CN113652424B - 一种提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子 - Google Patents
一种提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，表达谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌基因组中采用该启动子时，能够显著促进谷氨酰胺转氨酶基因转录水平的提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种可提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子，具体地说，涉及一种用于在茂源链霉菌中提高谷氨酰胺转氨酶基因转录水平的启动子突变体及其在促进谷氨酰胺转氨酶表达中的用途。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase，TG)又称转谷氨酰胺酶，是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense或Streptomyces mobaraensis)产生的。TGase主要催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团与伯胺化合物(酰基受体)之间发生酰基转移反应，使蛋白质发生共价交联，通过胺的导入、交联及脱胺三种途径改变蛋白质的功能性质。TGase介导的分子交联能够改善蛋白质的热稳定性、持水力等特性，有助于形成强有力的凝胶，改善蛋白质的品质。由于TGase具有非常特殊的结构及强交联能力，目前作为一种新型的食品添加剂，在世界范围的食品工业中广泛应用。包括在肉制品中可以改善经机械处理的肉制品的质地和结构，通过交联作用增强凝胶性，减轻断裂程度，从而提升产品品质并提高持水力；在乳制品中，提高酸奶质量，改善乳蛋白的乳化特性及提高乳蛋白的热稳定性等；在食品包装及膜领域被广泛用于改善生物聚合物的薄膜的机械和阻隔性能，如明胶、蛋清蛋白、乳清蛋白及其与果胶、壳聚糖的组合等等。同时，在面制品、烘焙食品以及大豆蛋白产品等食品加工业中同样有巨大的应用市场。
转谷氨酰胺酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌，是我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产转谷氨酰胺酶的安全菌株。
由于TGase酶具有广阔的应用场景，提高工业生产中TGase酶的产量水平具有重要的经济意义。
发明内容
提高谷氨酰胺转氨酶基因的转录水平，以此增加谷氨酰胺转氨酶是一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的重要方法。我们在对目前在工业上生产谷氨酰胺转氨酶中使用的工业菌株茂原链霉菌TDSX01(茂源链霉菌DSM 40587的诱变衍生菌株，泰兴市东圣生物科技有限公司持有)进行诱变过程中，筛选到一株谷氨酰胺转氨酶酶活力提高幅度较大的突变菌株TDSX02。通过比较基因组学研究发现，谷氨酰胺转氨酶序列并没有发生突变，而其上游的启动子序列发生了突变，核苷酸序列由SEQ ID NO:2突变为SEQ ID NO:1，第271位的碱基G突变为A。经过进一步的实验研究，发现该启动子突变体SEQ ID NO:1能够有效地促进谷氨酰胺转氨酶基因的转录，从而提升谷氨酰胺转氨酶产量。这一研究发现构成了本发明的基础。因此，本发明包含如下技术方案：
一种提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子，其特征在于，其选自：
(1)核苷酸序列为SEQ ID NO:1的多核苷酸；
(2)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多核苷酸，该多核苷酸具有SEQ ID NO:1的功能；
(3)与(1)-(2)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
