CN115807013B - 一种phoP基因突变体、应用及其验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，公开了一种phoP基因突变体、应用及其验证方法，phoP基因突变体与野生型phoP基因相比，具有c.C58A的突变，phoP基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，phoP突变基因片段的扩增引物序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。本发明通过检测phoP基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法，本发明所构建的phoP突变基因检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因检测技术领域，尤其涉及一种phoP基因突变体、应用及其验证方法。
背景技术
肠杆菌属(Enterobacter spp.)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是与Leclercia和Lelliottia属接近的不形成孢子的革兰阴性杆菌。肠杆菌属是肠杆菌科中仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的第三大最常见的人类病原体，以香坊肠杆菌、霍氏肠杆菌、阴沟肠杆菌为主要常见菌种。肠杆菌在自然界广泛分布，是引起植物病害众所周知的病原体。肠杆菌属也是人肠道共生菌群的一部分，是人类感染，尤其是医院获得性感染的常见病原体，因此具有重要的临床意义。
多粘菌素是一类环状的，带有正电荷的、多肽类抗菌药物，是在上世纪40年代最早被发现的对革兰阴性菌具有杀菌作用的药物之一。在上世纪70年代因其神经毒性和肾毒性逐渐被新的抗菌药物替代。但随着临床上革兰阴性菌耐药情况愈加严峻，多重耐药菌使人们可以选择的药物越来越少，因此近十年来人们又开始重新重视和使用多粘菌素，并将其视为革兰阴性菌抗菌药物的最后一道防线。然而随着多粘菌素的重新使用和临床应用的增加，越来越多关于多粘菌素耐药菌株报告，包括肺炎克雷伯菌、肠杆菌属细菌，鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等，都已经出现了对多粘菌素耐药的相关报告。
PhoPQ双组分调控系统可通过脂多糖修饰途径介导多粘菌素耐药。目前已报道多个位点的phoP基因突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过phoP基因的以上突变位点。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前phoP基因突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过phoP基因的以上突变位点。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种phoP基因突变体、应用及其验证方法。
本发明是这样实现的，一种phoP基因突变体，所述phoP基因突变体的突变基因序列为SEQ ID NO：1。
进一步，所述phoP基因突变体与野生型phoP基因相比具有c.C58A的突变。
本发明的另一目的在于提供一种所述phoP基因突变体在制备阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测试剂盒中的应用。
进一步，所述阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测试剂盒通过检测所述phoP基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述phoP基因突变体的phoP基因突变体的验证方法，所述phoP基因突变体的验证方法包括以下步骤：
步骤一，设计引物：根据多粘菌素耐药突变株120027_3B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物；
步骤二，目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_3B_phoPQC58A；
步骤三，pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4h，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
步骤四，pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16℃条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A；
步骤五，将步骤四中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到对多粘菌素E敏感的受体菌株120027_A中，得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A；
步骤六，多粘菌素MIC：对以上通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测其多粘菌素E的MIC。
进一步，所述步骤一中的上下游引物分别带上NotI和XhoI限制性内切酶序列，所述上游引物PhoPQ_NotI_Up的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述下游引物PhoPQ_XhoI_Dw的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
进一步，所述phoP基因突变体的验证方法还包括：经过克隆验证，所述phoP基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值从1mg/L升高至8mg/L。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述phoP基因突变体的基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法，所述基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法包括：
(1)对120027菌株的phoP基因突变位点两端在primer3网站设计引物；
(2)进行高保真PCR产物扩增，最终扩增得到PCR产物；
(3)将包含120027菌株的phoP基因突变位点的PCR产物进行Sanger一代测序；
(4)将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
进一步，所述步骤(1)中，上游引物120027_3B_phoP_up的序列为SEQ ID NO：4，下游引物120027_3B_phoP_dw的序列为SEQ ID NO：5。
所述步骤(2)中最终扩增得到的PCR产物序列为SEQ ID NO：6。
进一步，所述步骤(2)中的高保真PCR产物扩增包括：
PCR反应体系为25μL，包括高保真PCR聚合酶12.5μL，ddH2O8.5μL，引物_up 1μL，引物_dw 1μL，DNA模板2μL。
所述PCR反应条件包括：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，变性-退火-延伸共30个循环，再延伸72℃5min。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明公开了基因突变体及其应用；其中，该基因突变体，与野生型phoP基因相比，具有下列突变：c.C58A。经过克隆验证这个突变体可以导致阴沟肠杆菌对多粘菌素E的MIC值上升8倍(MIC从1mg/L升高至8mg/L)。因此，本发明通过检测这个突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明通过检测phoP基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
第三，本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：目前，已报道phoP基因多个位点的SNP突变可介导肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药，但是还未报道过可介导多粘菌素耐药的phoP基因的c.C58A这个突变位点。本发明针对以上SNP突变进行了克隆验证，将带有SNP突变的基因克隆到原始不含突变位点的菌株中，原始菌株对多粘菌素的MIC值上升8倍(MIC从1mg/L升高至8mg/L)，证实了这个SNP突变可介导多粘菌素耐药。因此，本发明通过检测phoP突变基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种phoP基因突变体、应用及其验证方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的phoP基因突变体与野生型phoP基因相比具有c.C58A的突变；其中，phoP基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明实施例提供的phoP突变基因序列SEQ ID NO：1为：
