m Firmicutes, more preferably inserted into a plasmid.
  • a restriction enzyme cleavage site is advantageously introduced into at least one of the molecular targets. This site is missing on the natural seq uence. Therefore, by enzymatic analysis and analysis of the amplified fragment on the agarose gel, or by using a real-time PCR probe that specifically recognizes the restriction site, it is possible to detect the possible presence of the contaminating plasmid. .
  • the digested fragment is from the amplification of the molecular target inserted into the control plasmid, it contains the restriction site, and will be smaller in size than the undigested fragment.
  • a real-time PCR reaction is carried out with forward and reverse primers of one of the molecular targets, and a specific probe of said exogenous sequence containing the restriction site.
  • a plurality of PCR enzymatic amplification reactions, simultaneous or not, of each of said specific sequences of said bacteria are used with the same large standard synthetic DNA fragment, using a plurality of simultaneous PCR amplification reactions.
  • no more than different sets of primers specific for each of the different said specific sequences of each of said bacteria, the sequences of the different primers not intersecting between the different said bacteria and said primers can be implemented in an enzymatic amplification reaction carried out according to the same protocol and, in particular, at the same hybridization temperature.
  • a first PCR nucleic acid amplification reaction step in the presence of a said polymerase enzyme, a series of n oligonucleotides of defined sequences, without exogenous primers, comprising a series of cycles under temperature conditions; allowing the hybridization of said oligonucleotides, followed by an elongation of the complex obtained, intended to put said oligonucleotides in sequence, in sequence, the sequences of said oligonucleotides corresponding successively and alternately to the sense and antisense sequences of the so-called second synthetic fragments , and each said oligonucleotide containing in its 5 'and 3' regions sequences complementary to those of the following and previous oligonucleotides, if any, and
  • a second amplification step using primers specific for the 5 'and 3' ends of said direct strand of said large first synthetic fragment to be prepared, making it possible to produce identical copies of said large first fragment.
  • This technique is therefore based on the use and control of an artifact of PCR, which consists in the hybridization of the primers with each other (dimerization of the primers). This phenomenon is observed in the case where the PCR conditions, in particular temperature, are poorly adapted, and the primers contain partially complementary sequences.
  • the construction technique thus consists, from the target sequences, of choosing the sequences of the oligonucleotides, with alternating oligonucleotides of direct (“sense") or inverse (also called “reverse” or “antisense”) sequences.
  • alternating oligonucleotides of direct (“sense") or inverse (also called “reverse” or “antisense") sequences In order to make it possible to put end to end of these oligonucleotides, care is taken to introduce in 3 'of the sequence of an oligonucleotide a nucleotide sequence complementary to the first nucleotides of the following oligonucleotide.
  • oligonucleotides will be hybridized by their complementary parts, and thanks to the polymerase activity, for example Taq polymerase, a synthesis of 5 'at 3' is carried out in order to obtain double-stranded fragments.
  • the final (assembled) fragment is synthesized by PCR using a pair of forward and reverse primers corresponding to the end sequences of the desired first large double stranded synthetic DNA fragment.
  • This technique of generic construction of a synthetic nucleotide fragment allows the contiguity of several molecular targets of interest. It is a simple method to implement, fast and reliable, and does not require heavy equipment and expensive.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit useful for the implementation of a diagnostic method and followed by the report Firmicutes / Bacteroidetes in the stool samples according to the invention, characterized in that it comprises:
  • quantification of said specific prokaryotic DNAs of the bacterium is carried out.
  • the quantification method according to the invention makes it possible to correlate the monitoring of the weight status of a person with monitoring of bacteria BA (Bacteroidetes), FI (Firmicutes), LA (Lactobacillus) and M bacteria. (Methanobrevibacter smithii), in particular as follows:
  • a decrease in BA (Bacteroidetes) and an increase in LA (Lactobacillus) represents a risk of weight gain, provided that LA (Lactobacillus) is greater than 10 6 .
  • a decrease in Methanobrevibacter smithii may be indicative of a favorable evolution of this pathology, spontaneously or under the effect of therapeutic or non-medicinal therapeutic actions for obese patients in the process of Pharmaceutical treatment, an increase in BA (Bacteroidetes) and a decrease in LA (Lactobacillus) may be indicative of good treatment progress.
  • specific supplements or treatments with regard to the bacteria concerned may also contribute to the therapeutics of the subjects concerned by seeking to specifically reduce the level of M. (Methanobrevibacter smithii) in anorexics, and increase the level of BA (Bacteroidetes). and lowering the level of LA (Lactobacillus) in obese patients or people on antibacterial therapy along the way.
  • M. Metalobrevibacter smithii
  • BA Bacilletes
  • the present invention also provides a detection kit comprising reagents for carrying out PCR amplification reaction and at least one set of oligonucleotide primers and preferably in addition at least one probe oligonucleotide.
  • a detection kit comprising reagents for carrying out PCR amplification reaction and at least one set of oligonucleotide primers and preferably in addition at least one probe oligonucleotide.
  • said kit comprises at least one of two pairs of oligonucleotide primers and, preferably at least one of the oligonucleotide hydrolysis probes, capable of amplifying at least one of said dithes. sequences of Methanobrevibacter smithii derived from the gene
  • kits according to the invention comprises the pairs of oligonucleotide primers with preferably the oligonucleotides probes of hydrolysis, su ivants:
  • the pair of oligonucleotides has sequences of SEQ sequences. ID No. 9 and SEQ. No. 10, preferably with a hydrolysis probe oligonucleotide of sequence SEQ. ID No. 11 for the amplification of a specific consensus sequence of the phylu m Bacteroidetes and,
  • kits further includes:
  • a kit comprises extraction reagents comprising at least one abrasive powdery product, preferably glass powder and a chemical and / or enzymatic lysis reagent.
  • the present invention also provides a method characterized in that to perform the extraction of the prokaryotic DNA from said stool sample, the steps are performed in which:
  • a homogeneous suspension of said stool sample is made in a buffer solution, preferably at a dilution of 50 to 150 g / l, and
  • a mechanical lysis is carried out by mixing and stirring the slurry of step 1 with an abrasive spraying product, preferably preferably acid-washed glass powder, and preferably a heating step is carried out at 100 ° C. for 10 minutes, and
  • step 3 chemical and / or enzymatic lysis is performed by mixing and agitate the suspension obtained in step 2) with chemical or enzymatic lysis buffer and then
  • step 2) repeating step 2) with the mixture obtained in step 3), and
  • step 3) is preferably repeated with the mixture obtained in step 4).
  • the DNA is finally separated either by known methods such as by attachment to a column containing the silicate or washing to remove said DNA from the column or by washing and centrifugation. to recover said DNA fragments.
  • the realization of the first mechanical lysis step makes it possible to optimize and promote the work of chemical or enzymatic lysing agents in step 2) by promoting their penetration into the proca ryote microorganisms allowing partial degradation.
  • the thick walls of the thick-walled prokaryotic micro-organisms, and the complete degradation of the adjacent layers is obtained only by at least a second mechanical lysis after said first chemical or enzymatic lysis.
  • step 2) heating at 100 ° C. makes it possible to finalize the degradation of the components of the walls and membranes of the microorganisms.
  • FIG. 1 shows on the ordinate the percentage of sequences
  • 16S ribosomal RNA and abscissa the results for phylu m Firmicutes (FI) bacteria, then bacteria phyl um Bacteroidetes (BA).
  • the sensitivity rates are represented by the first column in fine lines, namely 88.94% for bacteria of the phylum Firmicutes and 89.89% for the bacteria of the phylum Bacteroidetes.
  • the specificity rates are represented by the second column in g ras, namely 0.83% for the bacteria of phylum Firmicutes and 0.01% for the bacteria of the phylum Bacteroidetes.
  • FIG. 2 represents the quantification of the bacteria of the phylum Bacteroidetes in salt collected from three groups of obese (O), control (L) and anorexic (A) individuals.
  • the cross indicates the average; the horizontal line the median and the cu be represents the distribution of the values in the standard deviation.
  • FIG. 3 represents the distribution of q uantities greater than 10 6 of the number of bacteria of the genus Lactobacillus detected and quantified by the method according to the invention in the stools of anorexic (A), obese (O) and control ( L).
  • the numbers on the y-axis represent the number of individuals.
  • II represents the Lactobacillus copy number greater than or equal to 10 6
  • II represents the Lactobacillus copy number of less than 10 6 .
  • Fig ure 4 represents the quantification of Archea Methanobrevibacter smithii according to the method of the invention in the stools of anorexiq ues (A), obese (O) and controls (L).
  • Fig. 4 shows the standard deviation (height of the vertical line) and the average (cube area), the numbers in the ordinate being the average number of copies of Methanobrevibacter smithii.
  • EXAMPLE No. 1 DNA extraction protocol according to the invention and comparison with the reference protocol published in the literature, for the detection of Archae Methanobrevibacter smithii in salt.
  • Archae Methanobrevibacter smithii is a methanogen, that is to say an arche able to transform the products of digestion methane CH4 foods.
  • Methanosphaera stadtmanae is also a methagenogenic Archae detected in salt. The inventors have argued that, given the importance of the biochemical methanogenesis reaction for intestinal physiology, Archae Methanobrevibacter smithii and not Methanosphaera stadtmanae was present and detectable in stool in all individuals.
  • Methanobrevibacter smithii was effectively detected in almost all individuals by combining detection of the 16S RNA ribosomal 1 gene with that of the rpoB gene whereas Methanosphaera stadtmanae was detected only in 40% of individuals using the same system.
  • the inventors have imagined having to lyse the wall of Archae in order to release the Archaic DNA in order to make it accessible to molecular detection based on the PCR technique. For this purpose, the inventors have put in place by successive trial and error the following protocol. Initially, the inventors mechanically lysed the samples by agitation in the presence of glass powder, followed by chemical lysis, and then extracted the DNA.
  • a protocol that is the subject of the invention is therefore the following:
  • 2- 250 .mu.l of suspension are introduced into a tube of 1.5 ml containing 0.3 g (equivalent to a volume of about 10 .mu.l, ie less than 4% of the final volume) of glass powder of which the particles measure less than 106 ⁇ m and are washed with acid to remove the gaseous, nucleic acids and DNAses and RNAses which may be derived from the processes for the manufacture of glass beads (reference G4649, Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) and acted in the BIO Fast Prep 101 (Qbiogene, Strasbou rg, France) at maximum speed (6.5) for 90 seconds;
  • the preparation is then heated at 100 ° C for 10 minutes and then brought back to the temperature a mbiante. Then, a standard NucleoSpin® Tissue Kit Kit protocol (Macherey Nagel, Hoerdt, France) and used as follows. 180 ⁇ l of lysis buffer T1 and 25 ⁇ l of proteinase K at 20 mg / ml are added. The mixture is incubated at 56 ° C overnight;
  • a known DNA lysis buffer is chemically lyzed, that is to say 200 ⁇ l of buffer B3 (mixture in equal proportions of the buffers B1 [Guanid ine hydrochloride] and buffer B2 of the composition available from the supplier) are added and the mixture is incubated for 10 minutes at 70 ° C., 200 ⁇ l of ethanol are added, melted, applied on a silica column, centrifuged for 1 min at maximum speed, washed with 500 ⁇ l of buffer BW, centrifuged for 1 minute at a speed. maximum, washed with 600 ⁇ l of melon B5 centrifuged 1 minute at maximum speed;
  • the inventors compared the protocol that is the subject of the invention with the reference protocol for the extraction of prokaryotic DNA from the stools.
