CN111593011A - 一种转谷氨酰胺酶生产菌 - Google Patents

Abstract

本发明通过诱变得到了一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。本发明的转谷氨酰胺酶生产菌比原始菌株的转谷氨酰胺酶产酶量提高了4倍多，酶活达到7.5U/mL以上，能够工业化应用。

Description

一种转谷氨酰胺酶生产菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种转谷氨酰胺酶生产菌。

背景技术

转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13，Transglutaminase，TGase)又称谷氨酰胺酶转氨酶(Glutamine transaminase)，简称TG酶，是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，在自然界中广泛存在于人体、高级动物、鱼类、植物和微生物中，例如大量存在于哺乳动物的各种组织器官(如肝脏、毛囊、表皮、前列腺、血液)。它是一种酰基转移酶，可通过催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应(参见图1)，使蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联。作为一种通过转谷氨酰胺作用形成共价化合物的聚合酶，借助于两个蛋白质(包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等)之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等的功能特性。TG酶被称为“21世纪的超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、化妆品等领域应用前景广阔。

在食品领域，该酶能通过引入赖氨酸而提高蛋白质的营养效价，而被其处理过的食品具有良好的外观和质构，可延长货架期，减少食品中的过敏源。此外，该酶可分解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨，而谷氨酸在食品美味上起着重要作用，因此通过添加该酶可增强食品的风味。

传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸，以提高其持水力、连贯性和质地。近些年来，少盐少磷酸的食物被广泛推广，但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂--磷酸盐，生产低盐肉制品。可应用于水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的量，即可达到明显的效果。

转谷氨酰胺酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense或Streptomyces mobaraensis)，是我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产转谷氨酰胺酶的安全菌株。

但目前使用的茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶生产能力偏低，导致发酵液中的酶含量偏低，因此亟需提高菌株的产酶能力。

发明内容

为了现有转谷氨酰胺酶生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明结合化学诱变、物理诱变和杂交育种来筛选茂原链霉菌突变菌株，获得了高产转谷氨酰胺转氨酶的生产菌株。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种转谷氨酰胺酶生产菌。

本发明的第二个目的在于提供上述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶的应用。

为了达到上述目的，本发明对于上海东之汇生物科技有限公司所保藏的茂原链霉菌DSM40587设计了如下诱变筛选方案：

1)活化原始菌株茂原链霉菌DSM40587；

2)对菌株进行化学诱变比如亚硝基胍(NTG)诱变育种、或者物理诱变比如紫外线(UV)诱变育种、或者化学法与物理法相结合的诱变育种，筛选出转谷氨酰胺酶表达水平明显提高的突变菌株。

上述步骤1)中使用的平板培养基(高氏一号)组成如下：20g/L可溶性淀粉，1g/LKNO₃，0.5g/L NaCl，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.5g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，琼脂粉2％。

通过数百次的诱变实验，终于筛选出转谷氨酰胺酶产量提高了4倍多的两个突变菌株，分别命名为DSHO0618和NTG-1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020148(即DSHO0618)和CCTCC NO:M 2020147(即NTG-1)。

根据本发明的第二个方面，提供了上述转谷氨酰胺酶生产菌CCTCC NO:M2020147和CCTCC NO:M 2020148在转谷氨酰胺酶的生产中的应用。

在一种实施方式中，通过上述转谷氨酰胺酶生产菌的发酵来生产转谷氨酰胺酶。

其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于茂原链霉菌生长发酵的培养基。

根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O,2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

在一种优选的实施方式中，当用于工业化发酵生产时，上述转谷氨酰胺酶生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同，例如可以都是上述培养基组成。

优选地，上述发酵温度为30±3℃比如30±2℃或30±1℃。

本发明所构建的转谷氨酰胺酶生产菌通过发酵能够实现发酵液中转谷氨酰胺酶的有效积累，比原始菌株DSM40587的产酶量提高了至少4倍，完全可以投入工业化应用。

本发明诱变筛选出的转谷氨酰胺酶生产菌的拉丁学名是Streptomycesmobaraensis，中文名称是茂原链霉菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2020年5月26日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020147和CCTCC NO:M2020148。

