FR2945545A1 - Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, notamment pour la détermination moléculaire de la composition de la flore intestinale dans les selles. Selon l'invention, on contrôle la qualité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on détecte un ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii et on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de l'Archae Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et respectivement du phylum Firmicutes, pour assurer le diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'un individu. La présente invention fournit une méthode pour réaliser l'extraction d'ADN procaryote dans des selles.
Description
Méthode de détection d'ADN procaryote extrait d'un échantillon de selles La présente invention concerne une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, notamment pour la détermination moléculaire de la composition de la flore intestinale dans les selles. La présente invention concerne également une trousse de détection et quantification d'ADN utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection et quantification d'ADN selon l'invention. Il est utile de pouvoir déterminer la composition de la flore intestinale (ici appelée microbiote ou microbiote intestinal) chez l'homme car cette flore intervient dans les processus physiologiques de la digestion des boissons et des aliments, et son rôle est soupçonné ou étayé dans différents processus pathologiques digestifs et extra-digestifs. Par exemple, le rôle du microbiote intestinal dans l'obésité est un sujet d'actualité [Turnbaugh P3 et al. û A core gut microbiome in obesity an lean twins. Nature 2009 ;457 : 480-4]. En effet, le statut pondéral d'un individu est le résultat du nombre de calories ingérées (rôle de l'alimentation), du nombre de calories extraites lors de la digestion (rôle du microbiote intestinal), du nombre de calories stockées (rôle des tissus adipeux) et du nombre de calories dépensées (rôle des efforts physiques). Il est maintenant connu que toutes les espèces microbiennes du microbiote intestinal n'ont pas la même capacité à extraire les calories apportées par l'alimentation, certaines espèces ou groupes d'espèces (ici désignés phyla) étant capables de convertir par une cascade de réactions biochimiques, les calories contenues dans les aliments et les boissons, mieux que d'autres espèces ou d'autres phyla.
Par exemple, il existe de nombreuses évidences que la composition du microbiote intestinal chez la souris influence la prise de poids y compris chez les souris qui n'ont pas de fond génétique obèse (Leptine -) [Turnbaugh P3 et al. û An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006 ;444:1027-31 ; Turnbaugh P3 et al. û Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distel gut microbiome. Cell Host Microbe 2008.3:213-223; Bâckhed F. et al. û The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc. Nati. Acad.Sci. USA 2004; 101: 15718-15723; Ley RE et al. û Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444:1022-3]. Chez l'homme, les travaux expérimentaux ne sont pas possibles et les données sur le rôle du microbiote intestinal dans le statut pondéral des individus reposent essentiellement sur l'observation de la composition du microbiote intestinal dans différentes circonstances. Un premier travail a montré que les individus obèses présentaient un biais du ratio des bactéries du phylum Firmicutes par rapport aux bactéries du phylum Bacteroidetes (ratio Firmicutes/ Bacteroidetes ou F/B) comparés aux individus contrôles dû majoritairement à la baisse des Bacteroidetes chez les sujets obèses [Ley RE et al. û Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444:1022-3]. En revanche, de nombreuses études avaient montré que Bacteroides thetaiotaomicron entraînait une augmentation de la conversion en calories chez les souris xénobiotiques [Samuel BS et al. -A humanized gnotobiotic mouse model of hostarchaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103: 10011-10016]. Ces deux données ne sont pas incompatibles, car la baisse du genre Bacteroidetes n'entraine pas forcément la baisse de l'espèce Bacteroides thetaiotaomicron au contraire il pourrait y voir baisse drastique d'autres Bacteroidetes et augmentation relative de Bacteroides thetaiotaomicron. Par ailleurs, les inventeurs ont testé les amorces utilisées par les différents auteurs qui ont publié sur ce sujet et ont observé que ces amorces ne sont pas absolument spécifiques de B. thetaiotaomicron et amplifient d'autres espèces du genre Bacteroides. Le même travail a montré que la correction du surpoids par un régime hypocalorique ou faible en carbohydrates entraînait une modification progressive du microbiote en un an, celui-ci tendant à devenir comparable à celui des sujets minces [Ley RE et al. û Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444:1022-3].
Plus récemment, il a été montré que des microorganismes appartenant au domaine des Archae, plus précisément de l'ordre des Methanobacteriales, étaient plus abondants chez les individus obèses que chez les individus contrôles ou chez les individus ayant bénéficié d'une chirurgie de l'obésité par by-pass intestinal. Cependant, la détermination précise des genres ou des espèces d'Archae associées à l'obésité, n'a pas été faite dans ce travail. En particulier, les auteurs n'ont pas déterminé précisément laquelle des deux espèces d'Archae méthanogènes connues dans le microbiote intestinal, Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadmanae, était plus spécifiquement associée au microbiote des individus obèses [Zhang H. et al. û Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70]. D'autres exemples de pathologies au cours desquelles le microbiote intestinal est connu ou suspecté de jouer un rôle comportent la genèse de cancers coliques [Piqué JM et al. û Methane production and colon cancer. Gastroentorology 1984 ;87 :601-5] et d'autres pathologies digestives inflammatoires chroniques [Peled Y. et al. û Factors affecting methane production in humans. Gastrointestinal diseases and alterations of colonic flora û Dig. Dis. Sci. 1987; 32: 267-71; Waever GA et al. û Incidence of methanogenic bacteria in sigmoidoscopy population: an association of methanogenic bacteria in diverticulosis. Gut 1986 ; 27:698-704]. Ces différents exemples illustrent l'intérêt, tant pour les laboratoires de recherche, que pour les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, qu'il y a à pouvoir déterminer en routine la composition du microbiote intestinal, et notamment la proportion relative de telle ou telle espèce de microorganisme ou de tel ou tel phylum de microorganismes. Dans l'exemple du statut pondéral de l'individu, il est utile de pouvoir déterminer par la simple cartographie microbienne des selles, si l'individu est prédisposé à une maigreur pathologique ou une obésité, qui peut ne pas être fidèlement reflétée par la simple mesure du poids corporel à un instant donné. Egalement, il est utile de pouvoir mesurer objectivement l'évolution de cette cartographie lors du traitement de la maigreur ou de l'obésité pour analyser l'efficacité du traitement et disposer d'éléments prédictifs de succès thérapeutique avant que la mesure du poids corporel n'atteigne les objectifs du traitement. Cependant, les méthodes actuellement publiées pour l'analyse du microbiote intestinal ne permettent pas une utilisation en routine, ni dans les laboratoires de recherche ni dans les laboratoires de diagnostic médical ni vétérinaire. Ceci est illustré par le fait que les travaux publiés portent sur un relativement petit nombre d'individus étudiés compris entre 9 [Zhang H. et al. û Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70] et 154 [Turnbaugh PJ et al. A core gut microbiome in obese and lean twins.
Nature 2009 ; 457:480-4]. En effet, les travaux réalisés à ce jour sur le microbiobiote ont tous utilisé l'amplification par la technique PCR du gène universel 16S ARN ribosomal suivie soit du clonage et du séquençage par technique de Sangers d'un grand nombre de clones (de l'ordre de 100 clones), soit d'une technique de pyroséquençage à haut débit sur la plateforme 454 Life Sciences û Roche [Zhang H. et al. ù Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70]. Ces techniques ne sont absolument pas utilisables en routine, du fait de leur coût, de leur lourdeur d'utilisation et du délai d'obtention des résultats de quelques semaines. Par ailleurs, les différents travaux réalisés donnent des résultats variables pour les individus contrôles entre les différentes études. Ceci est du en partie à l'absence de contrôle de qualité interne garantissant la qualité de l'extraction des acides nucléiques à partir du prélèvement de selles et de l'absence de témoin interne au prélèvement qui pourrait servir à normaliser les prélèvements et à comparer plus facilement les résultats expérimentaux obtenus chez des individus différents. Les méthodes mises en oeuvre à ce jour ne sont pas fiables en termes d'extraction et quantification de l'ADN procaryote de selles, et ne sont pas, en pratique, adaptées à une mise en oeuvre d'analyse de routine, que ce soit en laboratoire d'analyses biologiques ou en laboratoire de recherche. Les inventeurs ont découvert que les méthodes d'extraction mises en oeuvre dans l'état de la technique pour extraire l'ADN des selles n'étaient pas suffisamment efficaces pour conduire à des résultats fiables en termes de quantification, en particulier lorsque l'on cherche à quantifier des procaryotes de type Archae à parois épaisses. Ceci a conduit les inventeurs a développer une nouvelle méthode d'extraction impliquant au moins une lyse mécanique, en préalable à une lyse chimique et, plus précisément, la réalisation d'une deuxième lyse mécanique après la première lyse chimique/enzymatique. Parallèlement et en complément, les inventeurs ont développé des outils de mise en oeuvre de PCR quantitatives, avec des jeux d'amorces et de sondes spécifique pour une série de candidats potentiellement intéressants dans l'analyse de la flore intestinale, compte-tenu de certains écrits de la littérature, notamment en ce qui concerne les Bacteroidetes et Firmicutes, mais également compte-tenu de l'analyse personnelle des inventeurs, notamment en ce qui concerne Lactobacillus. Les inventeurs ont développé un procédé de quantification de certaines espèces de microorganismes et de certains phyla de microorganismes, à partir d'un échantillon de selles, applicable en routine dans les laboratoires de recherche et les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, et comprenant un marqueur interne de qualité.