  • the inventors collected 50 stool samples collected from 50 individuals who submitted stool for exploration of diarrhea.
  • These 50 salt samples benefited from a parallel extraction of DNA by the protocol object of the invention and by using the QIAAM extraction kit P Stool DNA mini kit (Qiagen, Courta beef, France) described in the literature [Eckburg PB. et al . Diversity of the intestinal microbial hu man flora. Science 2005 Vol ume 308 page 1635-1638].
  • the 16S ribosomal RNA gene was detected according to the same method of detection and quantification with the primers SEQ. ID. No. 6 and 7 and the probe SEQ. ID. No. 8 described in Example 2, in 50/50 (100%) of individuals and the rpoB gene was detected in 49/50 (99%) of individuals with SEQ primers. ID. No. 2 and 3 and the probe SEQ. ID. # 4.
  • the extraction protocol according to the invention has made it possible to detect between 2 and 3 logarithms of DNA copy plots that the Qiagen commercialized protocol with a P value. less than or equal to 0.00001 for the two genes analyzed.
  • the negative controls remained strictly negative.
  • the inventors For the quantification of M. smithii, the inventors used the SEQ leader sequences. ID. No. 2 and 3 and SEQ probe sequence. ID. No. 4 for the amplification of the 16S gene of ribosomal I 1 RNA of M. smithii, and the SEQ leader sequences. ID. No. 6 and 7 and SEQ probe sequence. ID. No. 8 for the amplification of M. smithii's rpoB. The inventors have established the following PCR quantitation calibration curves for the detection of M. smithii by amplification of the 16S rRNA gene and the rpoB gene, from known amounts of M. smithii obtained by culture of M. smithii on agar:
  • the ribosomal database project (RDP-II): introducing myRDP space. Nucleic Acids Res 2007, 35: D169-D172] of 16S ribosomal RNA in the ribosomal RDP-II database.
  • the phylum Bacteroidetes is represented by more than 34,000 sequences (only phyl um Protebacteria is more important than that of Bacteroidetes). Identifying a system of 3 fragments of sequences (primers and probe) targeting almost all species of phyla Firmicutes and Bacteroidetes respectively was a real challenge, especially since the system had to be specific; that is to say that a minimum of species outside the phylum considered should be detectable.
  • the difficulty was that the small variability of the 16S ribosomal RNA gene nucleotide sequence (many conserved regions) was therefore identified by PCR primers and a probe.
  • each of the sequences is very sensitive to the clade Firmicutes but not necessarily very specific.
  • the meeting of the 3 sequences primers and probes SEQ. ID. No. 17, No. 18 and No. 19 provides high specificity and sensitivity for use in quantitative real-time PCR.
  • the three primer sequences and SEQ probes. ID. No. 9, No. 10 and No. 11 for Bacteroidetes bacteria also confer high specificity and sensitivity for use in real-time quantitative PCR.
  • the real-time PCR program included for the detection of Bacteroidetes: 95 ° C 15 min, then 45 cycles of 95 ° C 30s, 48 ° C 45s, 72 ° C 1 min), and, for the detection of Firmicutes and Lactobacillus and Methanobrevibacter smithii: 95 ° C 15min, then 45 cycles of 95 ° C 30s, 60 ° C 1min.
  • the concentrations of the quantities of probes and primers have been adapted for each of the systems in order to maintain their effectiveness,
  • the results indicate that the Bacteroidetes detection system has a sensitivity of 89.89%, and detects 30,237 of the 33,639 16S ribosomal RNA sequences of phylu m Bacteroidetes bacteria in the RDP-II database (Fig.
  • the detection system of the Firmicutes has a sensitivity of 88.94% since it detects 83,576 of the 93,969 sequences of the 16S RNA ribosomal RNA gene from the phylogenetic Firmicutes of the RDP-II database.
  • the previously described methods provide a high degree of specificity (99%) and sensitivity ( ⁇ 50 copies) for use in real-time PCR.
  • Table 1 The results of Table 1 are expressed in terms of CT, ie the number of amplification cycles necessary for the amplification to start, this CT value in relation to the concentration of the nucleic product to be used, namely that more CT is low, the concentration is high.
  • a calibration plasmid comprising a large hybrid synthetic DNA fragment containing the SEQ sequences was constructed. No. 1, No. 2, No. 12, No. 16 and No. 20, in the form of a double-stranded DNA fragment constructed by amplification reaction, as described in FR-2,882,063. .
  • a calibration plasmid range of 7 was created , one copy per well, for each amplification reaction the ten points of the plasmid range were tested.
  • the measurement of the F / B ratio is currently performed only by metagenomic, DNA chip and sequencing methods of large libraries of 16S ribosomal RNA gene clones, which are in the field of research but are not applicable. in diagnostic routine.
  • the inventors have therefore thought to use the invention to reliably determine the ratio F / B by a real-time PCR technique, applicable routinely.
  • Methanobrevibacter smithii allowed the inventors to observe that the number of Methanobrevibacter smithii (Figure 4) is higher in obese than in controls with an obese / control ratio of 1.72, but this is not statistically significant.
  • the rate of Methanobrevibacter smithii is therefore interesting for a person suspected of anorexia.
  • Table 1 List of microbial DNAs used to determine the sensitivity / specificity of the PCRs in real time for the detection of microorganisms belonging to the groups Firmicutes and Bacteroidetes, in the stool.
  • A DNA extracted from the 108 strains tested by real-time PCR by the Bacteroidetes system.

Abstract

La présente invention concerne u ne méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de sel les d'un individu, notamment pou r la détermination moléculaire de la composition de la flore intestinale dans les selles. Selon l'invention, on contrôle la qualité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on détecte un ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii et on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de l'Archae Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacillus, duphylum Bacteroidetes et respectivement du phylum Firmicutes, pour assurer le diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'un individu. La présente invention fournit une méthode pour réaliser l'extraction d'ADN procaryote dans des selles.

Description

Méthode de détection d'ADN procaryote extrait d'un échantillon de selles
La présente invention concerne une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, notamment pour la détermination moléculaire de la composition de la flore intestinale dans les selles.
La présente invention concerne également une trousse de détection et quantification d'ADN utile pour la mise en œuvre d'une méthode de détection et quantification d'ADN selon l'invention.
Il est utile de pouvoir déterminer la composition de la flore intestinale (ici appelée microbiote ou microbiote intestinal) chez l'homme car cette flore intervient dans les processus physiologiques de la digestion des boissons et des aliments, et son rôle est soupçonné ou étayé dans différents processus pathologiques digestifs et extradigestifs.
Par exemple, le rôle du microbiote intestinal dans l'obésité est un sujet d'actualité [Turnbaugh PJ et al. - A core gut microbiome in obesity an lean twins. Nature 2009 ;457 : 480-4] . En effet, le statut pondéral d'un individu est le résultat du nombre de calories ingérées (rôle de l'alimentation), du nombre de calories extraites lors de la digestion (rôle du microbiote intestinal), du nombre de calories stockées (rôle des tissus adipeux) et du nombre de calories dépensées (rôle des efforts physiques). Il est maintenant connu que toutes les espèces microbiennes du microbiote intestinal n'ont pas la même capacité à extraire les calories apportées par l'alimentation, certaines espèces ou groupes d'espèces (ici désignés phyla) étant capables de convertir par une cascade de réactions biochimiques, les calories contenues dans les aliments et les boissons, mieux que d'autres espèces ou d'autres phyla. Par exemple, il existe de nombreuses évidences que la composition du microbiote intestinal chez la souris influence la prise de poids y compris chez les souris qui n'ont pas de fond génétique obèse (Leptine -) [Turnbaugh PJ et al . - An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006 ;444: 1027-31 ; Turnbaugh PJ et al. - Diet-induced obesity is linked to marked but réversible altérations in the mouse distel gut microbiome. CeII Host Microbe 2008.3 : 213-223; Backhed F. et al. - The gut microbiota as an environmental factor that régulâtes fat storage. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 2004; 101 : 15718-15723; Ley RE et al . - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3]. Chez l'homme, les travaux expérimentaux ne sont pas possibles et les données sur le rôle du microbiote intestinal dans le statut pondéral des individus reposent essentiellement sur l'observation de la composition du microbiote intestinal dans différentes circonstances. Un premier travail a montré que les individus obèses présentaient un biais du ratio des bactéries du phylum Firmicutes par rapport aux bactéries du phylum Bacteroidetes (ratio Firmicutes/ Bacteroidetes ou F/B) comparés aux individus contrôles dû majoritairement à la baisse des Bacteroidetes chez les sujets obèses [Ley RE et al. - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3]. En revanche, de nombreuses études avaient montré que Bacteroides thetaiotaomicron entraînait une augmentation de la conversion en calories chez les souris xénobiotiques [Samuel BS et al . -A humanized gnotobiotic mouse model of host- archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103 : 10011-10016]. Ces deux données ne sont pas incompatibles, car la baisse du genre Bacteroidetes n'entraine pas forcément la baisse de l'espèce Bacteroides thetaiotaomicron au contraire il pourrait y voir baisse drastique d'autres Bacteroidetes et augmentation relative de Bacteroides thetaiotaomicron.
Par ailleurs, les inventeurs ont testé les amorces utilisées par les différents auteurs qui ont publié sur ce sujet et ont observé que ces amorces ne sont pas absolument spécifiques de B. thetaiotaomicron et amplifient d'autres espèces du genre Bacteroides. Le même travail a montré que la correction du surpoids par un régime hypocalorique ou faible en carbohydrates entraînait une modification progressive du microbiote en un an, celui-ci tendant à devenir comparable à celui des sujets minces [Ley RE et al. - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3] .
Plus récemment, il a été montré que des microorganismes appartenant au domaine des Archae, plus précisément de l'ordre des Methanobacteriales, étaient plus abondants chez les individus obèses que chez les individus contrôles ou chez les individus ayant bénéficié d'une chirurgie de l'obésité par « by-pass » intestinal . Cependant, la détermination précise des genres ou des espèces d'Archae associées à l'obésité, n'a pas été faite dans ce travail.
En particulier, les auteurs n'ont pas déterminé précisément laquelle des deux espèces d'Archae méthanogènes connues dans le microbiote intestinal, Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadmanae, était plus spécifiquement associée au microbiote des individus obèses [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ; 106 :2365-70].
D'autres exemples de pathologies au cours desquelles le microbiote intestinal est connu ou suspecté de jouer un rôle comportent la genèse de cancers coliques [Piqué JM et al. - Méthane production and colon cancer. Gastroentorology 1984 ;87 :601-5] et d'autres pathologies digestives inflammatoires chroniques [Peled Y. et al . - Factors affecting méthane production in humans. Gastrointestinal diseases and altérations of colonie flora - Dig. Dis. Sci. 1987; 32 : 267-71; Waever GA et al. - Incidence of methanogenic bacteria in sigmoidoscopy population : an association of methanogenic bacteria in diverticulosis. Gut 1986 ; 27:698-704] .