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本发明实施例提供的菌种属于现有，来源于本实验室，已上传NCBI：
本发明涉及1株细菌
120027：收录编号：120027R1
WGS accession no：JAHESX000000000
BioSample：SAMN19316149。
本发明实施例提供了一种phoP基因突变体在制备阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测试剂盒中的应用。
本发明实施例通过检测phoP基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。
本发明实施例提供的phoP基因突变体的验证方法包括以下步骤：
(1)设计引物：根据多粘菌素耐药突变株120027_3B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物；
(2)目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_3B_phoPQC58A；
(3)pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4h，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用；
(4)pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16℃条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A；
(5)将步骤(4)中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到对多粘菌素E敏感的受体菌株120027_A中，得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A；
(6)多粘菌素MIC：对以上通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测其多粘菌素E的MIC。
如图1所示，本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法包括以下步骤：
S101，对120027菌株的phoP基因突变位点两端在primer3网站设计引物；
S102，进行高保真PCR产物扩增，最终扩增得到PCR产物；
S103，将包含120027菌株的phoP基因突变位点PCR产物进行Sanger一代测序；
S104，将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
本发明实施例提供的phoP基因突变体的验证方法还包括：经过克隆验证，phoP基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值上升8倍。
本发明实施例提供的phoP基因突变体导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值从1mg/L升高至8mg/L。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用的应用实施例。
本发明公开了基因突变体及其应用；其中，该基因突变体，与野生型phoP基因相比，具有下列突变：c.C58A。经过克隆验证这个突变体可以导致阴沟肠杆菌对多粘菌素的MIC值上升8倍(MIC从1mg/L升高至8mg/L)。因此，本发明通过检测这个突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，可以有效地检测阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药。此外，本发明还提供了基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取多粘菌素耐药基因突变信息，有助于肠杆菌属细菌对多粘菌素耐药的机制分析。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
实施例1
本发明实施例提供的phoP基因突变体的验证方法包括：
(1)设计引物：根据多粘菌素耐药突变株120027_3B含有SNP突变的phoPQ基因序列用primer3在线网站设计针对phoPQ基因的上下游引物。上下游引物分别带上NotI和XhoI限制性内切酶序列。
SEQ ID NO：2：PhoPQ_NotI_Up：aaaaaagcggccgcccaggctcaggtcaacatact；
SEQ ID NO：3：PhoPQ_XhoI_Dw：aaaaaactcgagattccgcaggctcttactga。
(2)目的基因PCR扩增：使用phoPQ基因的上下游引物通过PCR仪针对phoPQ基因进行PCR扩增，分别得到120027_3B_phoPQC58A。
(3)pET28a(+)-rmtB质粒双酶切和胶回收纯化：使用NotI和XhoI限制性内切酶在37度条件下双酶切pET28a(+)-rmtB质粒4小时，得到线性pET28a(+)-rmtB质粒；跑胶验证双酶切成功，并使用胶回收纯化试剂盒对线性质粒进行胶回收纯化，备用。
(4)pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ连接：使用T7连接酶将pET28a(+)-rmtB线性质粒和目的基因phoPQ在16度条件下过夜连接，分别得到重组质粒pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A。
(5)将步骤(4)中连接得到的重组质粒pET28a(+)-rmtB-phoPQ通过电穿孔克隆到对多粘菌素E敏感的受体菌株120027_A中，得到重组菌株120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A。
(6)多粘菌素MIC：对以上通过克隆获得的重组菌株使用微量肉汤稀释法检测其多粘菌素E的MIC，结果如下：120027_A::pET28a(+)-rmtB_120027_3B_phoPQC58A对多粘菌素的MIC值上升8倍(MIC从1mg/L升高至8mg/L)，证实这些SNP突变可介导120027_3B对多粘菌素耐药(见表1)。
表1菌株及其对应的多粘菌素E_MIC
实施例2
本发明实施例提供的基于Sanger测序的phoP突变基因检测方法包括：
(1)对120027菌株的phoP基因突变位点两端设计引物；
本发明针对120027菌株的phoP基因突变位点两端在primer3网站上设计以下引物：引物设计具体步骤如下：
1)打开“Primer3 Input 0.4.0”站点(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。
2)粘贴模板序列。在“Paste source sequence below(5'->3'…”下面的大空框里粘贴模板序列。
3)重要参数设定。设置“Product Size Ranges”为250-300，其他均为默认值。
4)点击Pickprimers，得到符合大小预期的primer。
5)引物设计检验：使用OligoCalc在线网站(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)检验引物的GC含量、TM值、发夹结构等；择优选取合适引物。
PCR引物：由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，具体序列见表2。
表2 phoP基因测序引物表
(2)进行高保真PCR产物扩增；
1、PCR反应体系(25μL)：
2、PCR反应条件：
变性-退火-延伸共30个循环
再延伸72℃5min
3、最终扩增得到的PCR产物序列(见表3)。
表3最终扩增得到的PCR产物序列
(3)将包含120027菌株的phoP基因突变位点的PCR产物进行Sanger一代测序。
(4)将所测序列结果与原始序列进行Blast比对。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种phoP基因突变体，其特征在于，所述phoP基因突变体的突变基因序列为SEQ IDNO：1。
2.如权利要求1所述phoP基因突变体，其特征在于，所述phoP基因突变体与野生型phoP基因相比具有c.C58A的突变。
3.一种如权利要求1~2任意一项所述phoP基因突变体在制备阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述phoP基因突变体介导阴沟肠杆菌对多粘菌素耐药，导致阴沟肠杆菌对多粘菌素E的MIC值从1 mg/L升高至8 mg/L；
所述沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测试剂盒通过检测所述phoP基因突变体在阴沟肠杆菌中是否存在，进而实现阴沟肠杆菌是否对多粘菌素耐药的检测。
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