Plus particulièrement, les inventeurs mis au point un procédé de quantification moléculaire des bactéries du phylum Firmicutes, dont spécifiquement les bactéries du genre Lactobacillus, et des bactéries du phylum Bacteroidetes. Le choix des phyla Firmicutes et Bacteroidetes a été explicité ci-dessus. Le choix du genre Lactobacillus, qui est un genre du phylum Firmicutes, est justifié par le fait que les promoteurs de croissance et en particulier Lactobacillus étaient associés chez les poulets à une prise de poids très importante en particulier chez ceux qui étaient complémentés en Lactobacillus pendant l'enfance [Khan M et al. - Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Les inventeurs en ont inféré que ce genre bactérien, pourrait aussi participer à réguler le statut pondéral d'un individu bien qu'aucune donnée n'ait été publiée chez l'Homme, en dépit des conclusions d'importance qui pourraient en être tirées, compte-tenu que le Lactobacillus est présent dans les produits alimentaires issus des industries agro-alimentaires. Pour cela, les inventeurs ont développé une technique de détermination et de quantification de chacun des espèces/phyla d'intérêt par PCR quantitative en utilisant l'Archae Methanobrevibacter smithii comme un témoin de la qualité de l'extraction des ADNs procaryotes à partir de l'échantillon de selles. Les inventeurs ont formé l'hypothèse que Methanobrevibacter smithii, un microbe Archae très difficile à extraire, devrait être présent dans tous les échantillons de selles humains, du fait de sa fonction dans la détoxification des produits issus de la transformation des aliments dans l'intestin par synthèse de méthane, et donc que son identification et sa quantification devraient constituer un contrôle positif de la bonne réalisation de l'extraction et de la quantification de l'échantillon. Les inventeurs ont donc tout d'abord mis au point une technique d'extraction de l'ADN des microorganismes à partir des selles, laquelle leur a permis de vérifier par la présence constante de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles humaines la qualité de ce procédé d'extraction. Puis, ils ont mis au point une méthode de quantification des microorganismes d'intérêt, dans la perspective de développer un protocole de routine permettant, à partir d'un prélèvement des selles chez l'homme ou les animaux, de quantifier la présence de microorganismes d'intérêt, notamment Methanobrevibacter smithii, Lactobacillus spp., Firmicutes et Bacteroidetes. La présente invention fournit donc un protocole très performant d'extraction des ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) et de quantification relative de la flore procaryote intestinale exhaustive, performante, reproductible et facile à mettre en oeuvre en routine de laboratoire afin de faciliter l'analyse d'un grand nombre d'échantillon dans un but tant diagnostique qu'épidémiologique. Pour que l'outil de quantification de la flore bactérienne intestinale soit performant, sensible et reproductible il faut qu'en amont la technique utilisée pour l'extraction à partir des selles de l'ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) permette l'extraction de la totalité des ADN en alternant lyses mécaniques et enzymatiques. Pour ce faire, les inventeurs ont mis au point une technique d'extraction de l'ADN en alternant lyse mécanique et enzymatique, qu'ils ont contrôlée en introduisant dans une selle témoin des quantités connues de procaryotes (Bacteria, Archaea) dont l'extraction de l'ADN est difficile du fait de la présence d'une paroi cellulaire particulièrement épaisse comme par exemple Methanobrevibacter smithii. En effet, il ne peut y avoir de quantification fiable sans une extraction optimale de l'ADN. Les inventeurs ont optimisé toutes les étapes d'extraction de la lyse des bactéries jusqu'au choix de la méthode d'extraction qu'elle soit manuelle ou automatique, en tenant compte de l'efficacité et de la reproductibilité de la méthode. Enfin, les inventeurs ont comparé la technique d'extraction retenue avec celle utilisée par les principaux auteurs qui ont publiés sur ce sujet, comme décrit dans l'exemple 1.
La méthode d'extraction d'ADN, ainsi que les outils de quantification par PCR en temps réel développés par les inventeurs, leur ont permis de confirmer que Methanobrevibacter smithii était présent chez 100% des individus, à des taux très variables, notamment selon leur statut pondéral. Les inventeurs en ont déduit l'intérêt d'analyser systématiquement dans les selles la présence de Methanobrevibacter smithii, au moins à titre de contrôle de la qualité d'extraction de l'ADN des selles dans l'échantillon testé.
De même, il a été découvert que l'autre procaryote méthanogène Methanosphaera stadmanae, n'était présente que dans les selles de 38% des individus. C'est cette donnée supplémentaire qui a également conduit les inventeurs à proposer la détection de Methanobrevibacter smithii à titre de témoin d'une bonne extraction de l'ADN.
Ainsi, la présente invention fournit une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, caractérisé en ce que l'on contrôle la qualité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on y détecte un ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii. Plus particulièrement, on quantifie le nombre de copie d'ADN d'au moins une séquence d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative, choisie parmi les séquences spécifiques suivantes - une séquence tirée du gène tirée du gène 16S de l'ARN ribosomal, SEQ. ID. N°1 = 5'-CCGGGTATCTAATCCG GTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTC AGAATCGTTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGA ATTTCACCTCTACCCTGGGAG -3', et, - une séquence tirée du gène rpoB, SEQ. ID. N°5 = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAAC CCCAGAGGGTCCTAACTGTGGTC -3' Plus particulièrement encore, on quantifie le nombre de copies dudit ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative en temps réel comprenant la coamplification enzymatique de type PCR d'une séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii contenue d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon de selles, et d'autre part dans un échantillon des fragments d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii étant choisie parmi les séquences suivantes ou leurs séquences complémentaires : • une séquence du gène 16S ARN amplifiable par les séquences amorces suivantes : - Amorce sens, SEQ. ID. N°2 : 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3', et - Amorces antisens, SEQ. ID. N° 3 : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3', et • une séquence du gène rpoB amplifiée par des amorces de séquences suivantes : - Amorce sens, SEQ. ID. N°6 : 5'- AAGGGATTTGCACCCAACAC -3', et Amorces antisens, SEQ. ID. N°7 : 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'. De préférence, on quantifie au moins deux séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii tirées respectivement du gène 16S ARN ribosomal et du gène rpoB. Les inventeurs ont en effet observé qu'une détection Methanobrevibacter smithii chez 100% des individus, requiert de réaliser la détection sur deux gènes.
De préférence, on met en oeuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques de Methanobrevibacter smithii. La technique de PCR en Temps Réel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du produit amplifié basée sur la mesure d'émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés avec une sonde dite d'hydrolyse . Pour cela, ladite sonde est marquée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est plus absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et du fluorophore en solution. L'émission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents. De préférence encore, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries ou espèce procaryote dont les concentrations sont quantifiées. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les coquantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cours du temps et évite les biais liés au témoin positif. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'->3'. Plus particulièrement, on réalise une réaction d'amplification et quantification par PCR en temps réel, en mettant en oeuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, à savoir : 1) pour la séquence du gène 16S ARN ribosomal, SEQ. ID N°4 = 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3', et 2) pour la séquence du gène rpoB, SEQ. ID N°8 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3', et - un grand fragment d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant des dites séquences spécifiques, de préférence sous forme de plasmide, avec une pluralité d'échantillons de grand fragment d'ADN synthétique de concentrations différentes connues. Les séquences des cibles moléculaires amplifiées présentent la structure suivante, avec les séquences amorces encadrées et les séquences sondes encadrées et en italique : Pour SEQ. ID. N°1 : ICCGGGTATCTAATCCGGTTCJGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTCAGAATCI GTTCCAGTCAGIACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGAATTTCA CCTCTACCCTGGGAG,l et, Pour SEQ. ID. AAGGGATTTGCACCCAACACAIATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAACC (GGGTCCTAACTGTGGTC Les inventeurs ont donc développé un outil de quantification ayant pour cibles des séquences permettant de quantifier spécifiquement et fidèlement : (1)- les Firmicutes (Fi), (2)- les Bacteroidetes (Ba), (3)- les Lactobacillus (La) afin de connaître par PCR en temps réel quantitative la composition relative du microbiote intestinal de sujets obèses, de sujets minces et de sujets présentant une anorexie mentale.