Ces différents exemples illustrent l'intérêt, tant pour les laboratoires de recherche, que pour les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, qu'il y a à pouvoir déterminer en routine la composition du microbiote intestinal, et notamment la proportion relative de telle ou telle espèce de microorganisme ou de tel ou tel phylum de microorganismes. Dans l'exemple du statut pondéral de l'individu, il est utile de pouvoir déterminer par la simple cartographie microbienne des selles, si l'individu est prédisposé à une maigreur pathologique ou une obésité, qui peut ne pas être fidèlement reflétée par la simple mesure du poids corporel à un instant donné. Egalement, il est utile de pouvoir mesurer objectivement l'évolution de cette cartographie lors du traitement de la maigreur ou de l'obésité pour analyser l'efficacité du traitement et disposer d'éléments prédictifs de succès thérapeutique avant que la mesure du poids corporel n'atteigne les objectifs du traitement.
Cependant, les méthodes actuellement publiées pour l'analyse du microbiote intestinal ne permettent pas une utilisation en routine, ni dans les laboratoires de recherche ni dans les laboratoires de diagnostic médical ni vétérinaire. Ceci est illustré par le fait que les travaux publiés portent sur un relativement petit nombre d'individus étudiés compris entre 9 [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70] et 154 [Turnbaugh PJ et al. A core gut microbiome in obèse and lean twins. Nature 2009 ; 457:480-4]. En effet, les travaux réalisés à ce jour sur le microbiobiote ont tous utilisé l'amplification par la technique PCR du gène universel 16S ARN ribosomal suivie soit du clonage et du séquençage par technique de Sangers d'un grand nombre de clones (de l'ordre de 100 clones), soit d'une technique de pyroséquençage à haut débit sur la plateforme 454 Life Sciences - Roche [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70]. Ces techniques ne sont absolument pas utilisables en routine, du fait de leur coût, de leur lourdeur d'utilisation et du délai d'obtention des résultats de quelques semaines. Par ailleurs, les différents travaux réalisés donnent des résultats variables pour les individus contrôles entre les différentes études. Ceci est du en partie à l'absence de contrôle de qualité interne garantissant la qualité de l'extraction des acides nucléiques à partir du prélèvement de selles et de l'absence de témoin interne au prélèvement qui pourrait servir à normaliser les prélèvements et à comparer plus facilement les résultats expérimentaux obtenus chez des individus différents.
Les méthodes mises en œuvre à ce jour ne sont pas fiables en termes d'extraction et quantification de l'ADN procaryote de selles, et ne sont pas, en pratique, adaptées à une mise en œuvre d'analyse de routine, que ce soit en laboratoire d'analyses biologiques ou en laboratoire de recherche.
Dans SCANLAN et al. BMC Microbiology 2008 vol 8, π°l, pages 1471-2181, on décrit l'extraction d'ADN d'échantillons de selles et la détection du gène mcrA de M. smithii dans seulement 24% à 48% des échantillons testés, selon la catégorie d'individus. Le gène mcrA n'est pas un gène spécifique de M. smithii mais se retrouve dans d'autres archaes méthanogènes.
Dans RIDLON et al ., Clinica Chimica Acta 357 (2005 55-64), le gène SSU rDNA de M. smithii est détecté et quantifié dans un seul échantillon et n'est pas, lui non plus, spécifique de M . smithii mais se retrouve dans tout autre archae méthanogène . D'autre part, le protocole d'extraction d'ADN utilisé ne comporte pas de lyse chimique, ni de lyse par la chaleur.
Les inventeurs ont découvert que les méthodes d'extraction mises en œuvre dans l'état de la technique pour extraire l'ADN des selles n'étaient pas suffisamment efficaces pour conduire à des résultats fiables en termes de quantification, en particulier lorsque l'on cherche à quantifier des procaryotes de type Archae à parois épaisses.
Ceci a conduit les inventeurs a développer une nouvelle méthode d'extraction impliquant au moins une lyse mécanique, en préalable à une lyse chimique et, plus précisément, la réalisation d'une deuxième lyse mécanique après la première lyse chimique/enzymatique. Parallèlement et en complément, les inventeurs ont développé des outils de mise en œuvre de PCR quantitatives, avec des jeux d'amorces et de sondes spécifique pour une série de candidats potentiellement intéressants dans l'analyse de la flore intestinale, compte-tenu de certains écrits de la littérature, notamment en ce qui concerne les Bacteroidetes et Firmicutes, mais également compte-tenu de l'analyse personnelle des inventeurs, notamment en ce qui concerne Lactobacillus.
Les inventeurs ont développé un procédé de quantification de certaines espèces de microorganismes et de certains phyla de microorganismes, à partir d'un échantillon de selles, applicable en routine dans les laboratoires de recherche et les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, et comprenant un marqueur interne de qualité.
Plus particulièrement, les inventeurs mis au point un procédé de quantification moléculaire des bactéries du phylum Firmicutes, dont spécifiquement les bactéries du genre Lactobacillus, et des bactéries du phylum Bacteroidetes. Le choix des phyla Firmicutes et Bacteroidetes a été explicité ci-dessus. Le choix du genre Lactobacillus, qui est un genre du phylum Firmicutes, est justifié par le fait que les promoteurs de croissance et en particulier Lactobacillus étaient associés chez les poulets à une prise de poids très importante en particulier chez ceux qui étaient complémentés en Lactobacillus pendant l'enfance [Khan M et al . - Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Les inventeurs en ont inféré que ce genre bactérien, pourrait aussi participer à réguler le statut pondéral d'un individu bien qu'aucune donnée n'ait été publiée chez l'Homme, en dépit des conclusions d'importance qui pourraient en être tirées, compte-tenu que le Lactobacillus est présent dans les produits alimentaires issus des industries agro-alimentaires.
Pour cela, les inventeurs ont développé une technique de détermination et de quantification de chacun des espèces/phyla d'intérêt par PCR quantitative en utilisant l'Archae Methanobrevibacter smithii comme un témoin de la qualité de l'extraction des ADNs procaryotes à partir de l'échantillon de selles.
Les inventeurs ont formé l'hypothèse que Methanobrevibacter smithii, un microbe Archae très difficile à extraire, devrait être présent dans tous les échantillons de selles humains, du fait de sa fonction dans la détoxification des produits issus de la transformation des aliments dans l'intestin par synthèse de méthane, et donc que son identification et sa quantification devraient constituer un contrôle positif de la bonne réalisation de l'extraction et de la quantification de l'échantillon.
Les inventeurs ont donc tout d'abord mis au point une technique d'extraction de l'ADN des microorganismes à partir des selles, laquelle leur a permis de vérifier par la présence constante de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles humaines la qualité de ce procédé d'extraction. Puis, ils ont mis au point une méthode de quantification des microorganismes d'intérêt, dans la perspective de développer un protocole de routine permettant, à partir d'un prélèvement des selles chez l'homme ou les animaux, de quantifier la présence de microorganismes d'intérêt, notamment Methanobrevibacter smithii, Lactobacillus spp., Firmicutes et Bacteroidetes.
La présente invention fournit donc un protocole très performant d'extraction des ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) et de quantification relative de la flore procaryote intestinale exhaustive, performante, reproductible et facile à mettre en œuvre en routine de laboratoire afin de faciliter l'analyse d'un grand nombre d'échantillon dans un but tant diagnostique qu'épidémiologique.
Pour que l'outil de quantification de la flore bactérienne intestinale soit performant, sensible et reproductible il faut qu'en amont la technique utilisée pour l'extraction à partir des selles de l'ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) permette l'extraction de la totalité des
ADN. Pou r ce faire, les inventeu rs ont mis au point une techniq ue d'extraction de l'ADN en alternant lyse mécanique et lyse enzymatiq ue, qu'ils ont contrôlée en introduisant dans une sel le témoin des quantités connues de procaryotes (Bacteria, Archaea) dont l'extraction de l'ADN est difficile du fait de la présence d'une paroi cellu laire pa rticulièrement épaisse comme par exemple Methanobrevibacter smithii. En effet, il ne peut y avoir de q uantification fia ble sans une extraction optimale de l'ADN . Les inventeurs ont optimisé toutes les étapes d'extraction de la lyse des bactéries jusqu'a u choix de la méthode d'extraction qu'elle soit manuelle ou automatique, en tenant compte de l'efficacité et de la reprod uctibilité de la méthode. Enfin, les inventeurs ont comparé la technique d'extraction retenue avec celle util isée par les principaux auteu rs qu i ont publ iés su r ce sujet, comme décrit dans l'exemple 1.
La méthode d'extraction d'ADN, ainsi que les outils de quantification par PCR en temps réel développés par les inventeu rs, leur ont permis de confirmer q ue Methanobrevibacter smithii était présent chez 100% des individus, à des taux très variables, notamment selon leur statut pondéral .
Les inventeu rs en ont déduit l'intérêt d'analyser systématiq uement dans les sel les la présence de Methanobrevibacter smithii, au moins à titre de contrôle de la qualité d'extraction de l'ADN des selles dans l'échantil lon testé.
De même, il a été découvert que l'autre procaryote méthanogène
Methanosphaera stad manae, n'était présente que dans les selles de 38% des ind ividus. C'est cette donnée supplémentaire qu i a également cond uit les inventeurs à proposer la détection de Methanobrevibacter smithii à titre de témoin d'u ne bonne extraction de l'ADN .
Ainsi, la présente invention fou rnit une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant le cas échéant l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, ca ractérisé en ce que l'on contrôle la qual ité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on y détecte un ADN spécifiq ue de Methanobrevibacter smithii, de préférence quantifié à u n ta ux d'au moins 104 organismes M . smithii/ml de dit échantillon de selles.
On comprend que l'on ne prend ra pas en compte les résultats de détection et quantification d'u n ADN quelconque recherché, extrait d udit échantillon, si le contrôle de la qualité de l'extraction est négatif, c'est- à-d ire si on ne détecte pas ladite séquence spécifique de M . smithii dans l'ADN extrait dud it écha ntillon .
Pl us particulièrement, on quantifie le nombre de copie d'ADN d'au moins une séquence d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative, choisie parmi les séquences spécifiques suivantes :
- u ne séquence tirée du gène tirée du gène 16S de l'ARN ribosomal, SEQ. ID. N° l =
5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTC AGAATCGTTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGA ATTTCACCTCTACCCTGGGAG -3', et,
- u ne séq uence tirée d u gène rpoB, SEQ. ID. N°5 =
5'-AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAAC CCCAGAGGGTCCTAACTGTGGTC -3'
Pl us particulièrement encore, on q ua ntifie le nombre de copies dudit ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii pa r PCR quantitative en temps réel comprenant la coampl ification enzymatique de type PCR d'u ne séq uence spécifique de Methanobrevibacter smithii contenue d'u ne part dans led it ADN extrait de l'échantillon de sel les, et d'a utre part dans u n échantillon des fragments d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ladite séq uence spécifique de Methanobrevibacter smithii étant choisie parmi les séquences suivantes ou leurs séquences complémentaires : • une séq uence du gène 16S ARN amplifiable par les séquences amorces suivantes :
- Amorce sens, SEQ. ID. N°2 : 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3', et
- Amorces antisens, SEQ. ID. N° 3 : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA
-3', et
• u ne séq uence du gène rpoB amplifiée par des amorces de séquences suivantes :
- Amorce sens, SEQ. ID. N°6 : 5'- AAGGGATTTGCACCCAACAC -3', et
Amorces antisens, SEQ. ID. N°7 : 5'-
GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'.