5’-GGCGGCGCCGCCTCGGGTACCGGCGCGGGGCGGGAAGCGGGAGTTCCTCCGCGAAGTCGAAGTCCTCCAAGGCGAGTCCAAGCGCCTTCCCTTGCCCGAGGCCAGCGCCGACCCTGCTGCGTCGATGACGGACGCAGGCGCACCGAGTCCCGCGGTCTCGCTCGCCCGGAGGGGATGCGGCGGTGTCCGGCGCCCAGCCGGATTCCGCTCCTGTGACGGAGTGGCCGGTTTTGGAGCCGTGGTGTTGCCGGGGAGTTAACTGGGAGACATAATCACTTCTCGTAGCGACCCGATCACTCGTCCGGGAGTCGAGAAGTGTTACGCCGAACCCCATTCCGCACCATCACCCCTGCCGCCGTGACCGCGGCCGGCAGTCTGCCTCTCGCCGAGAGAGCCACCCGGAGAACCGCCCGGACGGGGTCCGCTTCACCGCTCCGGTGACGGCTTCGACGTAACACGACCGCGCCGTCACCGGCCGTATCCGGTACGCACCGCATCCCCATTCCGCCGTGCGGCCGCGGCCTCTTCCTCACCGCCGTTACCGGCGCGGCACCGCAGGACGGGCACCGCCCGACGTTATGCGCGGCCACTCGCCGCAACCTCCACCCCCCGCGTCGCACTCTGGCATGCCCTCGTTCCGCGAGGTTCGCCAGATTCAGCCCTTTCGTCACGTTCGCCAAAGGAGTTGTTGTTCTTC-3’(SEQ ID NO:1)。
优选地，上述谷氨酰胺转氨酶由茂源链霉菌表达。
所述茂源链霉菌可以选自茂源链霉菌DSM 40587及其衍生菌株。例如，茂源链霉菌DSM 40587的衍生菌株可选自泰兴市东圣生物科技有限公司持有的茂原链霉菌TDSX01、江苏东汇生物科技有限公司持有的菌株CCTCC NO:M 2020194、CCTCC NO:M 2020195、CCTCCNO:M 2020196或者CCTCC NO:M 2020197(参见专利文献CN202010666904.3)，上海东之汇生物科技有限公司持有的菌株CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148(参见专利文献CN202010645600.9)。
本发明的第二个方面提供了一种谷氨酰胺转氨酶基因表达盒，其包含上述的启动子和位于其下游的谷氨酰胺转氨酶基因。
本发明的第三个方面提供了一种包含上述谷氨酰胺转氨酶基因表达盒的质粒，优选适合于在茂源链霉菌中表达的质粒。
本发明的第四个方面提供了一种茂源链霉菌工程菌，其基因组中包含上述的启动子或者上述谷氨酰胺转氨酶基因表达盒。
上述茂源链霉菌工程菌的构建方法可以包括如下步骤：
通过基因编辑技术，将茂源链霉菌的基因组中位于谷氨酰胺转氨酶基因上游的启动子的-10区碱基即谷氨酰胺转氨酶基因ATG上游427位碱基由G变为A，筛选阳性克隆株；或者
通过基因编辑技术，将上述的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒整合入茂源链霉菌的基因组中，筛选阳性克隆株；或者
将上述包含谷氨酰胺转氨酶基因表达盒的质粒转化入茂源链霉菌感受态细胞中，筛选阳性克隆株。
上述基因编辑技术可以采用同源双交换、CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。
显然，基因组中包含上述启动子的茂源链霉菌工程菌能够用于生产谷氨酰胺转氨酶。具体而言，通过上述茂源链霉菌工程菌的发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
在茂源链霉菌工程菌发酵时，发酵培养基组成如下：15～25g/L甘油，4～7g/L酵母粉，20～40g/L蛋白胨，2g～4/L MgSO4·7H2O,1～3g/L K2HPO4·3H2O，NaOH调至pH7.0～7.4。
优选发酵培养基组成如下：15g/L甘油，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，3g/L MgSO4·7H2O，2g/L K2HPO4·3H2O，NaOH调至pH7.4。
上述发酵的温度可以为30±2℃。
相较茂源链霉菌DSM40587及其衍生菌株中的初始启动子SEQ ID NO:2，本发明的启动子突变体SEQ ID NO:1能够强化谷氨酰胺转氨酶的转录水平，从而促进谷氨酰胺转氨酶在茂源链霉菌中的表达分泌，提高了谷氨酰胺转氨酶的工业生产经济性。
附图说明
图1是出发菌株TDSX001与诱变菌株TDSX002分泌谷氨酰胺转氨酶的产酶水平比较柱形图。
图2显示了出发菌株TDSX001与诱变菌株TDSX002基因组中谷氨酰胺转氨酶基因的启动子测序结果对比图。
图3是原始菌株DMS40587与工程菌株TDSX003中谷氨酰胺转氨酶基因转录水平对比图。
图4显示了原始菌株DMS40587与工程菌株TDSX003发酵液中谷氨酰胺转氨酶蛋白电泳对比图。
具体实施方式
工业菌株茂原链霉菌TDSX01基因组中谷氨酰胺转氨酶基因上游的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：