Plus précisément, dans une méthode selon l'invention, on quantifie en outre conjointement dans ledit ADN extrait dudit échantillon de selles, au moins une séquence spécifique choisie parmi : 1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et 2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et 3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes. On entend par "séquence spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit gène Lactobacillus ou dit phylum Bacteroidetes ou Firmicutes, que l'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganismes ou organismes vivants. On entend ici par "séquence consensus spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit genre Lactobacillus ou, respectivement, dudit phylum Bacteroidetes ou phylum Firmicutes, que l'on retrouve dans toutes lesdites souches de ladite espèce dit genre ou dit phylum et qu'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganisme ou organisme vivant. En ce qui concerne les bactéries Firmicutes, les inventeurs ont développé un jeu d'amorces et de sondes originaux tirés du gène 16S de N°5 : CCAGA) l'ARN ribosomal. Et, s'agissant de Bacteroidetes, une sonde tirée du gène 16S-RNA avait été décrite dans un article Armougon Raoult de BMC Genomics 2008,9 : 576, mais sans les amorces, de sorte qu'il fallait trouver des séquences amorces encadrant la séquence sonde connue, qui optimise le ratio sensibilité/spécificité, en d'autres termes, trouver des séquences amorces encadrant la séquence sonde et que l'on retrouve dans toutes les bactéries du phylum Bacteroidetes concerné et que l'on ne retrouve pas dans les autres phyla, notamment Firmicutes. Pour ce faire , les inventeurs ont cherché in silico des régions du gène codant pour la portion 16S des ARN ribosomiaux permettant l'amplification de la quasi-totalité des Bacteroidetes d'une part et des Firmicutes d'autre part éliminant tous risques de réactivité croisée entre les deux groupes. Ces différents systèmes amorces et sondes étant choisis en accord avec les contingences expérimentales les réactivités croisées ont été testées in silico puis expérimentalement en utilisant les ADN extraits à partir de bactéries souches. Les systèmes d'amorces et sondes retenus pour reconnaître les Bacteroidetes ne reconnaissent expérimentalement aucun ADN provenant des souches de Firmicutes et vice et versa.
Pour la cible Lactobacillus, les inventeurs ont choisi la cible sur le gène tuf et un couple d'amorces et une sonde ont été choisis en accord avec les contraintes techniques de la PCR en temps réel. A partir de l'ADN de 20 souches de Lactobacillus non reconnues par le couple d'amorce et la sonde correspondant à la cible moléculaire choisie, 20 séquences du gènes tuf non déposées dans les Genbank ont été amplifiées et séquencées, des séquences consensus d'amorces et de sondes ont été choisies et testées sur 96 ADN de souches Lactobacillus. Ce système amorces et sondes qui permet l'amplification du maximum de souches de Lactobacillus est conservé.
Les séquences de Lactobacillus sp sélectionnées présentent une plus grande sensibilité et reconnaissent un plus grand nombre de bactéries que celles décrites dans la technique antérieure.
Plus particulièrement, on réalise une méthode d'amplification quantitative par PCR à l'aide des amorces suivantes : • pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes : - amorces sens : SEQ. ID N°9 = 5'-AGCAGCCGCGGTAAT-3', - amorces antisens : SEQ. ID N°10 : 5'-CTAHGCATTTCACCGCTAC-3', • pour ladite séquence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus : - amorces sens : SEQ. ID N°13 = 5'- TACATYCCAACHCCAGAACG - 3', dans laquelle Y désigne C ou T, H désigne A ou C ou T, et - amorces antisens : SEQ. ID N°14 = 5' AAGCAACAGTACCACGACCA -3'. • pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes - amorces sens : SEQ. ID N°17 = 5'- GTCAGCTCGTGTCGTGA-3', et - amorces antisens : SEQ. ID N°18 = 5'-CCATTGTAKYACGTGTGT-3' dans laquelle K désigne G ou T et Y désigne C ou T. Plus particulièrement encore, on met en oeuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en temps réel à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques choisies parmi les séquences suivantes : 1) pour ladite séquence spécifique du phylum Bacteroidetes : SEQ. ID N°11 = 5'-GGGTTTAAAGGG-3' 2) pour ladite séquence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus : SEQ. ID N°15 : 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3', dans laquelle R désigne A ou G. 3) pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes : SEQ. ID N°19 : 5'-GTCAANTCATCATGCC-3', dans laquelle N désigne, soit I, soit l'un de A, T, C ou G. Lesdites séquences spécifiques ainsi détectées et amplifiées 10 correspondent à : 1) une séquence spécifique du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides fragilis,), SEQ. N°12 = 5'-AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATT 1GGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACTGGTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTC 15 AACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGTCAGTCTTGAGTACAGTAGAGGTGGGCGG AATTCGTGGTIGTAGCGGTGAAATGCTTAG -3' 2) une séquence consensus spécifique de la bactérie Lactobacillus sp commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners et Lactobacillus 20 acidophilus, au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation, SEQ. ID N° 16 = (AAG CCATTCTTAATGCCAI TGGTCGTGGTACTGTTGCTT -3', et 3) une séquence consensus spécifique tirée du gène 16S ARN 25 ribosomal de Clostridium difficile du phylum Firmicutes, SEQ. ID N°20 = G 5'-ITACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGAC IGTTGAAIGACGTATTTACTATCAC 5'-IGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA ACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACIGTCAAATCATCATGCCICCTTATGACCT GGGCTIACACACGTGCTACAATGG -3'.
Les séquences amorces sens et les séquences inverses complémentaires de l'amorce antisens sont encadrées et les séquences sondes sont encadrées et en italique. Les séquences SEQ. ID. N°1 à 20 décrites ci-dessus sont spécifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description. A la position correspondant à un nucléotide H, N, R, T ou Y dans les séquences SEQ. ID. N°10, 13, 15, 18 et 19, on trouve, dans les séquences cibles complémentaires, des nucléotides variables comme défini ci-dessus.
Les oligonucléotides de séquences SEQ. ID. N°10, 13, 15, 18 et 19 sont donc mis en oeuvre, en fait, sous forme de mélanges équimolaires d'oligonucléotides de séquences différentes, lesdits oligonucléotides de séquences différentes répondant pour chaque séquence SEQ. ID. n°10, 13, 15, 18 et 19 aux diverses définitions possibles des séquences respectivement n°10, 13, 15, 18et 19, à savoir : - un mélange équimolaire de 3 séquences différentes pour SEQ. ID. N°10 pour lesquelles H est A, C et respectivement T, - un mélange équimolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°13 pour lesquelles Y est C et respectivement T, - un mélange équimolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°15 pour lesquelles R est A et respectivement G, - un mélange équimolaire de 4 séquences différentes pour SEQ. ID. N°18, pour lesquelles KY sont respectivement GC, GT, TC, et TT, - un mélange équimolaire de 4 séquences différentes pour SEQ. ID. N°19 pour lesquelles N représente A, T, C et respectivement G (lorsque N représente l'un de A,T, C ou G. En revanche, lorsque N est I (inosine), l'oligonucléotide présente une seule séquence.) Ces mélanges équimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en oeuvre, lors de la synthèse oligonucléotidique, des mélanges équimolaires des différents nucléotides concernés. Plus particulièrement, pour l'amplification de ladite séquence spécifique du phylum Bacteroidetes, on réalise l'étape d'hybridation des amorces et d'élongation à 48°C. De préférence, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard de quantification, ce standard qui contient les séquences spécifiques des différentes cibles moléculaires sélectionnées précédemment. La présence de plusieurs cibles sur le même fragment permet de quantifier des cibles différentes dans le même échantillon et de les co-quantifier de façon homogène en utilisant la même gamme d'étalonnage pour détecter des cibles moléculaires différentes dans la mesure où les contraintes du choix des amorces et de la sonde le permettent. Cette gamme d'étalonnage conservée dans le temps est le garant de la stabilité du système de quantification. Cette gamme d'étalonnage est diluée de 107 à 1 copies de chacune des cibles moléculaires pour 5 pl d'échantillon d'ADN. Avantageusement, lesdites concentrations Fi (bactérie du phyla Firmicutes), Ba (bactérie du phyla Bacteroidetes) ou La (bactérie Lactobacillus sp) sont déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques des bactéries du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus. De préférence, on détermine lesdites concentrations de bactéries par co-amplification enzymatique du type PCR en temps réel desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus contenus d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon, et d'autre part dans des échantillons d'ADN synthétiques comprenant chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries servant de standards d'étalonnage de quantification de l'ADN, lesdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus présentant une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides. La détection et la quantification desdits fragments amplifiés sont réalisées à l'aide de sondes marquées de séquences distinctes de celles des amorces d'amplification et encadrées par celles-ci, pour chacun desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus, les marqueurs des différentes sondes sont des marqueurs différents entre eux, notamment les marqueurs fluorescents connus de type VIC et FAM. Plus particulièrement, lesdites séquences consensus spécifiques desdites bactéries sont tirées de : pour le phylum Firmicutes : un fragment du gène 16S ARN ribosomal de Clostridium difficile aux positions 1026 à 1203 dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II ((http://rdp.cme.msu.edu/) est S000260455. - pour le phylum Bacteroidetes : le fragment des positions 537 à 721 du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides fragilis dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II est S000000037. - pour les bactéries du genre bactérie Lactobacillus, une séquence de 90 bases, commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation aux positions 253 à 343 du gène de référence GenBank AY 5621 91.1. - Pour l'Archae Methanobrevibacter smithii, une séquence de 123 bases du gène 16S ARNr spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii en position 740 à 862 du gène 16S ARNr de référence Genbank CP000678.