De préférence, on quantifie au moins deux séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii tirées respectivement du gène 16S ARN ribosoma l et d u gène rpoB. Les inventeu rs ont en effet observé qu'u ne détection Metha nobrevibacter smithii chez 100% des individus, requiert de réaliser la détection su r deux gènes, de préférence, la quantité de M . smithii étant quantifiée à un taux d'au moins 104 organismes M . smithii/ml dans ledit échantillon de sel les. En effet, u ne quantification de 104 organismes/ml d'échantillon de selles correspond au seu il de sensibilité de détection en dessous d uq uel on ne détecte pas d'ADN avec les amorces SEQ. ID. n°6 et 7 pour le gène rpoB de M . smithii et les amorces SEQ ID. n° 2 et 3 pour le gène 16S ARN de M . smithii.
De préférence, on met en œuvre des réactions d'a mplification et quantification par PCR en Temps Réel, à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques de Methanobrevibacter smithii.
La technique de PCR en Temps Réel, consiste en u ne PCR classique en util isant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du prod uit amplifié basée su r la mesure d'émission de fluorescence proportionnel le à la quantité de gènes ampl ifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marq uée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsq ue le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est pl us absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et d u fluorophore en sol ution . L'émission de fl uorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser u ne sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquel le permet une quantification. Au cou rs de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introdu isant dans le mélange réactionnel deux a morces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents.
De préférence encore, on met en œuvre un grand frag ment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand frag ment d'ADN synthétiq ue regroupant desdites séquences spécifiq ues respectivement de chacune desdites bactéries ou espèce procaryote dont les concentrations sont quantifiées. La présence de plusieurs cibles molécu laires sur un même frag ment nucléique permet de quantifier des cibles d ifférentes dans un même échantil lon et de les coquantifier de façon homogène, la q uantification en utilisant la même ga mme d'étalonnage de plusieu rs espèces molécu laires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cou rs du temps et évite les biais liés au témoin positif. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'→3' .
Pl us particul ièrement, on réalise une réaction d'amplification et quantification par PCR en temps réel, en mettant en œuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, à savoir :
1) pour la séquence d u gène 16S ARN ribosomal,
SEQ. ID N°4 = 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3', et
2) pour la séquence du gène rpoB,
SEQ. ID N°8 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3', et
- u n g rand fragment d'ADN synthétique servant de sta ndard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant des d ites séquences spécifiques, de préférence sous forme de plasmide, avec une plu ral ité d'échantillons de grand fragment d'ADN synthétique de concentrations différentes connues.
Les séquences des cibles moléculaires amplifiées présentent la structure su ivante, avec les séq uences amorces encadrées et les séquences sondes encadrées et en ital iq ue :
- Pou r SEQ. ID. N°l :
CCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTCAGAATCG TTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGAATTTCACC
TCTACCCTGGGAG , et.
Pou r SEQ. ID. N°5 : AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAACCCCAGAG GGTCCTAACTGTGGTC
Les inventeurs ont donc développé un outil de quantification ayant pour cibles des séquences permettant de quantifier spécifiquement et fidèlement : (I)- les Firmicutes (Fi), (2)- les Bacteroidetes (Ba), (3)- les Lactobacillus (La) afin de connaître par PCR en temps réel quantitative la composition relative du microbiote intestinal de sujets obèses, de sujets minces et de sujets présentant une anorexie mentale.
Plus précisément, dans une méthode selon l'invention, on quantifie en outre conjointement dans ledit ADN extrait dudit échantillon de selles, au moins une séquence spécifique choisie parmi :
1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et
2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre
Lactobacillus, et
3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
On entend par "séquence spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit gène Lactobacillus ou dit phylum Bacteroidetes ou Firmicutes, que l'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganismes ou organismes vivants.
On entend ici par "séquence consensus spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit genre Lactobacillus ou, respectivement, dudit phylum Bacteroidetes ou phylum Firmicutes, que l'on retrouve dans toutes lesdites souches de ladite espèce dit genre ou dit phylum et qu'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganisme ou organisme vivant.
En ce qui concerne les bactéries Firmicutes, les inventeurs ont développé un jeu d'amorces et de sondes originaux tirés du gène 16S de 1'ARN ribosomal . Et, s'agissant de Bacteroidetes, une sonde tirée du gène 16S-RNA avait été décrite dans un article Armougon Raoult de BMC Genomics 2008,9 : 576, mais sans les amorces, de sorte qu'il fallait trouver des séquences amorces encadrant la séquence sonde connue, qui optimise le ratio sensibilité/spécificité, en d'autres termes, trouver des séquences amorces encad rant la séquence sonde et que l'on retrouve dans toutes les bactéries d u phylu m Bacteroidetes concerné et que l'on ne retrouve pas dans les autres phyla, notamment Firmicutes.
Pou r ce faire , les inventeurs ont cherché in silico des rég ions du gène codant pour la portion 16S des ARN ribosomiaux permettant l'a mplification de la quasi-totalité des Bacteroidetes d'une part et des Firmicutes d'autre pa rt éliminant tous risques de réactivité croisée entre les deux grou pes. Ces différents systèmes amorces et sondes étant choisis en accord avec les contingences expérimentales les réactivités croisées ont été testées in silico puis expérimentalement en utilisant les ADN extraits à partir de bactéries souches. Les systèmes d'amorces et sondes retenus pour reconnaître les Bacteroidetes ne reconnaissent expérimentalement aucu n ADN provena nt des souches de Firmicutes et vice et versa.
Pou r la cible Lactobacillus, les inventeu rs ont choisi la cible sur le gène tuf et un couple d'amorces et u ne sonde ont été choisis en accord avec les contraintes techniques de la PCR en temps réel . A partir de l'ADN de 20 souches de Lactobacillus non reconnues par le couple d'a morce et la sonde correspondant à la cible molécula ire choisie, 20 séquences d u gènes tuf non déposées dans les Genbank ont été amplifiées et séquencées, des séquences consensus d'amorces et de sondes ont été choisies et testées su r 96 ADN de souches Lactobacillus. Ce système a morces et sondes qu i permet l'ampl ification du maximum de souches de Lactobacill us est conservé.
Les séq uences de Lactobacill us sp sélectionnées présentent u ne plus grande sensibilité et reconnaissent u n plus grand nombre de bactéries que cel les décrites dans la technique antérieu re.
Pl us particu lièrement, on réal ise u ne méthode d'ampl ification quantitative par PCR à l'aide des amorces suivantes :
• pour lad ite séq uence consensus spécifique du phylum
Bacteroidetes : - amorces sens : SEQ. ID N°9 = 5'-AGCAGCCGCGGTAAT-3',
- amorces antisens : SEQ. I D N° 10 : 5'-CTAHGCATTTCACCGCTAC-
3',
• pour ladite séq uence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus :
- amorces sens : SEQ. ID N°13 = 5'- TACATYCCAACHCCAGAACG - 3',
dans laquelle Y désigne C ou T, H désig ne A ou C ou T, et
- amorces antisens :
SEQ. ID N° 14 = 5' AAGCAACAGTACCACGACCA -3'.
• pour lad ite séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes
- amorces sens : SEQ. ID N° 17 = 5'- GTCAGCTCGTGTCGTGA-3', et
- amorces antisens : SEQ. I D N° 18 = 5'-CCATTGTAKYACGTGTGT- 3'
dans laquelle K désigne G ou T et Y désigne C ou T.
Pl us particulièrement encore, on met en œuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en temps réel à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques choisies pa rmi les séquences su ivantes :
1) pour ladite séquence spécifique du phylu m Bacteroidetes :
SEQ. ID N0 I l = 5'-GGGTTTAAAGGG-3'
2) pour ladite séquence consensus spécifiq ue de bactéries du genre Lactobacill us :
SEQ. ID N° 15 : 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3', dans laq uelle R désigne A ou G.
3) pour ladite séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes :
SEQ. ID N° 19 : 5'-GTCAANTCATCATGCC-S',
dans laquelle N désigne, soit I, soit l'un de A, T, C ou G .
Lesdites séq uences spécifiques ainsi détectées et a mplifiées correspondent à :
1) une séquence spécifiq ue du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides frag ilis,), SEQ. N°12 =
5'-AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTG
GGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACTGGTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTC AACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGTCAGTCTTGAGTACAGTAGAGGTGGGCGG AATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAG -3'
2) une séq uence consensus spécifique de la bactérie Lactobacill us sp commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacill us jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners et Lactobacill us acidophilus, au sein du gène tuf coda nt pou r le facteur d'élongation, SEQ. ID N° 16 =
5' -TACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGACAAGCCATTCTTAATGCCA GTTGAAGACGTATTTACTATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTT -3', et
3) une séquence consensus spécifiq ue tirée du gène 16S ARN ribosoma l de Clostrid iu m difficile du phylum Firmicutes, SEQ. ID N°20 =
5'-GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA
ACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGG -3'. Les séquences amorces sens et les séquences inverses complémenta ires de l'amorce antisens sont encadrées et les séquences sondes sont encadrées et en italique.
Les séquences SEQ. ID. N° l à 20 décrites ci-dessus sont spécifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description.
A la position correspondant à un nucléotide H, N, R, T ou Y da ns les séquences SEQ. ID. N0IO, 13, 15, 18 et 19, on trouve, dans les séquences cibles complémentaires, des nucléotides variables comme défini ci-dessus.
Les oligonucléotides de séquences SEQ. ID. N°10, 13, 15, 18 et 19 sont donc mis en œuvre, en fait, sous forme de mélanges équ imolaires d'oligonucléotides de séquences différentes, lesd its oligonucléotides de séquences différentes répondant pou r chaq ue séquence SEQ. ID. n° 10, 13, 15, 18 et 19 aux diverses définitions possibles des séquences respectivement n°10, 13, 15, 18et 19, à savoir :
- un mélange équ imolaire de 3 séquences différentes pour SEQ. ID. N0IO pou r lesq uelles H est A, C et respectivement T,
- un mélange équ imolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°13 pour lesquelles Y est C et respectivement T,
- un mélange équ imolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°15 pour lesquelles R est A et respectivement G,
- un mélange équ imolaire de 4 séquences différentes pour SEQ. ID. N° 18, pou r lesq uelles KY sont respectivement GC, GT, TC, et TT,
- un mélange équ imolaire de 4 séquences différentes pour SEQ.