5’-GGCGGCGCCGCCTCGGGTACCGGCGCGGGGCGGGAAGCGGGAGTTCCTCCGCGAAGTCGAAGTCCTCCAAGGCGAGTCCAAGCGCCTTCCCTTGCCCGAGGCCAGCGCCGACCCTGCTGCGTCGATGACGGACGCAGGCGCACCGAGTCCCGCGGTCTCGCTCGCCCGGAGGGGATGCGGCGGTGTCCGGCGCCCAGCCGGATTCCGCTCCTGTGACGGAGTGGCCGGTTTTGGAGCCGTGGTGTTGCCGGGGAGTTAACTGGGAGACATGATCACTTCTCGTAGCGACCCGATCACTCGTCCGGGAGTCGAGAAGTGTTACGCCGAACCCCATTCCGCACCATCACCCCTGCCGCCGTGACCGCGGCCGGCAGTCTGCCTCTCGCCGAGAGAGCCACCCGGAGAACCGCCCGGACGGGGTCCGCTTCACCGCTCCGGTGACGGCTTCGACGTAACACGACCGCGCCGTCACCGGCCGTATCCGGTACGCACCGCATCCCCATTCCGCCGTGCGGCCGCGGCCTCTTCCTCACCGCCGTTACCGGCGCGGCACCGCAGGACGGGCACCGCCCGACGTTATGCGCGGCCACTCGCCGCAACCTCCACCCCCCGCGTCGCACTCTGGCATGCCCTCGTTCCGCGAGGTTCGCCAGATTCAGCCCTTTCGTCACGTTCGCCAAAGGAGTTGTTGTTCTTC-3’(SEQ ID NO:2)。
本文中将启动子SEQ ID NO:2简称为初始启动子或者原始启动子，其实相对于突变的启动子SEQ ID NO:1而言的。为了表述方便起见，在本文中可以将初始型启动子SEQ IDNO:2与其突变体比如SEQ ID NO:1统称为“启动子”。
初始启动子SEQ ID NO:2与启动子突变体SEQ ID NO:1的差别仅在于谷氨酰胺转氨酶基因ATG上游427位即启动子序列SEQ ID NO:2中第271位碱基由G变为A。
我们也对该SEQ ID NO:2中第271位碱基由G进行了G→C突变、G→T突变和G→AA突变，分别获得了工程菌TDSX003-2、TDSX003-3和TDSX003-4，但经摇瓶发酵实验验证，发现工程菌TDSX003-2、TDSX003-3和TDSX003-4表达谷氨酰胺转氨酶的能力并没有提高，有时甚至低于原始菌株DSM40587中谷氨酰胺转氨酶基因的转录水平，提示该G→A突变属于正向突变。
当然，本发明并不排除SEQ ID NO:2中其他位置的碱基突变同样能产生增强谷氨酰胺转氨酶基因转录水平的正向突变的可能性，有待于进一步研究和尝试。
由于谷氨酰胺转氨酶基因是相对固定的，因此包含启动子突变体和位于其下游的谷氨酰胺转氨酶基因的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒很容易构建出来，这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法：
实施例中引物合成及基因测序皆委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
茂原链霉菌工程菌例如TDSX003等委托中国科学院上海生命科学研究院杨晟课题组通过CRISPR-Cas9系统构建。任何单位和个人都可以获得这些茂原链霉菌例如原始菌株DSM40587、工业菌株TDSX001、诱变菌株TDSX002和工程菌TDSX003等用于验证本发明，但未经泰兴市东圣生物科技有限公司允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。
PCR实验根据试剂盒说明书进行，必要时可以通过简单试验予以调整。
平板培养基(高氏一号)：20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO3，0.5g/L NaCl，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.5g/L K2HPO4·3H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，琼脂粉2％。
种子培养基：15g/L甘油，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，3g/L MgSO4·7H2O,2g/LK2HPO4·3H2O，103g/L蔗糖，NaOH调至pH7.4。
摇瓶发酵培养基：15g/L甘油，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，3g/L MgSO4·7H2O,2g/LK2HPO4·3H2O，NaOH调至pH7.4。
pH6.0磷酸缓冲液：K2HPO4 2g/L，KH2PO4 8g/L，0.1MPa灭菌20min。