On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.
La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard de quantification. On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR. Au total, les résultats cliniques conduisent les inventeurs à estimer qu'un procédé de détermination du statut de la flore intestinale d'un individu comprend avantageusement la quantification des deux phyla Bactéroïdes et Firmicutes, d'une part, et, d'autre part, des bactéries du genre Lactobacillus et de l'espèce Methanobrevibacter smithii. Ainsi, on réalise la quantification des quatre dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et de préférence du phylum Firmicutes. De préférence encore, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries procaryotes. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les co-quantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cours du temps et évite les biais liés au témoin positif. Plus particulièrement, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant des dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacillus, de phylum Bacteroidetes, et de préférence de phylum Firmicutes, de préférence encore inséré dans un plasmide. Dans les méthodes de quantification d'ADN pour PCR en Temps Réel, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide contaminant.
Ainsi, on peut mettre en oeuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles : 1. on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons selon l'invention à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'étalonnage, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ladite séquence spécifique modifiée; 2. on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3. on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des étapes suivantes : 3a. on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction. Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré. 3b. on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séquence exogène contenant le site de restriction.
Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié. Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en oeuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries à tester, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques. Avantageusement encore, on met en oeuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées ou non de chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétique étalon, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes dites bactéries et lesdites amorces pouvant être mises en oeuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine diverses, notamment la méthode décrite dans FR 2 882 063 dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant : - une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation desdits oligonucléotides, suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre déterminé lesdits oligonucléotides, les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et anti-sens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas échéant, et - une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand 5 premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit grand premier fragment. Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles (dimérisation des amorces). Ce phénomène est observé dans le cas où 10 les conditions de PCR, notamment de température, sont mal adaptées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires. La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une 15 alternance d'oligonucléotides de séquences directes ( sens ) ou inverses (encore dénommées reverses ou anti-sens ). Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la séquence d'un oligonucléotide une séquence nucléotidique complémentaire des premiers nucléotides de 20 l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides seront hybridés par leur parties complémentaires, et grâce à l'activité polymérasique, par exemple de la Taq polymérise, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins. Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe et inverse 25 correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré. Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques, sont avantageusement insérés dans un plasmide. 30 Cette technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode simple à mettre en oeuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic et suivi du rapport Firmicutes/Bacteroidetes dans les prélèvements de selles selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des échantillons d'ADN standard d'étalonnage à une concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, et de préférence encore un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, ainsi que - desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdites bactéries et de préférence encore, desdites sondes tels que définis ci-dessus, et - des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification 20 d'ADN de type PCR. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de la bactérie Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et respectivement du phylum Firmicutes, pour assurer le 25 diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'un individu. La méthode de quantification selon l'invention permet de corréler le suivi du statut pondéral d'une personne au suivi des teneurs en bactéries BA (Bacteroidetes), FI (Firmicutes), LA (Lactobacillus) et M. (Methanobrevibacter smithii), notamment comme suit : - pour les patients soumis à un traitement antibiotique au long cours, une diminution de BA (Bacteroidetes) et une augmentation de LA (Lactobacillus) représente un risque de prise de poids, sous réserve que LA (Lactobacillus) soit supérieur à 106. - pour les patients anorexiques, une diminution de Methanobrevibacter smithii peut être indicatrice d'une l'évolution favorable de cette pathologie, spontanément ou sous l'effet d'actions thérapeutiques médicamenteuses ou non-médicamenteuses- pour les obèses en cours de traitement pharmaceutique, une augmentation de BA (Bacteroidetes) et une diminution de LA (Lactobacillus) peuvent être un indicateur de bonne évolution du traitement. Enfin, des complémentations ou traitements spécifiques au regard des bactéries concernées peut également contribuer à la thérapeutique des sujets concernés en cherchant à diminuer spécifiquement le taux de M. (Methanobrevibacter smithii) chez les anorexiques, et augmenter le taux de BA (Bacteroidetes) et diminuer le taux de LA (Lactobacillus) chez les obèses ou les personnes en traitement antibactérien en longue durée. La présente invention fournit également une trousse de détection comprenant des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR et au moins un jeu d'oligonucléotides amorces et de préférence en outre au moins un oligonucléotide sonde d'hydrolyse utile pour une détection et quantification par amplification par PCR, de préférence par PCR en Temps Réel, comprenant au moins des couples d'oligonucléotides amorces, aptes à amplifier : - au moins une séquence spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii, et - au moins une séquence choisie parmi : 1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et 2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et 3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
Plus particulièrement, ladite trousse comprend au moins l'un des deux couples d'oligonucléotides amorces et, de préférence au moins l'un des oligonucléotides sondes d'hydrolyse, aptes à amplifier l'une au moins desdites séquences de Methanobrevibacter smithii tirées du gène 16S de l'ARN ribosomal et respectivement du gène rpoB suivants : a) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°2 et SEQ. ID N°3 et, de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°4, et b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°6 et SEQ. ID N°7, et de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de 15 séquence SEQ. ID N°8. Plus particulièrement, une trousse selon l'invention comprend les couples d'oligonucléotides amorces avec de préférence les oligonucléotides sondes d'hydrolyse, suivants : a) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°9 20 et SEQ. ID N°10, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°11 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes et, b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°13 et SEQ. ID N°14, avec de préférence un oligonucléotide sonde 25 d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°15 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus et, c) de préférence, le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°17 et SEQ. ID N°18, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°19 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes. Plus particulièrement encore, une trousse comprend en outre : - des échantillons d'ADN standard d'étalonnage comprenant desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, de bactéries du genre Lactobacillus, phylum Bacteroidetes, et de préférence phylum Firmicutes, tel que défini ci-dessus, et - de préférence, un dit grand fragment d'ADN synthétique tel que défini ci-dessus.
De préférence, une trousse comprend des réactifs d'extraction comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique. La présente invention fournit également une méthode caractérisée en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit 15 échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles : 1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, de préférence à une dilution de 50 à 150 g/I, et 2) on réalise une lyse mécanique par mélange et agitation de 20 ladite suspension de l'étape 1 avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, et 3) de préférence, on réalise une étape de chauffage à 100°C pendant 10 minutes, et 4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et 25 agitation de la suspension obtenue à l'étape 2 avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis 5) on répète l'étape 2) avec le mélange obtenu à l'étape 3), et 6) de préférence, on répète l'étape 4) avec le mélange obtenu à l'étape 4). De façon connue, on sépare in fine l'ADN soit avec des méthodes connues telles que par fixation sur une colonne contenant du silicate puis lavage pour éluer ladite ADN en le séparant de la colonne ou par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN. La réalisation de la première étape de lyse mécanique permet d'optimiser et de favoriser le travail d'agents chimiques ou enzymatiques de lyse à l'étape 2) en favorisant leur pénétration dans les micro-organismes procaryotes permettant de dégrader partiellement les parois épaisses des micro-organismes procaryotes à paroi épaisse, et la dégradation totale des parois épaisses est obtenue seulement par au moins une deuxième lyse mécanique après ladite première lyse chimique ou enzymatique.
A l'étape 3), le chauffage à 100°C permet de finaliser la dégradation des composants des parois et membranes des microorganismes. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence au listage de séquence et aux figures 1 à 4. - La figure 1 représente en ordonnée le pourcentage de séquences 16S de l'ARN ribosomal et en abscisse les résultats pour les bactéries du phylum Firmicutes (FI), puis les bactéries du phylum Bacteroidetes (BA).
Les taux de sensibilité sont représentés par la première colonne en traits fins, à savoir 88,94% pour des bactéries du phylum Firmicutes et 89,89% pour les bactéries du phylum Bacteroidetes. Les taux de spécificité sont représentés par la deuxième colonne en gras, à savoir 0,83% pour les bactéries du phylum Firmicutes et 0,01% pour les bactéries du phylum Bacteroidetes.
Les valeurs entre parenthèses indiquent le nombre de séquences hybridant dans le phylum étudié (sensibilité) et en dehors du phylum étudié (spécificité). - La figure 2 représente la quantification des bactéries du phylum Bacteroidetes dans les selles collectées chez trois groupes d'individus obèses (0), individus contrôle (L) et anorexiques (A). Le nombre de copies de bactéries Bacteroidetes et porté en Ordonnée et la valeur P inférieure à 0,05 est représentée par le signe * et la valeur P inférieure à 0,01 est représentée par ** .
La croix indique la moyenne ; le trait horizontal la médiane et le cube représente la distribution des valeurs dans l'écart type. - La figure 3 représente la distribution des quantités supérieures à 106 de nombre de bactéries du genre Lactobacillus détecté et quantifié par le procédé selon l'invention dans les selles d'individus anorexiques (A), obèses (0) et contrôle (L). Les chiffres en ordonnée représentent le nombre d'individus.