ID. N°19 pour lesquelles N représente A, T, C et respectivement G (lorsque N représente l'u n de A, T, C ou G. En revanche, lorsque N est I (inosine), l'oligonucléotide présente u ne seu le séquence.) Ces mélanges éq uimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en œuvre, lors de la synthèse oligonucléotidique, des mélanges éq uimolaires des d ifférents nucléotides concernés.
Plus particu l ièrement, pour l'ampl ification de ladite séq uence spécifique du phylum Bacteroidetes, on réalise l'étape d'hybridation des amorces et d'élongation à 48°C.
De préférence, on met en œuvre un g rand fragment synthétiq ue d'ADN servant de sta ndard de quantification, ce standa rd qu i contient les séq uences spécifiques des différentes cibles moléculaires sélectionnées précédemment. La présence de plusieurs cibles sur le même fragment permet de q uantifier des cibles différentes dans le même échantil lon et de les co-quantifier de façon homogène en util isant la même gamme d'étalonnage pou r détecter des cibles moléculaires différentes dans la mesu re où les contraintes du choix des amorces et de la sonde le permettent. Cette gamme d'étalonnage conservée dans le temps est le garant de la stabilité d u système de quantification. Cette ga mme d'étalonnage est dil uée de 107 à 1 copies de chacu ne des cibles moléculaires pour 5 μl d'échantil lon d'ADN .
Avantageusement, lesdites concentrations Fi (bactérie du phyla Firmicutes), Ba (bactérie du phyla Bacteroidetes) ou La (bactérie Lactobacillus sp) sont déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séq uences spécifiq ues des bactéries du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus.
De préférence, on détermine lesdites concentrations de bactéries par co-amplification enzymatique du type PCR en temps réel desdits fragments d'ADN de séq uences spécifiq ues respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacil lus contenus d'u ne pa rt dans ledit ADN extrait de l'échantillon, et d'a utre part dans des écha ntillons d'ADN synthétiques comprenant chacune desdites séquences spécifiq ues desdites bactéries servant de standards d'étalonnage de quantification de l'ADN, lesdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus présentant une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides.
La détection et la quantification desdits fragments amplifiés sont réalisées à l'aide de sondes marquées de séquences distinctes de celles des amorces d'amplification et encadrées par celles-ci, pour chacun desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus, les marqueurs des différentes sondes sont des marqueurs différents entre eux, notamment les marqueurs fluorescents connus de type VIC et FAM.
Plus particulièrement, lesdites séquences consensus spécifiques desdites bactéries sont tirées de :
- pour le phylum Firmicutes : un fragment du gène 16S ARN ribosomal de Clostridium difficile aux positions 1026 à 1203 dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II ((http://rdp.cme. msu .edu/) est S000260455.
- pour le phylum Bacteroidetes : le fragment des positions 537 à 721 du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides fragilis dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II est S000000037.
- pour les bactéries du genre bactérie Lactobacillus, une séquence de 90 bases, commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation aux positions 253 à 343 du gène de référence GenBank AY 5621 91.1.
- Pour l'Archae Methanobrevibacter smithii, une séquence de 123 bases du gène 16S ARNr spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii en position 740 à 862 du gène 16S ARNr de référence Genbank CP000678. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.
La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard de quantification.
On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR.
Au total, les résultats cliniques conduisent les inventeurs à estimer qu'un procédé de détermination du statut de la flore intestinale d'un individu comprend avantageusement la quantification des deux phyla Bactéroïdes et Firmicutes, d'une part, et, d'autre part, des bactéries du genre Lactobacillus et de l'espèce Methanobrevibacter smithii.
Ainsi, on réalise la quantification des quatre dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et de préférence du phylum Firmicutes.
De préférence encore, on met en œuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries procaryotes. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les co-quantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'u ne détermination à l'autre au cours d u temps et évite les biais liés au témoin positif.
Pl us particu lièrement, on met en œuvre un gra nd fragment synthétique d'ADN serva nt de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit g rand fragment d'ADN synthétiq ue reg roupant des dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacil lus, de phylum Bacteroidetes, et de préférence de phylu m Firmicutes, de préférence encore inséré dans un plasmide.
Da ns les méthodes de quantification d'ADN pour PCR en Temps Réel, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination pa r le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pou r résoudre ce problème, un site de coupure pa r u n enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séq uence natu rel le. Donc, par coupu re enzymatiq ue et analyse du fragment amplifié su r gel d'agarose, ou en utilisant u ne sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiq uement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide conta minant.
Ainsi, on peut mettre en œuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles :
1. on réa lise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'a u moins une dite séq uence spécifiq ue d'au moins un desd its agents, da ns l'ADN extrait desdits échantillons selon l'invention à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'éta lonnage, à l'aide d'a u moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentiq ue et ladite séquence spécifique mod ifiée;
2. on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits écha ntillons à tester, comprennent u ne d ite séquence spécifique, et 3. on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de I1ADN provena nt de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des éta pes suivantes :
3a . on réalise une digestion enzymatique du produ it de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse su r gel d'agarose du produit de digestion en compara ison avec le prod uit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction .
Si le fragment digéré provient de l'a mplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'u ne taille inférieure au frag ment non digéré.
3b. on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'u ne des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séq uence exogène contenant le site de restriction.
Seu l un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié.
Avantageusement encore, on réal ise des réactions d'amplification et de q ua ntification en mettant en œuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hyd rolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séq uences spécifiques de chacune desd ites bactéries à tester, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantil lon à tester, telle que u ne séquence spécifiq ue de l'albu mine hu maine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encad rée par des séquences aptes à servir comme amorce dans u ne réaction d'a mpl ification du type PCR desd ites séquences spécifiq ues.
Avantageusement encore, on met en œuvre u ne pluralité de réactions d'ampl ifications enzymatiq ues PCR simultanées ou non de chacu ne desdites séquences spécifiques desd ites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétiq ue étalon, à l'aide d'u ne plu ralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes dites bactéries et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation.
On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine diverses, notamment la méthode décrite dans FR 2 882 063 dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant :
- une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation desdits oligonucléotides, suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre déterminé lesdits oligonucléotides, les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et anti-sens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas échéant, et
une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit grand premier fragment. Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles (dimérisation des amorces). Ce phénomène est observé dans le cas où les conditions de PCR, notamment de température, sont mal adaptées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires.
La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une alternance d'oligonucléotides de séquences directes («sens») ou inverses (encore dénommées « reverses » ou «anti-sens»). Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la séquence d'un oligonucléotide une séquence nucléotidique complémentaire des premiers nucléotides de l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides seront hybrides par leur parties complémentaires, et grâce à l'activité polymérasique, par exemple de la Taq polymérase, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins. Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe et inverse correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré.
Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques, sont avantageusement insérés dans un plasmide.
Cette technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode simple à mettre en œuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux.
La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic et suivi du rapport Firmicutes/Bacteroidetes dans les prélèvements de selles selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend :
des échantil lons d'ADN standard d'étalonnage à u ne concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacu n desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, et de préférence encore u n dit g rand fragment d'ADN synthétiq ue regrou pa nt desdits séquences spécifiques de chacu n desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séq uence bactérienne universelle telle q ue définie ci-dessus, ainsi que
- desd its jeux d'amorces spécifiq ues desdits fragments d'ADN synthétiques mod ifiés spécifiques desd ites bactéries et de préférence encore, desdites sondes tels que définis ci-dessus, et
- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR.
Da ns u n mode de réalisation particu lier, on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de la bactérie
Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacil lus, du phylum
Bacteroidetes et respectivement du phylu m Firmicutes, pour assurer le diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'u n individu .
La méthode de quantification selon l'invention permet de corréler le suivi du statut pondéral d'une personne au suivi des teneu rs en bactéries BA (Bacteroidetes), FI (Firmicutes), LA (Lactobacillus) et M . (Methanobrevibacter smithii), notamment comme suit :
- pour les patients sou mis à u n tra itement antibiotiq ue au long cours, u ne diminution de BA (Bacteroidetes) et une aug mentation de LA (Lactobacillus) représente un risque de prise de poids, sous réserve q ue LA (Lactobacillus) soit supérieur à 106. pour les patients anorexiques, u ne diminution de Methanobrevibacter smithii peut être ind icatrice d'u ne l'évolution favorable de cette pathologie, spontanément ou sous l'effet d'actions thérapeutiq ues médicamenteuses ou non-médicamenteuses- pour les obèses en cours de tra itement pharmaceutique, une aug mentation de BA (Bacteroidetes) et une diminution de LA (Lactobacillus) peuvent être un ind icateur de bonne évolution du traitement.
Enfin, des complémentations ou traitements spécifiques au regard des bactéries concernées peut également contribuer à la thérapeutiq ue des sujets concernés en cherchant à diminuer spécifiquement le taux de M. (Methanobrevibacter smithii) chez les anorexiques, et aug menter le taux de BA (Bacteroidetes) et diminuer le taux de LA (Lactobacill us) chez les obèses ou les personnes en traitement antibactérien en long ue du rée.
La présente invention fournit également une trousse de détection comprenant des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'ampl ification d'ADN de type PCR et au moins un jeu d'ol igonucléotides amorces et de préférence en outre au moins u n oligonucléotide sonde d'hydrolyse utile pour u ne détection et quantification par a mpl ification par PCR, de préférence par PCR en Temps Réel, comprenant au moins des cou ples d'oligonucléotides amorces, a ptes à a mpl ifier :
au moins u ne séquence spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii, et
- au moins u ne séquence choisie pa rmi :
1) une séquence consensus spécifiq ue du phylum
Bacteroidetes, et
2) u ne séq uence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacill us, et 3) une séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes.
Pl us particul ièrement, ladite trousse comprend a u moins l'u n des deux cou ples d'oligonucléotides amorces et, de préférence au moins l'un des oligonucléotides sondes d'hyd rolyse, aptes à amplifier l'u ne au moins desd ites séquences de Methanobrevibacter smithii tirées du gène
16S de l'ARN ribosomal et respectivement du gène rpoB suiva nts :
a) le couple d'oligonucléotides a morces de séquences SEQ. ID N°2 et SEQ. ID N°3 et, de préférence l'ol igonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°4, et
b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°6 et SEQ. ID N°7, et de préférence l'ol igonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. I D N°8.
Pl us particu l ièrement, u ne trousse selon l'invention comprend les couples d'oligonucléotides amorces avec de préférence les oligonucléotides sondes d'hydrolyse, su ivants :
a) le couple d'oligonucléotides a morces de séquences SEQ. ID N°9 et SEQ. I D N°10, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°l l pour l'amplification d'une séquence consensus spécifiq ue du phylu m Bacteroidetes et,
b) le cou ple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. I D N°13 et SEQ. ID N°14, avec de préférence u n oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°15 pou r l'amplification d'u ne séquence consensus spécifiq ue de bactéries du genre Lactobacill us et,
c) de préférence, le cou ple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°17 et SEQ. ID N°18, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°19 pou r l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes. Plus particulièrement encore, une trousse comprend en outre :
- des échantillons d'ADN standard d'étalonnage comprenant desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, de bactéries du genre Lactobacillus, phylum Bacteroidetes, et de préférence phylum Firmicutes, tel que défini ci-dessus, et
- de préférence, un dit grand fragment d'ADN synthétique tel que défini ci-dessus.