通过测定菌株发酵液的酶活力高低或者谷氨酰胺转氨酶蛋白质的量，或者通过Real-time PCR检测谷氨酰胺转氨酶基因的转录水平，来评价茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶的能力，这是本领域技术人员容易理解的。
实施例1：突变株TDSX02的获得
如下为之前在对工业菌株TDSX01进行诱变时获得突变株TDSX02的具体过程：
1.1出发菌株TDSX01孢子悬液的制备
在茂原链霉菌TDSX01培养平板(高氏一号培养皿)中加入5ml无菌水，无菌牙签轻刮取菌体，用1ml移液器吹打混匀5次后放入100ml无菌锥形瓶中(装有2g的玻璃珠)，封瓶膜封口，放入恒温摇床200r/5min振荡打散菌体，用1ml移液器吸取菌液用无菌的带有0.45μm滤纸的漏斗过滤到新的无菌锥形瓶中，吸取滤液放入无菌2ml EP管(2管)，3000g/min10min离心，移液器吸取上清弃去，收集孢子悬液。
1.2亚硝基胍(NTG)化学诱变
将孢子悬液收集孢子后，每管加TM缓冲液(Tris-马来酸缓冲液，0.05mM pH8.5)1mL，用1mL移液器吹打混匀5次后，取1管加入已称好0.1mg亚硝基胍(NTG)的EP管中，另一管作对照不加NTG，用锡箔纸包裹加NTG的EP管后，把两个EP管放入30℃，200rpm摇床30min，加硫代硫酸钠缓冲液进行终止。后将样品3000g/min10min离心，移液器吸取上清弃去，加等体积缓冲重复两次后，加水重悬沉淀，将诱变后的孢子按照梯度稀释，取100μL涂布在高氏一号平板上，将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天。
1.3孔板初筛
在48孔板每个孔道中加入4-5个直径3mm玻璃珠，121℃、20min灭菌。在无菌48孔板中用排枪每孔加800μL的种子培养基(15g/L甘油，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，3g/L MgSO4·7H2O,2g/L K2HPO4·3H2O，103g/L蔗糖)，用无菌牙签挑取长出单菌落的一半放入种子培养基中进行搅拌混匀。将48孔板放入恒温摇床，220rpm，30℃培养24h后，以10v/v％接种量转接至新的无菌48孔板，每孔含有800μL发酵培养基(15g/L甘油，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，3g/L MgSO4·7H2O,2g/L K2HPO4·3H2O，NaOH调至pH7.4。)，继续放入恒温摇床，220rpm，30℃培养28h。
培养完成后从摇床中取出48孔板，3000rpm、2min离心，取10μL菌液放入新96孔板中，每孔加37℃预热A液100μL，放37℃恒温培养箱反应15min，每孔加100μL B液终止反应，用酶标仪在OD525 nm处读数，由标准曲线换算得到的公式，计算出TGase的酶活，将TG酶活高的菌株挑出。
其中，用于检测TG酶活的溶液A液和B液配制方法如下：
A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物N-α-CBZ-GLN-GLY于烧杯中，加350mL水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。
B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl3溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。
1.4摇瓶复筛
将初筛挑出的酶活高的菌株，在高氏一号平板上于30℃培养5-7天，培养完成后，刮取1平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm/min条件下培养24h；按10v/v％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200rpm/min条件下发酵，发酵30h后收集发酵液进行酶活检测，筛选到一株突变菌，测得的TGase酶活相比出发菌TDSX001高出约60％，如图1所示，将该突变菌株命名为TDSX002。
实施例2：突变株TDSX02的中TG酶基因启动子突变的验证
2.1将获得的诱变菌株TDSX02及出发菌株TDSX001在高氏一号平板上于30℃培养5-7天，培养完成后，刮取1平板孢子接种至种子液培养基中(不含蔗糖)，培养24h后收集菌丝体。送苏州金唯智生物科技有限公司对两个菌株进行基因重测序，SNP结果显示两个菌株的基因组中谷氨酰胺转氨酶基因序列并没有发生突变，但其上游的启动子稍有不同，发生了点突变，核苷酸序列由SEQ ID NO:2突变为SEQ ID NO:1，即第271位(即谷氨酰胺转氨酶基因ATG上游427位)的碱基G突变成了A。