Sur la figure 3, représente le nombre de copies de Lactobacillus supérieur ou égal à 106, et représente le nombre de copies de Lactobacillus inférieur à 106. - La figure 4 représente la quantification de l'Archea Methanobrevibacter smithii selon le procédé de l'invention dans les selles des individus anorexiques (A), obèses (0) et contrôles (L). La figure représente l'écart type (hauteur du trait vertical) et la moyenne (plateau du cube), les chiffres en ordonnée étant le nombre de copies moyen de Methanobrevibacter smithii.
EXEMPLE N°1. Comparaison du protocole d'extraction objet de l'invention avec le protocole de référence publié dans la littérature, pour la détection de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles. L'Archae Methanobrevibacter smithii est un méthanogène, c'est à dire une Archae susceptible de transformer les produits de la digestion des aliments en méthane CH4. Cependant, Methanosphaera stadtmanae est également une Archae méthanogène détectée dans les selles. Les inventeurs ont parié sur le fait que, étant donné l'importance de la réaction biochimique de méthanogenèse pour la physiologie intestinale, l'Archae Methanobrevibacter smithii et non pas Methanosphaera stadtmanae était présente et détectable dans les selles chez tous les individus. Cette hypothèse a été ensuite vérifiée et les inventeurs ont observé que Methanobrevibacter smithii était effectivement détectée chez presque tous les individus en combinant la détection du gène 16S ARN ribosomal avec celle du gène rpoB alors que Methanosphaera stadtmanae n'est détectée que chez moins de 40% des individus en utilisant le même système. Afin de tester cette hypothèse, les inventeurs ont imaginé devoir lyser la paroi des Archae, afin de libérer l'ADN des Archae pour le rendre accessible à la détection moléculaire basée sur la technique PCR. Dans ce but, les inventeurs ont mis en place par tâtonnements successifs le protocole suivant. Dans un premier temps, les inventeurs ont lysé mécaniquement les prélèvements par agitation en présence de poudre de verre, suivie d'une lyse chimique, puis ils ont extrait l'ADN. Les résultats ont montré que seulement 4/10 (40%) des prélèvements de selles provenant de 10 individus différents présentaient une détection positive de l'ADN de Methanobrevibacter smithii. Afin d'améliorer encore l'efficacité du protocole, les inventeurs ont alors imaginé d'ajouter une deuxième étape de lyse mécanique par la poudre de verre et ont obtenu une détection de l'ADN de Methanobrevibacter smithii dans 10/10 (100%) des mêmes prélèvements de selles. Egalement, l'ajout d'une deuxième étape de lyse mécanique a permis de façon imprévue d'augmenter de un à deux log. le seuil de détection des prélèvements positifs par PCR temps-réel.
Le protocole définitif objet de l'invention est donc le suivant. Environ 500 mg de selles sont suspendus dans 5ml de tampon Tris-HCL 0,05M pH7,3 le mélange est homogénéisé par agitation manuelle et au vortex jusqu'à obtenir une suspension quasiment homogène. 250p1 de suspension sont introduits dans un tube à vis de 1,5ml contenant 0,3 g (équivalent à un volume de 10 pl environ, soit inférieur à 4% du volume final) de poudre de verre dont les particules mesurent moins de 106 pm et sont lavées à l'acide pour éliminer les graisses, les acides nucléiques et les DNAses et les RNAses qui proviennent éventuellement des procédés de fabrication des billes de verre (référence G4649, Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) et agités dans le Fast Prep BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) à la vitesse maximale (6,5) pendant 90 secondes. La préparation est ensuite chauffée à 100°C pendant 10 minutes puis ramenée à la température ambiante. Ensuite, un protocole standard du Kit NucleoSpin Tissue Mini Kit (Macherey Nagel, Hoerdt, France) et utilisé comme suit. On ajoute 180pL de tampon de lyse Ti et 25pl de protéinase K à 20 mg/ml. Le mélange est incubé à 56°C toute la nuit. Puis, on réalise une deuxième lyse mécanique comme décrite ci-dessus. Puis, on réalise une lyse chimique de tampon de lyse d'ADN connus, à savoir 200pl de tampon B3 (mélange en proportions égales des tampons B1 [Guanidine hydrochioride] et de tampon B2 de composition disponible auprès du fournisseur) sont ajoutés et le mélange est incubé 10 minutes à 70°C, ajouter 200pl d'éthanol, mélangé, appliqué sur une colonne de silice, centrifugé lmin à vitesse maximale, lavé avec 500pl de tampon BW, centrifugé 1 minute à vitesse maximale, lavé avec 600 pl de tampon B5 centrifugé 1 minute à vitesse maximale. Puis, on dépose 100p1 de tampon BE préchauffé à 70°C au centre de la colonne, et on laisse incuber à température ambiante 1 à 2 minutes puis éluer l'ADN par centrifugation 1 minute à vitesse maximale. Un témoin négatif d'extraction de 250 pL d'eau stérile est introduit dans chaque série de prélèvements. Les ADN sont conservées à -20°C jusqu'à utilisation. Ils seront alors testés purs et dilués au 1/10 et au 1/100 afin de mettre en évidence la présence éventuelle d'inhibiteurs de la PCR.
Cette phase de mise au point étant faite, les inventeurs ont comparé le protocole objet de l'invention avec le protocole de référence pour l'extraction de l'ADN des procaryotes à partir des selles. Pour cela, les inventeurs ont collecté 50 échantillons de selles collectés chez 50 individus ayant soumis des selles pour exploration d'une diarrhée. Ces 50 échantillons de selles ont bénéficié d'une extraction d'ADN en parallèle par le protocole objet de l'invention et en utilisant le kit d'extraction QIAAMP Stool DNA mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) décrit dans la littérature [Eckburg PB. et Al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005 Volume 308 page 1635-1638]. Les principales étapes du procédé d'extraction d'ADN de référence du kit QIAAMP sont : 1) dilution du prélèvement de selles dans un tampon de type PBS à pH = 7.4 (2) et, 2) incubation une nuit à 56°C, en présence de protéinase K, 3) inactivation de la protéinase K par chauffage à 70°C pendant 10 minutes, et 4) extraction de l'ADN total par filtration sur la colonne de silicate.
Dans cet exemple, les inventeurs ont comparé le nombre de copie de gène 16S ADNr et du gêne rpoB par gramme de selles en utilisant les deux protocoles d'extraction. Les données numériques ont été analysées en utilisant le test non-parametric de Kruskal-Wallis dans le logiciel EPIINFO version 3.4.1 (center sur dix controlant and prevention, Atlanta, GA). Les valeurs P ont été utilisées pour montrer des différences significatives entre les deux méthodes et ont été calculées en utilisant la méthode non paramétrique de Kruskal-wallis pour 2 groupes. Une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.
En utilisant la méthode commercialisée Qiagen, le gène 16S ADNr de Methanobrevibacter smithii a été détecté chez 44/50 (90%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 33/50 (66%) des individus. En utilisant le protocole objet de l'invention, le gène 16S ARN ribosomal a été détecté selon la même méthode de détection et quantification décrite dans l'exemple 2, chez 50/50 (100%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 49/50 (99%) des individus. A partir d'un gramme de selles, le protocole d'extraction objet de l'invention a permis de détecter entre 2 et 3 logarithmes plus de copie d'ADN le protocole commercialisé Qiagen avec une valeur P inférieure ou égale à 0,00001 pour les deux gènes analysés. Dans cet exemple, les contrôles négatifs sont restés strictement négatifs. Ces résultats montrent la supériorité du protocole d'extraction selon l'invention, par rapport à un protocole d'extraction habituellement utilisé et commercialisé, tant en nombre d'individus détectés positifs, qu'en quantité d'ADN détecté. La quantification, dans les selles, des gènes 16S ARN ribosomal et rpoB de l'Archae Methanobrevibacter smithii, extraits par un protocole d'extraction selon l'invention en comparaison avec un protocole d'extraction commercialisé par QIAGEN (France) donne (en logarithme) le nombre de copies pour chacun des deux gènes. 1) Gène 16SARN ribosomal, - Protocole selon l'invention valeur moyenne 2.05e10, ecart-type = 6.13e+10, médiane = 2.73e06, - Protocole d'extraction QIAGEN : valeur moyenne 2.66e07, écart-type = 1.18e°8, médiane = 8.98e°2, valeur P = 0.00001 2) Gène rpoB : - Protocole d'extraction selon l'invention : valeur moyenne 5.11e09, ecart-type = 1.48e+10, médiane = 7.73e°5, - Protocole d'extraction QIAGEN : valeur moyenne 6.67e06, écart-type = 3.36e°7, médiane = 4e°2, valeur P = 0.00001 EXEMPLE N°2. Spécificité et sensibilité du système de détection selon l'invention. La détermination d'un système PCR en temps réel sur des clades bactériens Firmicutes et Bacteroidetes a nécessité plusieurs mois de mise au point et de tâtonnements expérimentaux. Difficultés à la fois bioinformatiques et biotechnologiques. En effet, il s'agissait pour les inventeurs de mettre au point une technique de détection moléculaire des deux phyla bactériens numériquement les plus représentés par le nombre de séquences 16S ARN ribosomal dans les banques électroniques de séquences. En particulier, le phylum Firmicutes est représenté par plus de 94.000 séquences (soit le phylum le plus important sur 70 phyla représentés dans RDP-II)[Cole JR, Chai B, Farris RJ, Wang Q, Kulam-Syed-Mohideen AS, McGarrell DM et al.: The ribosomal database project (RDP-II): introducing myRDP space and quality controlled public data. Nucleic Acids Res 2007, 35: D169-D172] de 16S ARN ribosomal dans la base de données ribosomal RDP-II. Egalement, le phylum Bacteroidetes est représenté par plus de 34.000 séquences (seul le phylum Protebacteria est plus important que celui des Bacteroidetes). Identifier un système de 3 fragments de séquences (amorces et sonde) ciblant la quasi-totalité des espèces des phyla Firmicutes et Bacteroidetes respectivement était un véritable défi d'autant plus que le système se devait aussi d'être spécifique ; à savoir qu'un minimum d'espèces en dehors du phylum considéré ne devait être détectable. Ces fragments de séquences étant déterminées, il a fallu les modifier et adapter les conditions expérimentales afin que la sensibilité des réactions de PCR en temps réel soit optimale, et surtout qu'il n'y ait pas de détection croisée entre les différents systèmes d'amorces et de sondes dégénérées mises en jeux. Puis, les spécificités ont été testées en utilisant le maximum d'ADN de souches bactériennes de référence à différente concentration. Il fallait également éviter sans diminuer la sensibilité de la réaction de PCR supprimer les fixations parasites sur le milieu réactionnel dues au fait que nous quantifions des bactéries qui sont présentes partout dans l'environnement et en grande quantité.