De préférence, une trousse comprend des réactifs d'extraction comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique.
La présente invention fournit également une méthode caractérisée en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles :
1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, de préférence à une dilution de 50 à 150 g/1, et
2) on réa lise une lyse mécaniq ue par méla nge et agitation de lad ite suspension de l'étape 1 avec u n prod uit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, et, de préférence, on réal ise une étape de chauffage à 100°C penda nt 10 minutes, et
3) on réalise une lyse chimiq ue et/ou enzymatique par méla nge et ag itation de la suspension obtenue à l'étape 2) avec u n ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatiq ue, puis
4) on répète l'étape 2) avec le mélange obtenu à l'étape 3), et
5) de préférence, on répète l'étape 3) avec le mélange obtenu à l'étape 4) . De façon connue, on sépare in fine l'ADN soit avec des méthodes connues telles q ue par fixation sur une colonne contena nt du sil icate pu is lavage pou r él uer ladite ADN en le sépara nt de la colonne ou par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN .
La réa lisation de la première étape de lyse méca nique permet d'optimiser et de favoriser le trava il d'agents chimiques ou enzymatiques de lyse à l'étape 2) en favorisant leur pénétration dans les micro-organismes proca ryotes permettant de dégrader partiellement les parois épaisses des micro-organismes procaryotes à paroi épaisse, et la dégradation totale des pa rois épa isses est obtenue seulement par au moins une deuxième lyse mécanique après ladite première lyse chimique ou enzymatique.
A l'étape 2), le chauffage à 1000C permet de final iser la dégradation des composants des parois et membranes des microorgaπismes.
D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la l umière de la description détaillée q ui va suivre de différents exemples de réal isation en référence au listage de séq uence et aux figu res 1 à 4.
- La figu re 1 représente en ordonnée le pou rcentage de séquences
16S de l'ARN ribosomal et en abscisse les résu ltats pour les bactéries du phylu m Firmicutes (FI), puis les bactéries du phyl um Bacteroidetes (BA) . Les taux de sensibilité sont représentés par la première colonne en traits fins, à savoir 88,94% pour des bactéries du phylum Firmicutes et 89,89% pour les bactéries d u phylu m Bacteroidetes. Les taux de spécificité sont représentés par la deuxième colonne en g ras, à savoir 0,83% pour les bactéries du phyl um Firmicutes et 0,01% pour les bactéries du phylum Bacteroidetes.
Les valeurs entre parenthèses indiquent le nombre de séquences hybridant dans le phylum étud ié (sensibilité) et en dehors du phylum étudié (spécificité) . - La figu re 2 représente la quantification des bactéries du phylum Bacteroidetes dans les sel les collectées chez trois groupes d'ind ividus obèses (O), individus contrôle (L) et anorexiques (A).
Le nombre de copies de bactéries Bacteroidetes et porté en Ordonnée et la valeur P inférieure à 0,05 est représentée par le sig ne « * » et la valeur P inférieu re à 0,01 est représentée par « ** ».
La croix indique la moyenne ; le trait horizontal la médiane et le cu be représente la distribution des valeu rs dans l'écart type.
- La figure 3 représente la distribution des q uantités supérieures à 106 de nombre de bactéries du genre Lactobacillus détecté et quantifié pa r le procédé selon l'invention dans les selles d'individus anorexiques (A), obèses (O) et contrôle (L).
Les chiffres en ordonnée représentent le nombre d'individus.
Sur la figure 3, I I représente le nombre de copies de Lactobacillus supérieur ou égal à 106, et I I représente le nombre de copies de Lactobacillus inférieur à 106.
La fig ure 4 représente la quantification de l'Archea Methanobrevibacter smithii selon le procédé de l'invention dans les selles des individus anorexiq ues (A), obèses (O) et contrôles (L).
La figu re 4 représente l'écart type (hauteu r du trait vertical) et la moyenne (plateau du cube), les chiffres en ordonnée étant le nombre de copies moyen de Methanobrevibacter smithii .
EXEM PLE N °l. Protocole d'extraction d'ADN selon l'invention et comparaison avec le protocole de référence publié dans la littérature, pour la détection de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les sel les.
L'Archae Methanobrevibacter smithii est un méthanogène, c'est à dire une Archae susceptible de transformer les produits de la digestion des aliments en méthane CH4. Cependant, Methanosphaera stadtmanae est également une Archae métha nogène détectée dans les sel les. Les inventeurs ont parié sur le fait que, éta nt donné l'importance de la réaction biochimique de méthanogenèse pou r la physiologie intestinale, l'Archae Methanobrevibacter smithii et non pas Methanosphaera stadtmanae était présente et détectable dans les selles chez tous les ind ividus. Cette hypothèse a été ensu ite vérifiée et les inventeurs ont observé que Methanobrevibacter smithii était effectivement détectée chez presque tous les individus en combinant la détection du gène 16S ARN ribosoma l avec celle du gène rpoB alors que Methanosphaera stadtmanae n'est détectée que chez moins de 40% des individus en utilisant le même système. Afin de tester cette hypothèse, les inventeurs ont imag iné devoir lyser la paroi des Archae, afin de libérer l'ADN des Archae pour le rendre accessible à la détection moléculaire basée sur la technique PCR. Dans ce but, les inventeu rs ont mis en place par tâtonnements successifs le protocole su ivant. Dans u n premier temps, les inventeurs ont lysé mécaniquement les prélèvements par ag itation en présence de poudre de verre, suivie d'u ne lyse chimiq ue, puis ils ont extrait l'ADN . Les résultats ont montré que seu lement 4/10 (40%) des prélèvements de selles provenant de 10 individus différents présentaient une détection positive de l'ADN de Methanobrevibacter smithii. Afin d'amél iorer encore l'efficacité du protocole, les inventeurs ont alors imaginé d'ajouter une deuxième étape de lyse mécaniq ue par la poudre de verre et ont obtenu u ne détection de l'ADN de Methanobrevibacter smithii dans 10/10 (100%) des mêmes prélèvements de selles. Egalement, l'ajout d'une deuxième étape de lyse méca nique a permis de façon imprévue d'augmenter de un à deux log . le seu il de détection des prélèvements positifs par PCR temps-réel .
Un protocole objet de l'invention est donc le suivant :
1- environ 500 mg de sel les sont suspendus dans 5 ml de tampon Tris-HCL 0,05M pH7,3 le mélange est homogénéisé par agitation manuel le et au vortex jusqu'à obtenir u ne suspension quasiment homogène;
2- 250 μl de suspension sont introduits dans un tu be à vis de 1,5 ml contenant 0,3 g (équivalent à un volume de 10 μ l environ, soit inférieur à 4% d u volu me final) de poudre de verre dont les pa rticules mesu rent moins de 106 μm et sont lavées à l'acide pour éliminer les g raisses, les acides nucléiq ues et les DNAses et les RNAses qui proviennent éventuellement des procédés de fabrication des billes de verre (référence G4649, Sigma, Saint Quentin Fallavier, Fra nce) et ag ités dans le Fast Prep BIO 101 (Qbiogene, Strasbou rg, France) à la vitesse maximale (6,5) pendant 90 secondes;
3- la préparation est ensuite chauffée à 100°C pendant 10 minutes puis ramenée à la température a mbiante. Ensuite, u n protocole standard du Kit NucleoSpin® Tissue Mini Kit (Macherey Nagel, Hoerdt, France) et utilisé comme suit. On ajoute 180μl_ de tampon de lyse Tl et 25μl de protéinase K à 20 mg/ml . Le mélange est incubé à 56°C toute la nuit;
4- puis, on réa lise une deuxième lyse mécaniq ue comme décrite ci-dessus;
5- pu is, on réalise u ne lyse chimique de tampon de lyse d'ADN connus, à savoir 200μl de tampon B3 (mélange en proportions égales des tampons Bl [Guanid ine hydrochloride] et de tampon B2 de composition disponible auprès d u fournisseur) sont ajoutés et le méla nge est incu bé 10 minutes à 700C, ajouter 200μl d'éthanol, méla ngé, appliqué sur une colonne de silice, centrifugé 1min à vitesse maximale, lavé avec 500μl de tampon BW, centrifugé 1 minute à vitesse maximale, lavé avec 600 μl de ta mpon B5 centrifugé 1 minute à vitesse maximale;
6- puis, on dépose lOOμl de ta mpon BE préchauffé à 700C au centre de la colonne, et on laisse incuber à température ambiante 1 à 2 minutes puis éluer l'ADN pa r centrifugation 1 minute à vitesse maximale. Un témoin négatif d'extraction de 250 μL d'eau stérile est introdu it dans chaque série de prélèvements. Les ADN sont conservées à -20°C jusq u'à utilisation. Ils seront alors testés purs et dil ués au 1/10 et au 1/100 afin de mettre en évidence la présence éventuelle d'inhibiteurs de la PCR.
Cette phase de mise a u point étant faite, les inventeu rs ont comparé le protocole objet de l'invention avec le protocole de référence pour l'extraction de l'ADN des procaryotes à partir des selles. Pou r cela, les inventeurs ont collecté 50 échantillons de selles collectés chez 50 ind ividus ayant soumis des selles pour exploration d'une diarrhée. Ces 50 échantillons de sel les ont bénéficié d'une extraction d'ADN en pa rallèle par le protocole objet de l'invention et en utilisant le kit d'extraction QIAAM P Stool DNA mini kit (Qiagen, Courta boeuf, France) décrit dans la littératu re [Eckburg PB. et Al . Diversity of the hu man intestinal microbial flora . Science 2005 Vol ume 308 page 1635- 1638] .
Les principales étapes d u procédé d'extraction d'ADN de référence du kit QIAAM P sont :
1) dilution du prélèvement de selles dans un tampon de type PBS à pH = 7.4 (2) et,
2) incubation u ne nu it à 56°C, en présence de protéinase K,
3) inactivation de la protéinase K par chauffage à 70°C pendant
10 minutes, et
4) extraction de l'ADN total par filtration sur la colonne de sil icate.
Dans cet exemple, les inventeu rs ont comparé le nombre de copie de gène 16S ARN r et d u gêne rpoB par ml de sel les en util isant les deux protocoles d'extraction. Les données nu mériques ont été analysées en util isant le test non-para metric de Kruskal-Wall is dans le log iciel EPIIN FO version 3.4. 1 (center sur dix contrôlant and prévention, Atlanta, GA). Les valeurs P ont été utilisées pour montrer des différences significatives entre les deux méthodes et ont été calcu lées en utilisant la méthode non paramétrique de Kruskal-wallis pour 2 groupes. Une va leur P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.