附图说明

图1为转谷氨酰胺酶的作用原理示意图。

图2为转谷氨酰胺酶的酶活测定反应原理图。

图3为诱变菌株DSHO0618和NTG-1的平板培养状态照片。其中左图为DSHO0618，右图为NTG-1，分别培养了72h。

具体实施方式

提高转谷氨酰胺酶生产菌的产酶量是本领域科技人员的多年追求。提高微生物表达蛋白质能力的一种重要手段是基因工程，即在细菌或者酵母中导入外源的转谷氨酰胺酶基因，通过转化子发酵来表达转谷氨酰胺酶。但是基因工程菌产品的食用安全性难以保障，需要长时期的系统考察才能确定；而且基因工程菌一般经数次传代后，遗传稳定性趋于下降。为了保障发酵产品转谷氨酰胺酶的食品级安全性，以及保持发酵菌株的遗传稳定性，发明人选择了传统的诱变育种手段对已获得食品安全认证的现有转谷氨酰胺酶菌种DSM40587进行突变和筛选。

作为原始菌株或者出发菌株，本发明诱变所用的茂原链霉菌DSM40587在文献(张莉丽，等。发酵条件对茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶产量的影响。中国乳品工业，2014(07)，pp16-19)中已报道过，上海东之汇生物科技有限公司保藏有该菌株，任何单位和个人都可以获得该菌株用于验证本发明，但未经上海东之汇生物科技有限公司允许不得用作其他用途，包括科学研究和教学。

众所周知，诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子、常压室温等离子体(ARTP)等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)、生物诱变因子(如噬菌体)以及复合诱变四大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。发明人采用紫外线诱变形式对出发菌DSM40587进行诱变处理，得到了转谷氨酰胺酶产量明显提高的变异菌株，命名为DSHO0618，进一步采用亚硝基胍(NTG)诱变形式对DSHO0618进行诱变处理，得到了转谷氨酰胺酶产量进一步提高的另一株变异菌株，命名为NTG-1。

在本文中，对于本发明，术语“转谷氨酰胺酶”、“谷氨酰胺酶转氨酶”、“TG酶”和“TGase”表示相同的意义，可以互换使用。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

亚硝基胍、培养基主要成分均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。

平板培养基(高氏一号)：20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO₃，0.5g/L NaCl，0.5g/LMgSO₄·7H₂O，0.5g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，琼脂粉2％。

摇瓶发酵培养基：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O,2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

pH6.0磷酸缓冲液：K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 8g/L，0.1MPa灭菌20min。

通过测定菌株发酵液的酶活力高低，评价茂原链霉菌生产转谷氨酰胺酶的能力，这是本领域技术人员容易理解的。

实施例1：紫外线诱变和筛选

1.1制备孢子悬液：在茂原链霉菌DSM40587培养平板(培养皿)中加入5ml无菌水，无菌牙签轻刮取菌体，用1ml移液器吹打混匀5次后放入100ml无菌锥形瓶中(装有2g的玻璃珠)，封瓶膜封口，放入恒温摇床200r/5min振荡打散菌体，用1ml移液器吸取菌液用无菌的带有0.45μm滤纸的漏斗过滤到新的无菌锥形瓶中，吸取滤液放入无菌2ml EP管(2管)，3000g/min 10min离心，移液器吸取上清弃去。

1.2诱变(以下操作均需避光)：每管加1ml无菌水，用1ml移液器吹打混匀5次后，用1ml移液器吸取1ml的菌液放入无菌90mm培养板中，打开紫外诱变仪(北京赛百奥科技CB10-UV8A)254nm预热15min，将装有菌液的无菌90mm培养板放入紫外诱变仪中，打开盖子，分别计时45s、60s、90s、120s、180s后盖上盖子，在超净台中10倍稀释涂布(100μl的菌液加900μl的水)。对照稀释10^-5和10^-6涂布，诱变后稀释10^-5和10^-4涂布。将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天，培养四天时取出平板计数，选取100以内的菌落数为准计数。