2.2以茂源链霉菌TDSX02和TDSX01基因组DNA作为模板，使用引物TGp-F/R，通过PCR扩增得到TG的启动子，将获得的PCR片段进行测序，结果显示在TG酶基因上游启动子的-10区碱基确实由G变为A，如图2所示。
PCR引物序列为：
PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol,DMSO 2μL，PrimerSTAR Max DNAPolymerase 25μL,加纯水补齐至50μL；
PCR条件：95℃10min；95℃30s；60℃30s；72℃15s，循环30次；72℃10min。
这一结果表明，突变菌TDSX002发酵液酶活力提高的原因并不是TG酶发生突变引起的，而是菌株的TGase酶产量水平相比出发菌TDSX001高出约60％，并且可能与该启动子突变密切相关。
实施例3：验证启动子突变体的功效
3.1工程菌构建
以原始菌株DSM40587为基础，委托中国科学院上海生命科学研究院杨晟课题组将基因组中谷氨酰胺转氨酶基因上游的启动子SEQ ID NO:2第271位碱基G进行G→A突变，通过CRISPR-Cas9系统构建得到工程菌TDSX003，其启动子已突变为SEQ ID NO:1。通过谷氨酰胺转氨酶基因的转录水平考察启动子突变体SEQ ID NO:1的功效。
3.2总RNA的提取
将原始菌株DSM40587和工程菌TDSX003分别在高氏一号平板上于30℃培养5-7天，培养完成后，刮取1平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm/min条件下培养24h；按10v/v％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200rpm/min条件下发酵，发酵28h后，分别取两个菌株的发酵液各500μL，4℃，12000rpm离心5min，收集菌丝体，弃去上清，用无菌水洗涤菌丝体至无发酵液残留。加入1mL Redzol溶液和适量直径为1μm的玻璃珠，用细胞破碎仪(24，Bertin Technologies)破碎菌丝体，条件为70Hz，30s，2个循环，间隙20s。加入200μL pH 8.0的酚氯仿振荡混匀，4℃、13300rpm离心10min。取上清至新EP管(提取RNA过程中使用的EP管和枪头等均为专用RNA-free产品，不可使用普通灭菌产品)，加200μL三氯甲烷振荡混匀，4℃、13300rpm离心10min，如果中间界面蛋白较多，可重复这此步骤。将上清液转移至新的EP管中，加入200μL无水乙醇，混匀后加入到离心柱中，套入收集管。室温静置2min后，6000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。加入600μL Washing buffer洗2次，倒掉收集管中的废液，6000rpm离心2min。将离心柱套入新的EP管，在离心柱中心加50μL DEPC处理的水，12000rpm离心1min。将离心得到的RNA溶液加入离心柱中心，12000rpm离心1min以提高RNA得率。取1μL RNA溶液用Nanodrop(Thermo)检测RNA溶液的浓度，记录A260/A280值，该值介于1.8-2.0之间则认为RNA质量合格，可于-80℃保存并进行后续实验。
3.3去除RNA样品中的DNA及反转录
由于总RNA的提取可能会有基因组DNA的污染，因此要去除RNA中的基因组DNA。DNA消化体系如下：
基因组DNA消化体系
将上述50μL体系置于37℃水浴4h。反应结束后马上放到冰上，每个体系加入5μL50mM EDTA置于65℃水浴10min来失活DNase I，终止消化，保护RNA。水浴完成后马上放到冰上。
取1μL消化后RNA溶液用常规PCR的方式检验DNA是否消化完全。同时取1μL消化后RNA溶液用Nanodrop(Thermo)检测RNA溶液的浓度，记录A260/A280值，该值介于1.8-2.0之间则认为RNA质量合格，可于-80℃保存并进行后续实验。
链霉菌RNA的反转录PCR体系如下：
反转录PCR反应体系
12.5μL体系混匀后置于65℃水浴5min，反应结束马上放到冰上加入7.5μL下述体系混匀
将上述20μL体系放入PCR仪中，PCR程序为：25℃5min，42℃60min，72℃5min。
反转录之后得到的cDNA可以于-80℃长期保存。
3.4荧光定量PCR
荧光定量PCR使用ABI的7500Fast荧光定量PCR仪，Fermentas的MaximaTM TB Green试剂盒。反转录所得20μL体系加入80μL水稀释得到DNA模板。荧光定量PCR体系如下：
Real-time PCR反应体系