La difficulté, liée notamment à la faible variabilité de la séquence nucléique du gène 16S ARN ribosomal (beaucoup de régions conservées), était donc d'identifier des amorces de PCR et une sonde (1) dans une région limitée en taille (200 bases au maximum pour être compatible avec un système de détection par PCR en temps réel) (2) avec des températures d'hybridation en cohérence avec le système (au minimum 10°C supplémentaires pour la température de fusion (Tm) de la sonde par rapport à celle des amorces) (3) avec des séquences nucléiques le plus faiblement dégénérées possible afin de conserver une possibilité d'hybridation de la sonde.
En prenant l'exemple du système PCR en temps réel pour le phylum Firmicutes, plusieurs mises au point ont été nécessaires. La sonde ou signature de base du clade Firmicutes déterminée in silico possédait en son coeur une suite de bases indéterminées (N): TCATGCCN[16]ACA. Les inventeurs ont donc tâtonné pour allonger le motif TCATGCC et obtenir la spécificité ainsi perdue via le design des amorces et le tout dans une région devant correspondre à une amplification inférieure à 200 bases environ. Finalement le système PCR en temps réel mis au point pour le clade Firmicutes est une recherche de complémentarité entre les 3 éléments (amorces +sonde). Prise individuellement, chacune des séquences (amorces et sonde) est très sensible au clade Firmicutes mais pas forcément très spécifique. En revanche, la réunion des 3 séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°17, N°18 et N°19 confère une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel. De même, les trois séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°9, N°10 et N°11 pour les bactéries Bacteroidetes confèrent également une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel. Cette spécificité est montrée dans cet exemple dans lequel la séquence des amorces a été synthétisée par la société Eurogentec (Seraing, Belgique) et la séquence des sondes a été synthétisée par la société Applied Biosystem. Les réactions d'amplification PCR ont été réalisées sur un appareil MX3000TM system (Stratagene Europe, Amsterdam, Pays-Bas) en utilisant le kit QuantiTect PCR mix de la société Qiagen (Courtaboeuf, France) et 5 pmol de chaque amorce et sonde, 5 pl d'ADN extrait de chacune des 108 espèces bactériennes rapportées dans le Tableau 1 après dilution au 1/10, 1/100, 1/1000, le tout sous un volume réactionnel final de 25 pl. Le programme de PCR en temps réel comportait pour la détection des Bacteroidetes: 95°C 15min, puis 45cycles de 95°C 30s, 48°C 45s, 72°C lmin). Ces conditions expérimentales doivent être scrupuleusement respectées étant donné la petite taille de la sonde et la nature de la séquence ; et pour la détection des Firmicutes et des Lactobacillus et Methanobrevibacter smithii: 95°C 15min, puis 45 cycles de 95°C 30s, 60°C 1min. Les concentrations des quantités de sondes et d'amorces ont été adaptées pour chacun des systèmes afin de conserver leur efficacité.
Les résultats indiquent que le système de détection des Bacteroidetes présente une sensibilité de 89.89% puisqu'il détecte 30.237 des 33.639 séquences 16S ARN ribosomal des bactéries du phylum Bacteroidetes dans la base de données RDP-II (Figure 1) et que le système de détection des Firmicutes présente une sensibilité de 88.94% puisqu'il détecte 83.576 des 93.969 séquences du gène 16S ARN ribosomal des bactéries du phylum Firmicutes de la base de données RDP-II. L'utilisation des deux systèmes de détection Firmicutes et Bacteroidetes sur la base de données RDP-II excluant ces deux phyla indique un taux de détection faussement positive de 0,83% pour Firmicutes et de 0,01% pour Bacteroidetes. De même, les systèmes des séquences SEQ. ID. N°2 et N°3 (amorces) et N°4 (sonde) pour le gène 16S de l'ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithii et les séquences SEQ. ID. N°6 et N°7 (amorces) et N°8 (sonde) pour le gène rpoB de Methanobrevibacter smithii, ainsi que les séquences SEQ. ID. N°13 et N°14 (amorces) et N°15 (sonde) pour les séquences du gène tuf de Lactobacillus spp. décrites précédemment confèrent une grande spécificité (99%) et sensibilité (< 50 copies) pour une utilisation dans la PCR en Temps Réel. Les résultats du tableau 1 sont exprimés en CT, à savoir le nombre de cycles d'amplifications nécessaires pour que l'amplification commence, cette valeur de CT en relation avec la concentration du produit nucléique à quantifier, à savoir que plus le CT est bas, plus la concentration est élevée. Pour la quantification, on a construit un plasmide d'étalonnage comprenant un grand fragment d'ADN synthétique hybride contenant les séquences SEQ. ID. N°1, N°2, N°12, N°16 et N°20, sous forme de fragment d'ADN double-brins construit par réaction d'amplification, tel que décrit dans FR-2 882 063. On a créé une gamme plasmidique d'étalonnage de 107 dont une copie par puits, pour chaque réaction d'amplification, les dix points de la gamme plasmidique sont testés. EXEMPLE N°3. Analyse des flores bactériennes et Archae par le procédé de l'invention et statut pondéral des individus. Plusieurs travaux ont montré que la composition de la flore digestive jouait un rôle dans l'obésité, y compris des travaux expérimentaux chez la souris [Samuel BS, Gordon JI: A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103: 10011-10016; Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JI: Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102: 11070-11075; Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI: An obesityassociated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006, 444: 1027-1031]. En particulier, il a été montré que le ratio Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) était associé au phénotype obèse ou contrôle non-obèse, du à une réduction de la proportion de Bacteroidetes chez les personnes obèses, ce qui est étonnant car la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron a été associée à l'augmentation de l'obésité [Samuel BS, Gordon JI: A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Nat! Acad Sci U S A 2006, 103: 10011-10016]. Il a été montré que, au cours d'un régime alimentaire amaigrissant, la diminution du ratio F/B chez les patients obèses sous régime était corrélée avec la perte de poids, suggérant que la modulation de ce ratio pouvait constituer une intervention thérapeutique [Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI: Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 2006, 444: 1022-1023]. Les promoteurs de la prise de poids comme les bactéries du genre Lactobacillus pourraient être impliqués dans ces interventions thérapeutiques, leur rôle ayant été montré dans l'engraissement des animaux de rapport [Khan M, Raoult D, Richet H, Lepidi H, La Scola B: Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Cependant, la mesure du ratio F/B n'est réalisée actuellement que par des méthodes de métagénomiques, de puce ADN et de séquençage de larges librairies de clones du gène 16S ARN ribosomal, qui sont du domaine de la recherche mais ne sont pas applicables en routine diagnostique. Les inventeurs ont donc pensé utiliser l'invention pour déterminer de manière fiable le ratio F/B par une technique de PCR temps réel, applicable en routine. Après avis favorable du Comité d'Ethique, la technique de quantification selon l'invention a été appliquée à une population de 20 personnes obèses (17 to 72 ans; indice de masse corporelle IMC= 47.09 10.66), de 20 personnes contrôles (non-obèses, non-anorexiques ; (13 to 68 ans; IMC =20.68 2.014) et de 9 personnes présentant une anorexie mentale (19 to 36 ans; IMC= 12.73 1.602).