1.3致死率计算：致死率(％)＝[(A-B)/A]*100％

A：未经紫外处理的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

B：紫外处理后的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

致死率统计结果见表1。

表1、紫外诱变致死率统计

照射时间	45s	60s	90s	120s	180s
						致死率	90％	95％	>99％	>99％	>99％

1.4筛选：选择致死率在95％即紫外照射60s的平板，挑取板上单菌落，用无菌96孔板发酵，用酶标仪在OD525nm处读数，将挑取的OD值高的菌株找到对应的对照板的孔，全部吸取到高氏一号平板上涂布，将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天。

挑取板上单菌落，摇瓶发酵，筛选OD值高(即生长速度快)的菌株，检测发酵液酶活力。发酵液酶活力测定方法参见实施例2。

实施例2：产转谷氨酰胺酶菌株发酵及产量测定

2.1菌株摇瓶发酵

种子培养：将发酵培养基配制混匀后分装50ml/瓶至250ml摇瓶中，用接种环刮取实施例1.4中得到的培养平板上四分之一平板孢子接种于摇瓶中，于30℃，220rpm培养24h，得种子培养液。

摇瓶发酵：发酵培养基配制混匀分装30ml/瓶至250ml摇瓶中，接种3ml种子培养液至发酵摇瓶中，30℃，220rpm培养约28h。发酵液高速离心，取上清，检测酶活。

2.2转谷氨酰胺酶的酶活测定

2.2.1原理

转谷氨酰胺酶的酶活测定原理如图2所示。通过将伯胺羟基引入到合成基质CBZ-Gln-Gly，然后测量生成的氧肟酸量。氧肟酸的量可通过测定它与FeCl₃-TCA形成的红色络合物在OD525nm处的吸光度而测得。

2.2.2试剂配制

6M盐酸：用50mL量筒量取盐酸50mL，倒入100mL广口瓶。加水50mL，左右轻微摇晃5次，混匀。

3M盐酸：用50mL量筒量取盐酸25mL，倒入100mL广口瓶。加水50mL，左右轻微摇晃5次，混均。

12％三氯乙酸：称取240g三氯乙酸于2L烧杯中，加水溶解，定容至2000mL。

3％三氯化铁：称取60g无水FeCl₃于2L烧杯中，加0.1M的盐酸溶解，定容至2000mL。

A试剂：称取12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5.06g底物(Na-CBZ-Gln-Gly)、3.475g盐酸羟胺、1.536g还原型谷胱甘肽于500mL烧杯中，加入450mL水，用磁力搅拌器低速搅拌2min混合均匀。用6M盐酸调节pH为6.0，将混合液体转移至500mL容量瓶，加水定容至500mL。置于棕色广口瓶，贴标签，于-4℃冰箱贮存，4天内用完。

B试剂：将3M盐酸、12％三氯乙酸、3％三氯化铁3种溶液混合，滤纸过滤，置于棕色试剂瓶中，贴标签，常温避光贮存。

2.2.3标准曲线的作法

称取64.8mg的标准品(39.98μmol/mL)L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸(MW＝162.1)加10mL水。用水通过2倍稀释法依次稀释5个梯度。取出适量A试剂装入100mL蓝口瓶，放入37℃水浴预热10min。分别用移液管吸取150μL各标准液于试管中，37℃保温1min。每管加入1.5mL A试剂进行反应，从加入的第一支试管开始计时，每隔5s加下一支，保证每支试管反应时间一致。10min后，加入1.5mL B试剂终止反应。在OD525nm下测定反应液的吸光度。以吸光度比氧肟酸的量做直线，有直线的斜率得到了一个转换系数K，在样品酶活测定中得到吸光度后就可以通过K计算出氧肟酸的生成量。