将上述20μL体系加入96孔板内放入荧光定量PCR仪，PCR程序为：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃30sec
Stage 2：PCR反应
Reps：40
95℃5sec
60℃30sec
Stage3:Melting curve ramping from 65℃to 95℃(increment 0.5℃/5s)
荧光定量PCR所使用的引物如下：
选择hrdB作为内参基因，其它相关基因的转录水平采用2-△△Ct的方法计算。荧光定量PCR结果如图3所示，在发酵28h时，茂源链霉菌工程菌TDSX003的TG酶基因的转录水平相比于原始菌株DSM40587提高了312％，证明启动子突变体SEQ ID NO:1能显著提高茂源链霉菌中TG酶基因的转录水平。
3.5考察启动子SEQ ID NO:2第271位碱基G的其他突变效果
按照步骤3.1的方法，以原始菌株DSM40587为基础，委托中国科学院上海生命科学研究院杨晟课题组通过CRISPR-Cas9系统将基因组中谷氨酰胺转氨酶基因上游的启动子SEQ ID NO:2第271位碱基G分别进行G→C突变、G→T突变和G→AA突变，分别获得了工程菌TDSX003-2(即G→C)、TDSX003-3(即G→T)和TDSX003-4(即G→AA)。
按照步骤3.2至3.4的方法，考察这三种突变导致的TG酶基因的转录水平。实验发现工程菌TDSX003-2、TDSX003-3和TDSX003-4的TG酶基因的转录水平相比于原始菌株DSM40587分别为95％、90％和110％，表明这三个工程菌表达谷氨酰胺转氨酶的能力并没有提高，提示初始启动子SEQ ID NO:2第271位碱基的G→A突变属于正向突变，启动子突变体SEQ ID NO:1能够显著提高谷氨酰胺转氨酶基因的转录，最终明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。
虽然上述实施例仅以茂源链霉菌DSM40587及其诱变衍生菌株TDSX01为例对于启动子突变体SEQ ID NO:1的功能进行了验证，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，比如应用于其他茂源链霉菌例如DSM40587衍生菌株的改良，由此所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。
序列表
<110> 泰兴市东圣生物科技有限公司
江苏东汇生物科技有限公司
上海东之汇生物科技有限公司
<120> 一种提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子
<130> SHPI2110289
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 697
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraense DSM40587
<400> 1
ggcggcgccg cctcgggtac cggcgcgggg cgggaagcgg gagttcctcc gcgaagtcga 60
agtcctccaa ggcgagtcca agcgccttcc cttgcccgag gccagcgccg accctgctgc 120
gtcgatgacg gacgcaggcg caccgagtcc cgcggtctcg ctcgcccgga ggggatgcgg 180
cggtgtccgg cgcccagccg gattccgctc ctgtgacgga gtggccggtt ttggagccgt 240
ggtgttgccg gggagttaac tgggagacat aatcacttct cgtagcgacc cgatcactcg 300
tccgggagtc gagaagtgtt acgccgaacc ccattccgca ccatcacccc tgccgccgtg 360
accgcggccg gcagtctgcc tctcgccgag agagccaccc ggagaaccgc ccggacgggg 420
tccgcttcac cgctccggtg acggcttcga cgtaacacga ccgcgccgtc accggccgta 480
tccggtacgc accgcatccc cattccgccg tgcggccgcg gcctcttcct caccgccgtt 540
accggcgcgg caccgcagga cgggcaccgc ccgacgttat gcgcggccac tcgccgcaac 600
ctccaccccc cgcgtcgcac tctggcatgc cctcgttccg cgaggttcgc cagattcagc 660