En utilisant la méthode de quantification par PCR, commercialisée
Qiagen, le gène 16S ADNr de Methanobrevibacter smithii a été détecté chez 44/50 (90%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 33/50 (66%) des individus. En utilisa nt le protocole objet de l'invention décrit à l'exemple 2, le gène 16S ARN ribosomal a été détecté selon la même méthode de détection et quantification avec les amorces SEQ. ID. n° 6 et 7 et la sonde SEQ. ID. n°8 décrite dans l'exemple 2, chez 50/50 (100%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 49/50 (99%) des individus avec les amorces SEQ. ID. n°2 et 3 et la sonde SEQ. ID. n°4. A partir d'u n gramme de sel les, le protocole d'extraction objet de l'invention a permis de détecter entre 2 et 3 logarithmes de pl us de copie d'ADN q ue le protocole commercia lisé Qiagen avec une valeu r P inférieure ou égale à 0,00001 pour les deux gènes ana lysés. Dans cet exemple, les contrôles négatifs sont restés strictement négatifs. Ces résultats montrent la supériorité du protocole d'extraction selon l'invention, par rapport à un protocole d'extraction habituellement utilisé et commercialisé, tant en nombre d'ind ividus détectés positifs, qu'en q ua ntité d'ADN détecté.
La q ua ntification, dans les selles, des gènes 16S ARN ribosomal et rpoB de l'Archae Methanobrevibacter smithii, extra its par u n protocole d'extraction selon l'invention en comparaison avec un protocole d'extraction commercialisé par QIAGEN (France) donne (en logarithme) le nombre de copies pou r chacu n des deux gènes.
1) Gène 16SARN ribosomal,
- Protocole selon l'invention :
valeu r moyenne 2.05e10, écart-type = 6.13e+ 10, médiane =
2.73e06, - Protocole d'extraction QIAGEN :
valeur moyenne 2.66e07, écart-type = 1.18e08, médiane = 8.98e02,
valeur P = 0.00001
2) Gène rpoB :
- Protocole d'extraction selon l'invention :
valeur moyenne 5.11e , écart-type = 1.48e , médiane =
7.73e 05
- Protocole d'extraction QIAGEN :
valeur moyenne 6.67e05, écart-type = 3.36e07, médiane = 4e02,
valeur P = 0.00001
Pour la quantification de M. smithii, les inventeurs ont utilisé les séquences amorces SEQ. ID. n°2 et 3 et séquence sonde SEQ. ID. n°4 pour l'amplification du gène 16S de I1ARN ribosomal de M. smithii, et les séquences amorces SEQ. ID. n°6 et 7 et séquence sonde SEQ. ID. n°8 pour l'amplification du rpoB de M. smithii. Les inventeurs ont établi des courbes d'étalonnage de quantification par PCR suivantes pour la détection de M. smithii par amplification du gène 16S ARNr et du gène rpoB, à partir de quantités connues de M . smithii obtenues par culture de M . smithii sur gélose :
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Une étude ultérieure de 1 500 selles provenant de 1 500 ind ivid us différents a permis de déterminer u n seuil de détection de 104 organismes M . smithii par ml d'échantillon de selle, basé sur la détection combinée des gènes 16S ARNr et rpoB décrits ci-dessus. Une concentration su périeure à 104 organismes pa r ml M . smithii a été détectée chez 97% des individus. Pour les 3% restants, le seu il actuel de détection de 104 organismes par ml d'échantillon de selle par ml n'était pas atteint.
EXEM PLE N °2. Spécificité et sensibilité d u système de détection des micro-organismes appartenant aux groupes Firmicutes et Bacteroidetes dans les selles.
La détermination d'un système PCR en temps réel sur des clades bactériens Firmicutes et Bacteroidetes a nécessité plusieu rs mois de mise au point et de tâtonnements expérimentaux. Difficultés à la fois bioinformatiques et biotechnologiques. En effet, il s'agissait pou r les inventeurs de mettre au point u ne techniq ue de détection moléculaire des deux phyla bactériens numériquement les plus représentés par le nombre de séquences 16S ARN ribosomal dans les banques électroniques de séquences. En particulier, le phylum Firmicutes est représenté par plus de 94.000 séquences (soit le phyl um le pl us important sur 70 phyla représentés dans RDP-II)[CoIe J R, Chai B, Fa rris RJ, Wang Q, Kulam-Syed-Mohideen AS, McGa rrel l DM et al. : The ribosomal database project (RDP-II) : introducing myRDP space a nd quality control led public data. Nucleic Acids Res 2007, 35 : D169-D172] de 16S ARN ribosomal dans la base de données ribosomal RDP-II. Egalement, le phylum Bacteroidetes est représenté par plus de 34.000 séquences (seul le phyl um Protebacteria est pl us important que celui des Bacteroidetes) . Identifier u n système de 3 frag ments de séquences (amorces et sonde) ciblant la quasi-totalité des espèces des phyla Firmicutes et Bacteroidetes respectivement était u n véritable défi d'autant plus que le système se devait a ussi d'être spécifique ; à savoir qu'un minimum d'espèces en dehors du phylum considéré ne devait être détectable. Ces frag ments de séq uences éta nt déterminées, il a fall u les modifier et adapter les conditions expérimenta les afin que la sensibilité des réactions de PCR en temps réel soit optimale, et surtout qu'il n'y ait pas de détection croisée entre les différents systèmes d'amorces et de sondes dégénérées mises en jeux. Pu is, les spécificités ont été testées en utilisant le maximu m d'ADN de souches bactériennes de référence à différentes concentrations. Il fallait également, sans diminuer la sensibilité de la réaction de PCR, supprimer les fixations pa rasites sur le mil ieu réactionnel dues au fait q ue l'on qual ifie des bactéries qui sont présentes partout dans l'environnement et en grande quantité.
La d ifficu lté, l iée nota mment à la faible variabilité de la séquence nucléique d u gène 16S ARN ribosomal (beaucou p de régions conservées), était donc d'identifier des amorces de PCR et une sonde
(1) dans une rég ion limitée en taille (200 bases au maximu m pour être compatible avec u n système de détection par PCR en temps réel) (2) avec des températures d'hybridation en cohérence avec le système (au minimum 10°C su pplémentaires pour la température de fusion (Tm) de la sonde par rapport à celle des amorces) (3) avec des séquences nucléiq ues le plus faiblement dégénérées possible afin de conserver u ne possibilité d'hybridation de la sonde.
En prenant l'exemple d u système PCR en temps réel pou r le phylu m Firmicutes, plusieu rs mises a u point ont été nécessaires. La sonde ou signatu re de base d u clade Firmicutes déterminée in silico possédait en son cœur u ne suite de bases indéterminées (N) : TCATGCCN[16]ACA. Les inventeurs ont donc tâtonné pour allonger le motif TCATGCC et obtenir la spécificité ainsi perdue via le design des amorces et le tout dans une région devant correspondre à une amplification inférieure à 200 bases environ. Finalement le système PCR en temps réel mis au point pour le clade Firmicutes est une recherche de complémentarité entre les 3 éléments (amorces +sonde). Prise individuellement, chacune des séquences (amorces et sonde) est très sensible au clade Firmicutes mais pas forcément très spécifique. En revanche, la réunion des 3 séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°17, N°18 et N°19 confère une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel.
De même, les trois séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°9, N°10 et N°ll pour les bactéries Bacteroidetes confèrent également une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel.
Cette spécificité est montrée dans cet exemple dans lequel la séquence des amorces a été synthétisée par la société Eurogentec (Seraing, Belgique) et la séquence des sondes a été synthétisée par la société Applied Biosystem. Les réactions d'amplification PCR ont été réalisées sur un appareil MX3000™ System (Stratagene Europe, Amsterdam, Pays-Bas) en utilisant le kit QuantiTect PCR mix de la société Qiagen (Courtaboeuf, France) et 5 pmol de chaque amorce et sonde, 5 μl d'ADN extrait de chacune des 108 espèces bactériennes rapportées dans le Tableau 1 après dilution au 1/10, 1/100, 1/1000, le tout sous un volume réactionnel final de 25 μl. Le programme de PCR en temps réel comportait pour la détection des Bacteroidetes: 95°C 15 min, puis 45 cycles de 95°C 30s, 48°C 45s, 72°C 1 min), et, pour la détection des Firmicutes et des Lactobacillus et Methanobrevibacter smithii: 95°C 15min, puis 45 cycles de 95°C 30s, 60°C 1min. Les concentrations des quantités de sondes et d'amorces ont été adaptées pour chacun des systèmes afin de conserver leur efficacité, Les résultats indiquent que le système de détection des Bacteroidetes présente une sensibilité de 89.89% pu isqu'il détecte 30.237 des 33.639 séquences 16S ARN ribosomal des bactéries du phylu m Bacteroidetes dans la base de données RDP-II (Figu re 1) et que le système de détection des Firmicutes présente une sensibil ité de 88.94% puisqu'il détecte 83.576 des 93.969 séquences du gène 16S ARN ribosomal des bactéries d u phyl um Firmicutes de la base de données RDP-II. L'util isation des deux systèmes de détection Firmicutes et Bacteroidetes sur la base de données RDP-II excluant ces deux phyla ind iq ue un taux de détection faussement positive de 0,83% pour Firmicutes et de 0,01% pour Bacteroidetes.
De même, les systèmes des séquences SEQ. ID. N°2 et N°3 (amorces) et N°4 (sonde) pour le gène 16S de l'ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithii et les séquences SEQ. ID. N°6 et N°7 (amorces) et N°8 (sonde) pour le gène rpoB de Methanobrevibacter smithii, ainsi q ue les séquences SEQ. ID. N°13 et N°14 (amorces) et N°15 (sonde) pou r les séquences du gène tuf de Lactobacillus spp. décrites précédemment confèrent u ne gra nde spécificité (99%) et sensibilité (< 50 copies) pour une util isation dans la PCR en Temps Réel .
Les résultats d u tableau 1 sont exprimés en CT, à savoir le nombre de cycles d'amplifications nécessaires pour que l'ampl ification commence, cette valeur de CT en relation avec la concentration du produit nucléique à q uantifier, à savoir que pl us le CT est bas, pl us la concentration est élevée.
Pour la quantification, on a construit un plasmide d'étalonnage comprena nt u n g rand fragment d'ADN synthétique hybride contenant les séquences SEQ. I D. N°l, N°2, N°12, N° 16 et N°20, sous forme de frag ment d'ADN double-brins construit par réaction d'amplification, tel que décrit dans FR-2 882 063. On a créé une gamme plasmidique d'étalonnage de 107 dont une copie par puits, pour chaque réaction d'amplification, les dix points de la gamme plasmidique sont testés.
EXEM PLE N°3. Analyse des flores bactériennes et Archae par le procédé de l'invention et statut pondéral des individus.