Les résultats (Tableau 2) indiquent que la quantification des Firmicutes est comparable pour les trois groupes. Les inventeurs ont donc observé que contrairement aux données publiées dans la littérature, les selles des personnes obèses présentent une plus faible quantité de Bacteroidetes (Figure 2) avec une différence statistiquement significative entre le groupe obèses et contrôles d'une part (** p<0.01), et entre le groupe anorexie et contrôle, d'autre part (*p<0.05). Le nombre de Lactobacillus est plus élevé chez les personnes obèses bien que la différence avec les deux autres groupes ne soit pas statistiquement significative. Cependant, en utilisant une valeur seuil de 106 Lactobacillus, la différence du nombre de Lactobacillus entre personnes obèses et contrôles (p=0.0197) et anorexiques (p= 0.0332) est significative (Figure 3). La détection systématique et la quantification de Methanobrevibacter smithii ont permis aux inventeurs d'observer que le nombre de Methanobrevibacter smithii (Figure 4) est plus élevé chez les obèses que chez les contrôles avec un ratio obèses/contrôles de 1.72 mais cela de façon non statistiquement significative. En revancheä les inventeurs ont observé de façon imprévue que le nombre de Methanobrevibacter smithii était plus important chez les anorexiques, d'un facteur 3 et 5 respectivement par rapport aux contrôles et aux obèses et que la quantité de Methanobrevibacter smithii était significativement plus importante chez les anorexiques que chez les obèses (p=0.0501). Le taux de Methanobrevibacter smithii est donc intéressant à relever pour une personne suspectée d'anorexie. Au total, les obèses ont une flore digestive pauvre en Bacteroidetes et riche en Lactobacillus. La flore des anorexiques est similaire à celle des contrôles pour les quantités de Firmicutes, Bacteroidetes et Lactobacillus mais contient plus de Methanobrevibacter smithii. Le procédé de détection et de quantification des composants bactériens du microbiote utilisé et proposé à brevet par les inventeurs, permet la détection et la quantification spécifique, fiable, rapide et répétitive de ces quatre groupes de microorganismes dans un grand nombre d'échantillons de selles. Ce procédé peut être très facilement utilisé en pratique courante dans les laboratoires.
Tableau 1. Liste des ADNs microbiens utilisés pour déterminer la sensibilité / spécificité des PCRs en temps réel pour la détection des micro-organismes appartenant aux groupes Firmicutes et Bacteroidetes, dans les selles.
A = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Bacteroidetes. B = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Firmicutes. (Les résultats sont exprimés en Ct; les valeurs en caractères gras 10 indiquent les espèces bactériennes pour lesquelles il existe un défaut de spécificité du système). A B Prevotella bivia 17,09 > 45 Prevotella disiens 16,7 > 45 prevotella oulara 16,45 > 45 prevotella albensis 19,31 > 45 prevotella buccae 18,64 > 45 prevotella denticola 16,69 > 45 prevotella intermedia 17,25 > 45 prevotella nigrescens 17,99 > 45 prevotella melaninogenica 16,3 > 45 prevotella corporis 15,18 > 45 prevotella oris 36,52 > 45 Bacteroides fragilis 20,37 > 45 Bacteroides vulgatus 20,36 > 45 Bacteroides thetaiotaomicron 21,27 > 45 Bacteroides ovatus 19,35 > 45 alistipes finegoldii 21,58 > 45 alistipes putrenidis 20,26 > 45 captocytophaga sputigena 18,56 > 45 captocytophaga ochracea 18,16 > 45 captocytophaga ochracea 18,18 > 45 captocytophaga ochracae 18,36 > 45 captocytophaga haemolytica 18,83 > 45 captocytophaga granulosa 18,62 > 45 captocytophaga granulosa 20,31 > 45 captocytophaga gingivalis 20,01 > 45 captocytophaga haemolytica 22,57 > 45 captocytophaga cynodegmi 17,15 > 45 captocytophaga canimorsus 23,04 > 45 fusobacterium nucleatum 38,6 18,36 fusobacterium nucleatum > 45 21,86 fusobacterium nucleatum > 45 22,15 fusobacterium naviforme 39,55 22,5 fusobacterium nucleatum > 45 19,31 fusobacterium nucleatum/naviforme > 45 18,54 fusobacterium necrophorum 38,15 22,61 Bacillus cereus > 45 18,87 Paenibacillus massiliensis > 45 19,1 Paenibacillus timonensis > 45 20,73 Paenibacillus sanguinis > 45 19,73 Streptococcus gordonii > 45 19,49 Streptococcus suis > 45 20,2 Streptococcus vestibularis > 45 25,39 Streptococcus pyogenes > 45 24,84 Streptococcus peronis > 45 23,2 Streptococcus infantis > 45 19,85 Streptococcus cristatus > 45 23,28 Streptococcus thermophilus > 45 21,02 Streptococcus parasanguinis > 45 19,43 Abiotrophia defective > 45 19,62 Gemella sanguinis > 45 18,9 Gemella bergeri > 45 20,48 Enterococcus avium > 45 19,73 Enterococcus gilvus > 45 22,2 Enterococcus hirae > 45 21,56 Enterococcus faecalis > 45 22,16 Enterococcus raffinosus 36,51 28,54 Enterococcus casseliflavus > 45 23,38 Enterococcus durans > 45 20,81 Staphylococcus aureus > 45 25,59 Corynebacterium accolens > 45 41,35 Corynebacterium afermentans sub > 45 39,7 afermentans Corynebacterium afermentans sub> 45 39,99 lipophilum Corynebacterium amycolatum > 45 39,51 Corynebacterium coyleae > 45 39,6 Corynebacterium seminale > 45 32,28 Corynebacterium urealyticum 39,73 43,96 Staphylococcus capitis > 45 22,53 Staphylococcus arlettae > 45 21,47 Staphylococcus hominis > 45 23,81 Staphylococcus simulans > 45 21,61 Staphylococcus caprae > 45 24,89 Streptococcus mutans 40,59 27,67 Streptococcus oralis > 45 20,7 Streptococcus salivarius 38,27 28,67 Streptococcus sanguinis > 45 26,3 Streptococcus constellatus > 45 29,48 Streptococcus mitis > 45 26,03 Lactobacillus graminis > 45 29,99 Lactobacillus acidophilus > 45 28,9 Lactobacillus crispatus > 45 24,51 Lactobacillus equi > 45 25,49 Lactobacillus iners > 45 27 Enterococcus faecium > 45 27,5 Enterococcus faecium > 45 26,27 Enterococcus faecalis > 45 17,23 Bacillus odysseri > 45 23,8 Bacillus neidei > 45 22,13 Bacillus pycnus > 45 24,29 Clostridium innocuum > 45 20,32 Clostridium paraputrificum > 45 15,72 Bacteroides uniformis 15,47 > 45 Bacteroides vulgatus 16,52 > 45 Bacteroides caccae 15,17 > 45 Clostridium beijerinckii > 45 18,63 Clostridium putrificum > 45 16,69 Clostridium septicum > 45 19,89 Clostridium perfringens > 45 15,8 Clostridium histolyticum > 45 16,33 Clostridium difficile > 45 16,91 Clostridium bifermentans > 45 22,04 Clostridium thiosulforeducens > 45 14,21 Clostridium saccharolyticum > 45 15,6 Clostridium butyricum > 45 12,89 Acidaminococcus fermentans > 45 20,15 Acidaminococcus intestini > 45 25,65 Parabacteroides distasonis 9,62 > 45 Peptostreptococcus anaerobius > 45 16,54 Eubacterium saburreum > 45 24,065 Tableau 2. Quantification, selon le procédé de l'invention, des bactéries des phyla Bacteroidetes, Firmicutes, Lactobacillus et de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles de 49 individus contrôles (lean), obèses (Ob) ou présentant une maigreur liée à une anorexie mentale (ano). Nombre de bacteria/Archae par g de selles Exemple Bacteroidetes Firmicutes Lactobacillus M.smithii Leani 3,26E+10 4,68E+10 0,00E+00 8,16E+07 Leang 5,08E+10 4,60E+10 0,00E+00 4,56E+08 Lean3 2,91E+10 5,40E+10 0,00E+00 1,93E+04 Lean4 1,62E+10 1,52E+10 0,00E+00 2,55E+08 Lean5 2,87E+09 9,00E+09 0,00E+00 0,00E+00 Lean6 6,12E+09 1,49E+10 0,00E+00 2,77E+03 Lean7 1,02E+10 1,45E+10 9,64E+05 6,72E+07 Lean8 6,80E+09 1,52E+10 0,00E+00 0,00E+00 Lean9 7,88E+09 1,72E+10 0,00E+00 8,80E+08 LeanlO 5,20E+09 3,46E+10 5,44E+07 5,72E+02 Lean11 3,18E+10 2,15E+10 4,80E+04 7,24E+05 Lean12 1,58E+09 2,14E+09 1,08E+04 2,96E+06 Lean13 9,44E+09 1,72E+10 0,00E+00 0,00E+00 Lean14 1,67E+10 4,32E+10 0,00E+00 0,00E+00 Lean15 3,05E+10 3,37E+10 0,00E+00 2,02E+08 Lean16 2,15E+09 1,70E+10 0,00E+00 0,00E+00 Lean17 2,03E+09 4,16E+09 0,00E+00 8,64E+06 Lean18 4,72E+09 1,39E+10 0,00E+00 6,68E+02 Lean19 3,33E+09 1,06E+10 0,00E+00 2,53E+06 Lean20 2,06E+08 4,68E+08 2,37E+04 9,16E+04 Moyenne 1,35E+10 2,16E+10 2,77E+06 9,78E+07 Obi 1,93E+10 3,82E+10 4,36E+08 3,62E+06 Ob2 3,85E+09 5,84E+10 3,36E+06 0,00E+00 Ob3 1,77E+08 3,80E+09 1,29E+06 1,96E+02 Ob4 4,92E+09 9,80E+09 0,00E+00 6,16E+08 Ob5 2,01E+10 2,44E+10 0,00E+00 0,00E+00 Ob6 5,44E+08 4,44E+09 0,00E+00 5,48E+03 Ob7 1,05E+10 1,50E+10 0,00E+00 3,15E+02 Ob8 1,63E+09 6,04E+09 4,28E+07 0,00E+00 Ob9 1,94E+09 7,20E+09 3,61E+08 4,68E+03 Obi0 2,68E+08 1,14E+10 2,21E+07 0,00E+00 Ob11 9,08E+08 8,84E+09 0,00E+00 1,01E+09 Ob12 4,76E+07 2,20E+09 5,28E+06 2,76E+04 Ob13 2,14E+09 1,12E+10 0,00E+00 1,40E+04 Ob14 1,34E+08 1,30E+10 0,00E+00 6,76E+02 Ob15 6,20E+09 2,14E+10 0,00E+00 5,44E+02 Ob16 7,20E+08 2,79E+09 3,96E+06 3,88E+02 Ob17 6,60E+08 6,44E+09 0,00E+00 1,14E+03 Ob18 2,96E+08 5,52E+09 1,96E+05 1,45E+09 Ob19 3,37E+08 6,28E+09 0,00E+00 2,82E+08 Ob20 5,80E+08 1,74E+10 0,00E+00 6,96E+05 Moyenne 3,76E+09 1,37E+10 4,38E+07 1,68E+08 Anal 5,60E+08 5,44E+09 5,56E+05 5,08E+03 Ano2 4,72E+08 6,72E+09 0,00E+00 1,17E+04 Ano3 2,84E+09 1,36E+10 2,30E+04 4,48E+08 Ano4 2,44E+10 1,98E+10 0,00E+00 3,82E+08 Ano5 7,12E+09 1,42E+10 0,00E+00 3,19E+03 Ano6 3,59E+10 1,48E+10 0,00E+00 9,40E+08 Ano7 6,24E+09 1,26E+10 0,00E+00 7,12E+02 Ano8 1,09E+10 2,04E+10 0,00E+00 8,84E+08 Ano9 6,60E+09 7,24E+09 1,45E+05 2,08E+09 Moyenne 1,06E+10 1,28E+10 8,04E+04 5,26E+08
Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, caractérisé en ce que l'on contrôle la qualité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on détecte un ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii.
- 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on quantifie le nombre de copie d'ADN d'au moins une séquence d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative, choisie parmi les séquences spécifiques suivantes : - une séquence tirée du gène tirée du gène 16S de l'ARN ribosomal, SEQ. ID. N°1 = 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTC AGAATCGTTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGA 15 ATTTCACCTCTACCCTGGGAG -3', et, - une séquence tirée du gène rpoB, SEQ. ID. N°5 = 5'-AAGGGATTTG CACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAAC CCCAGAGGGTCCTAACTGTGGTC -3'
- 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que 20 l'on quantifie le nombre de copies dudit ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative en temps réel comprenant la co-amplification enzymatique de type PCR d'une séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii contenue d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon de selles, et d'autre part dans un 25 échantillon des fragments d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii étant choisie parmi les séquences suivantes ou leurs séquences complémentaires :• une séquence du gène 16S ARN amplifiable par les séquences amorces suivantes : - Amorce sens, SEQ. ID. N°2 : 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3', et - Amorces antisens, SEQ. ID. N° 3 : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3', et • une séquence du gène rpoB amplifiée par des amorces de séquences suivantes : - Amorce sens, SEQ. ID. N°6 : 5'- AAGGGATTTGCACCCAACAC -3', et - Amorces antisens, SEQ. ID. N°7 : 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'.
- 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on quantifie au moins deux séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii tirées respectivement du gène 16S ARN ribosomal et du gène rpoB.
- 5. Méthode selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on réalise une réaction d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, en mettant en oeuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, à savoir : 1) pour la séquence du gène 16S ARN ribosomal, SEQ. ID N°4 = 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3', et 2) pour la séquence du gène rpoB, SEQ. ID N°8 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3', et- un grand fragment d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant des dites séquences spécifiques, de préférence sous forme de plasmide, avec une pluralité d'échantillons de grand fragment d'ADN synthétique de concentrations différentes connues.
- 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'on quantifie en outre conjointement dans ledit ADN extrait dudit échantillon de selles, au moins une séquence spécifique choisie parmi : 1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et 2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et 3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
- 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'on réalise une méthode d'amplification quantitative par PCR à l'aide des amorces suivantes : • pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes : - amorces sens : SEQ. ID N°9 = 5'-AGCAGCCGCGGTAAT-3', - amorces antisens : SEQ. ID N°10 : 5'-CTAHGCATTTCACCGCTAC-3', • pour ladite séquence consensus spécifique de Lactobacillus spp. . - amorces sens : SEQ. ID N°13 = 5'- TACATYCCAACHCCAGAACG - 3', dans laquelle Y désigne C ou T, H désigne A ou C ou T, et- amorces antisens : SEQ. ID N°14 = 5' AAGCAACAGTACCACGACCA -3'. • pour ladite séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes - amorces sens : SEQ. ID N°17 = 5'- GTCAGCTCGTGTCGTGA-3', et - amorces antisens : SEQ. ID N°18 = 5'-CCATTGTAKYACGTGTGT- dans laquelle K désigne G ou T et Y désigne C ou T.
- 8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle on met en oeuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en temps réel à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques choisies parmi les séquences suivantes : 1) pour ladite séquence spécifique du phylum Bacteroidetes : SEQ. ID N°11 = 5'-GGGTTTAAAGGG-3' 2) pour ladite séquence consensus spécifique de Lactobacillus spp. . SEQ. ID N°15 : 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3', dans laquelle R désigne A ou G. 3) pour ladite séquence consensus spécifique du phylum 20 Firmicutes : SEQ. ID N°19 : 5'-GTCAANTCATCATGCC-3', dans laquelle N désigne, soit I, soit A, T, C ou G.
- 9. Méthode selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'on réalise la quantification des quatre dites séquences 25 spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre 3'Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et de préférence du phylum Firmicutes.
- 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de la bactérie Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et respectivement du phylum Firmicutes, pour assurer le diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'un individu.
- 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit 10 échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles : 1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, de préférence à une dilution de 50 à 150 g/l, et 2) on réalise une lyse mécanique par mélange et agitation de 15 ladite suspension de l'étape 1 avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, et 3) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation de la suspension obtenue à l'étape 2 avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis 20 4) on répète l'étape 2) avec le mélange obtenu à l'étape 3), et 5) de préférence, on répète l'étape 3) avec le mélange obtenu à l'étape 4).
- 12. Trousse de détection utile pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce 25 qu'elle comprend des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR et au moins un jeu d'oligonucléotides amorces et de préférence en outre au moins un oligonucléotide sonde d'hydrolyse utile pour une détection et quantification par amplificationpar PCR, de préférence par PCR en Temps Réel, comprenant au moins des couples d'oligonucléotides amorces, aptes à amplifier : - au moins une séquence spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii, et - au moins une séquence choisie parmi : 1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et 2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacillus, et 3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
- 13. Trousse selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'un des deux couples d'oligonucléotides amorces et, de préférence au moins l'un des oligonucléotides sondes d'hydrolyse, aptes à amplifier l'une au moins desdites séquences de Methanobrevibacter smithii tirées du gène 16S de l'ARN ribosomal et respectivement du gène rpoB suivants : a) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°2 et SEQ. ID N°3 et, de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de 20 séquence SEQ. ID N°4, et b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°6 et SEQ. ID N°7, et de préférence l'oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°8.
- 14. Trousse de détection selon la revendication 12 ou 13, 25 caractérisée en ce qu'elle comprend les couples d'oligonucléotides amorces avec de préférence les oligonucléotides sondes d'hydrolyse, suivantsa) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°9 et SEQ. ID N°10, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°11 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes et, b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°13 et SEQ. ID N°14, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°15 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus et, c) de préférence, le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°17 et SEQ. ID N°18, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°19 pour l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.
- 15. Trousse de détection selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend des réactifs d'extraction comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique.
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