cctttcgtca cgttcgccaa aggagttgtt gttcttc 697
<210> 2
<211> 697
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraense
<400> 2
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agtcctccaa ggcgagtcca agcgccttcc cttgcccgag gccagcgccg accctgctgc 120
gtcgatgacg gacgcaggcg caccgagtcc cgcggtctcg ctcgcccgga ggggatgcgg 180
cggtgtccgg cgcccagccg gattccgctc ctgtgacgga gtggccggtt ttggagccgt 240
ggtgttgccg gggagttaac tgggagacat gatcacttct cgtagcgacc cgatcactcg 300
tccgggagtc gagaagtgtt acgccgaacc ccattccgca ccatcacccc tgccgccgtg 360
accgcggccg gcagtctgcc tctcgccgag agagccaccc ggagaaccgc ccggacgggg 420
tccgcttcac cgctccggtg acggcttcga cgtaacacga ccgcgccgtc accggccgta 480
tccggtacgc accgcatccc cattccgccg tgcggccgcg gcctcttcct caccgccgtt 540
accggcgcgg caccgcagga cgggcaccgc ccgacgttat gcgcggccac tcgccgcaac 600
ctccaccccc cgcgtcgcac tctggcatgc cctcgttccg cgaggttcgc cagattcagc 660
cctttcgtca cgttcgccaa aggagttgtt gttcttc 697
Claims (10)
1.一种提高谷氨酰胺转氨酶表达水平的启动子，其特征在于，核苷酸序列为SEQ IDNO:1，所述谷氨酰胺转氨酶由茂源链霉菌DSM 40587及其衍生菌株表达。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述衍生菌株选自泰兴市东圣生物科技有限公司持有的茂原链霉菌TDSX01、CCTCC NO:M 2020194、CCTCC NO:M2020195、CCTCC NO:M2020196、CCTCC NO:M 2020197、CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。
3.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述衍生菌株是泰兴市东圣生物科技有限公司持有的茂原链霉菌TDSX01。
4.一种谷氨酰胺转氨酶基因表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的启动子和位于其下游的谷氨酰胺转氨酶基因。
5.包含如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒的质粒，其特征在于，适合于在茂源链霉菌中表达。
6.一种茂源链霉菌工程菌，其特征在于，其基因组中包含如权利要求1所述的启动子或者如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒。
7.一种构建如权利要求6所述茂源链霉菌工程菌的方法，包括如下步骤：
通过基因编辑技术，将茂源链霉菌基因组中位于谷氨酰胺转氨酶基因上游的启动子的-10区碱基即谷氨酰胺转氨酶基因ATG上游427位碱基由G变为A，筛选阳性克隆株；或者
通过基因编辑技术，将如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒整合入茂源链霉菌的基因组中，筛选阳性克隆株；或者
将如权利要求5所述的质粒转化入茂源链霉菌中，筛选阳性克隆株。
8.如权利要求6所述的茂源链霉菌工程菌在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过茂源链霉菌工程菌的发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：15～25g/L甘油，4～7g/L酵母粉，20～40g/L蛋白胨，2g～4/L MgSO4·7H2O，1～3g/LK2HPO4·3H2O，NaOH调至pH7.0～7.4。
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