Plusieurs travaux ont montré que la composition de la flore digestive jouait un rôle dans l'obésité, y compris des travaux expérimentaux chez la souris [Samuel BS, Gordon JI : A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103: 10011-10016; Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JI: Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102 : 11070-11075; Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI : An obesity- associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006, 444: 1027-1031]. En particulier, il a été montré que le ratio Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) était associé au phénotype obèse ou contrôle non-obèse, du à une réduction de la proportion de Bacteroidetes chez les personnes obèses, ce qui est étonnant car la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron a été associée à l'augmentation de l'obésité [Samuel BS, Gordon JI : A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103 : 10011-10016] . Il a été montré que, au cours d'un régime alimentaire amaigrissant, la diminution du ratio F/B chez les patients obèses sous régime était corrélée avec la perte de poids, suggérant que la modulation de ce ratio pouvait constituer une intervention thérapeutique [Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI: Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 2006, 444: 1022-1023]. Les promoteurs de la prise de poids comme les bactéries du genre Lactobacillus pourraient être impliqués dans ces interventions thérapeutiques, leur rôle ayant été montré dans l'engraissement des animaux de rapport [Khan M, Raoult D, Richet H, Lepidi H, La Scola B: Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Cependant, la mesure du ratio F/B n'est réalisée actuellement que par des méthodes de métagénomiques, de puce ADN et de séquençage de larges librairies de clones du gène 16S ARN ribosomal, qui sont du domaine de la recherche mais ne sont pas applicables en routine diagnostique. Les inventeurs ont donc pensé utiliser l'invention pour déterminer de manière fiable le ratio F/B par une technique de PCR temps réel, applicable en routine. Après avis favorable du Comité d'Ethique, la technique de quantification selon l'invention a été appliquée à une population de 20 personnes obèses (17 to 72 ans; indice de masse corporelle IMC= 47.09± 10.66), de 20 personnes contrôles (non-obèses, non-anorexiques ; (13 to 68 ans; IMC = 20.68±2.014) et de 9 personnes présentant une anorexie mentale (19 to 36 ans; IMC= 12.73 ± 1.602).
Les résultats (Tableau 2) indiquent que la quantification des
Firmicutes est comparable pour les trois groupes. Les inventeurs ont donc observé que contrairement aux données publiées dans la littérature, les selles des personnes obèses présentent une plus faible quantité de Bacteroidetes (Figure 2) avec une différence statistiquement significative entre le groupe obèses et contrôles d'une part (** p<0.01), et entre le groupe anorexie et contrôle, d'autre part (*p<0.05). Le nombre de Lactobacillus est plus élevé chez les personnes obèses bien que la différence avec les deux autres groupes ne soit pas statistiquement significative. Cependant, en utilisant une valeur seuil de 106 Lactobacillus, la différence du nombre de Lactobacillus entre personnes obèses et contrôles (p = 0.0197) et anorexiques (p= 0.0332) est significative (Figure 3).
La détection systématique et la quantification de
Methanobrevibacter smithii ont permis aux inventeurs d'observer que le nombre de Methanobrevibacter smithii (Figure 4) est plus élevé chez les obèses que chez les contrôles avec un ratio obèses/contrôles de 1.72 mais cela de façon non statistiquement significative. En revanche, les inventeurs ont observé de façon imprévue que le nombre de Methanobrevibacter smithii était plus important chez les anorexiques, d'un facteur 3 et 5 respectivement par rapport aux contrôles et aux obèses et que la quantité de Methanobrevibacter smithii était significativement plus importante chez les anorexiques que chez les obèses (p = 0.0501). Le taux de Methanobrevibacter smithii est donc intéressant à relever pour une personne suspectée d'anorexie. Au total, les obèses ont une flore digestive pauvre en Bacteroidetes et riche en Lactobacillus. La flore des anorexiques est similaire à celle des contrôles pour les quantités de Firmicutes, Bacteroidetes et Lactobacillus mais contient plus de Methanobrevibacter smithii. Le procédé de détection et de quantification des composants bactériens du microbiote utilisé et proposé par les inventeurs, permet la détection et la quantification spécifique, fiable, rapide et répétitive de ces quatre groupes de microorganismes dans un grand nombre d'échantillons de selles. Ce procédé peut être très facilement utilisé en pratique courante dans les laboratoires.
Tableau 1. Liste des ADNs microbiens utilisés pour déterminer la sensibilité / spécificité des PCRs en temps réel pour la détection des microorganismes appartenant aux groupes Firmicutes et Bacteroidetes, dans les selles.
A = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Bacteroidetes.
B = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Firmicutes.
(Les résultats sont exprimés en Ct; les valeurs en caractères gras indiquent les espèces bactériennes pour lesquelles il existe un défaut de spécificité du système).
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Tableau 2. Quantification, selon le procédé de l'invention, des bactéries des phyla Bacteroidetes, Firmicutes, Lactobacillus et de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles de 49 individ us contrôles (lean), obèses (Ob) ou présentant u ne maigreur liée à une anorexie mentale (ano).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant le cas échéant l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, caractérisé en ce que l'on contrôle la qualité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on détecte un ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii, de préférence quantifié à un taux d'au moins 104 organismes M. smithii/ml de dit échantillon de selles.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on quantifie le nombre de copie d'ADN d'au moins une séquence d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative, choisie parmi les séquences spécifiques suivantes :
- une séquence tirée du gène tirée du gène 16S de l'ARN ribosomal, SEQ. ID. N°l =
5 '-CCGGGTATCTAATCCGGTTCG CG CCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTC
AGAATCGTTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGA
ATTTCACCTCTACCCTGGGAG -3', et,
- une séquence tirée du gène rpoB, SEQ. ID. N°5 =
5'-AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAAC CCCAGAGGGTCCTAACTGTGGTC -3'
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'on quantifie le nombre de copies dudit ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative en temps réel comprenant la co-amplification enzymatique de type PCR d'une séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii contenue d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon de selles, et d'autre part dans un échantillon des fragments d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii étant choisie parmi les séquences suivantes ou leurs séquences complémentaires :
• une séq uence du gène 16S ARN amplifiable par les séquences amorces suivantes :
- Amorce sens, SEQ. ID. N°2 : 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3', et
- Amorces antisens, SEQ. ID. N° 3 : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3', et
• u ne séq uence du gène rpoB amplifiée par des amorces de séquences suivantes :
- Amorce sens, SEQ. ID. N°6 : 5'- AAGGGATTTGCACCCAACAC -3', et
Amorces antisens, SEQ. ID. N°7 : 5'-
GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'.
4. Méthode selon l'u ne des revendications 1 à 3, caractérisée en ce q ue l'on quantifie au moins deux séquences spécifiq ues de Methanobrevibacter smithii tirées respectivement du gène 16S ARN ribosomal et du gène rpoB.
5. Méthode selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on réalise une réaction d'amplification et quantification par PCR en
Temps Réel, en mettant en œuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de
Methanobrevibacter smithii, à savoir :
1) pour la séquence d u gène 16S ARN ribosomal,
SEQ. ID N°4 = 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3', et
2) pour la séquence du gène rpoB, SEQ. ID N°8 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3', et
- u n g rand fragment d'ADN synthétique servant de sta ndard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit g rand frag ment d'ADN synthétique regroupant des d ites séquences spécifiques, de préférence sous forme de plasmide, avec une plu ral ité d'échantillons de grand fragment d'ADN synthétique de concentrations différentes connues.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'on quantifie en outre conjointement dans ledit ADN extra it dudit échantillon de selles, au moins u ne séquence spécifique choisie pa rmi :
1) u ne séquence consensus spécifique du phylu m Bacteroidetes, et
2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et
3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce q ue l'on réalise u ne méthode d'amplification quantitative par PCR à l'aide des amorces su ivantes :
• pour lad ite séq uence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes :
- amorces sens : SEQ. ID N°9 = 5'-AGCAGCCGCGGTAAT-3',
- amorces antisens : SEQ. I D N° 10 : 5'-CTAHGCATTTCACCGCTAC- 3',
• pour lad ite séquence consensus spécifique de Lactobacill us spp. :
- amorces sens : SEQ. ID N°13 = 5'- TACATYCCAACHCCAGAACG - 3', dans laquelle Y désigne C ou T, H désig ne A ou C ou T, et
- amorces antisens :
SEQ. ID N° 14 = 5' AAGCAACAGTACCACGACCA -3'.
• pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes :
- amorces sens : SEQ. ID N° 17 = 5'- GTCAGCTCGTGTCGTGA-3', et
- amorces antisens : SEQ. I D N° 18 = 5'-CCATTGTAKYACGTGTGT- 3'
dans laquelle K désigne G ou T et Y désigne C ou T.
8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle on met en œuvre des réactions d'a mplification et quantification par PCR en temps réel à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques choisies parmi les séquences suivantes :
1) pour ladite séquence spécifique du phylu m Bacteroidetes :
SEQ. ID N0 I l = 5'-GGGTTTAAAGGG-3'
2) pour lad ite séq uence consensus spécifiq ue de Lactobacill us spp. :
SEQ. ID N° 15 : 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3',
dans laq uelle R désigne A ou G.
3) pour ladite séquence consensus spécifiq ue du phylum
Firmicutes :
SEQ. ID N° 19 : 5'-GTCAANTCATCATGCC-S',
dans laquelle N désigne, soit I, soit A, T, C ou G.
9. Méthode selon l'u ne des revendications 6 à 8, caractérisée en ce q ue l'on réal ise la quantification des quatre dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacillus, d u phylum Bacteroidetes et de préférence du phylum Firmicutes.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce q ue l'on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de la bactérie Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et respectivement du phylum Firmicutes, pou r assurer le diag nostic et/ou le suivi du statut pondéral d'u n individu .
11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que pou r réal iser l'extraction de l'ADN proca ryote dudit échantil lon de selles, on réal ise les étapes dans lesq uelles :
1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles da ns une solution tampon, de préférence à u ne dilution de 50 à 150 g/1, et
2) on réal ise une lyse mécanique par mélange et agitation de lad ite suspension de l'étape 1 avec u n prod uit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, et, de préférence encore, on chauffe la suspension obtenue à 100°C pendant 10 minutes, et
3) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et ag itation de la suspension obtenue à l'étape 2 avec u n ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatiq ue, puis
4) on répète l'étape 2) de lyse mécanique avec le mélange obtenu à l'étape 3), et
5) de préférence, on répète l'étape 3) de lyse chimiq ue et/ou enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 4) .
12. Trousse de détection utile pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR et au moins un jeu d'oligonucléotides amorces et de préférence en outre au moins un oligonucléotide sonde d'hydrolyse utile pour une détection et quantification par amplification par PCR, de préférence par PCR en Temps Réel, comprenant au moins des couples d'oligonucléotides amorces, aptes à amplifier :
au moins une séquence spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii, et
- au moins une séquence choisie parmi :
1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et
2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et
3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
13. Trousse selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'un des deux couples d'oligonucléotides amorces et, de préférence au moins l'un des oligonucléotides sondes d'hydrolyse, aptes à amplifier l'une au moins desdites séquences de Methanobrevibacter smithii tirées du gène 16S de l'ARN ribosomal et respectivement du gène rpoB suivants :
a) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°2 et SEQ. ID N°3 et, de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°4, et
b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°6 et SEQ. ID N°7, et de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°8.
14. Trousse de détection selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend les couples d'oligonucléotides amorces avec de préférence les oligonucléotides sondes d'hydrolyse, suivants :
a) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°9 et SEQ. ID N°10, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°l l pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes et,
b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°13 et SEQ. ID N°14, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°15 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus et,
c) de préférence, le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°17 et SEQ. ID N°18, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°19 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
15. Trousse de détection selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend des réactifs d'extraction comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou eπzymatique.
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