2.2.4液体酶液检测

移液管吸取1mL上下颠倒或左右摇晃3次的待测样品至2mL Ep管中。对称放入冷冻离心机中，4℃，7000rpm离心10min。根据待测样品大致酶活选择稀释倍数，原则上保证测得吸光值在0.2-0.8之间，使数值准确。以稀释50倍为例，取2mL Ep管，移液器吸取上清液100μL，加入900μL水，上下震荡3次混均。吸取混均后的溶液200μL,加入800μL水，上下震荡3次混均。此时为待测样品。取出适量A液装入100ml蓝口瓶，放入37℃水浴预热10min。实验组试管加入150μL待测样品，做2-3个平行，空白组试管加入150μL水，预热1min。每管加入1.5mL A试剂进行反应，从加入的第一支试管开始计时，每隔5s加下一支，保证每支试管反应时间一致。10min后，加入1.5mL B试剂终止反应。以空白组反应液为空白，将反应液倒入0.5cm石英比色皿中，于波长525nm处记录吸光值。

2.3菌株发酵液的转谷氨酰胺酶酶活：

根据步骤2.1中的发酵方案和步骤2.2中的测定方法，筛选突变菌株。经过300多轮筛选，得到了一些生长速度快、且发酵液中转谷氨酰胺酶酶活力提高的菌株，其中一株转谷氨酰胺酶产量是原始菌株5倍的突变菌株，命名为DSHO0618。菌株DSHO0618的平板培养状态如图3所示。

比较出发菌DSM40587和DSHO0618的产酶量即发酵液酶活，每个菌株做3个平行实验，结果如表3所示。

实施例3：突变菌株DSHO0618的亚硝基胍诱变

为了尽可能得到转谷氨酰胺酶产量进一步提高的菌株，我们继续对DSHO0618进行化学诱变，选用亚硝基胍(NTG)作为诱变剂。NTG是一种非常强的化学诱变剂，其诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。

由于亚硝基胍为一种强烈的致癌性诱变物质，为防止对人体造成伤害，操作时要戴橡皮手套，穿工作服，戴口罩，诱变完成后，凡接触过亚硝基胍的器皿必须及时处理，将所用耗材放入1M的氢氧化钠溶液(8g氢氧化钠溶于200mL蒸溜水)中浸泡过夜，并用0.5％硫代硫酸钠(7.9g硫代硫酸钠溶于100mL蒸溜水)擦拭安全柜。

3.1菌种DSHO0618活化和孢子悬液制备：从菌种DSHO0618甘油管划线至高氏一号平板，30℃培养7天左右。

在培养平板中加入10ml磷酸缓冲液(pH6.0)，无菌牙签轻刮取菌体，用1ml移液器吹打混匀5次后放入100ml无菌锥形瓶中(装有2g的玻璃珠)，封瓶膜封口，放入恒温摇床200r/5min振荡打散菌体，用1ml移液器吸取菌液，用无菌的带有0.45μm滤纸的漏斗过滤到新的无菌锥形瓶中，得到孢子悬液。

3.2亚硝基胍诱变：

分别称取10-20mg亚硝基胍，溶于孢子悬液中(必要时可加入少许丙酮助溶)，得到分别为1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml共3个浓度的亚硝基胍处理液。于28℃，250r/min震荡，分别诱变60min、90min、120min，然后用无菌水终止诱变。诱变后稀释10^-5和10^-4涂布。将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天，培养四天时取出平板计数，选取100以内的菌落数为准计数。亚硝基胍对菌株致死率的影响见表2。

表2、亚硝基胍诱变致死率统计

3.3筛选：选择致死率在90％即1.5mg/ml亚硝基胍处理120min的平板，挑取板上单菌落，用无菌96孔板发酵，用酶标仪在OD525nm处读数，将挑取的OD值高的菌株找到对应的对照板的孔，全部吸取到高氏一号平板上涂布，将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天。

挑取板上单菌落，摇瓶发酵，筛选OD值高(即生长速度快)的菌株，检测发酵液酶活力。发酵液酶活力测定方法参见实施例2。

经过5轮筛选，得到了一些生长速度快、且发酵液中转谷氨酰胺酶酶活力进一步提高的菌株，其中一株转谷氨酰胺酶产量比DSHO0618提高了大约10％，命名为NTG-1。菌株NTG-1的平板培养状态如图3所示。其摇瓶发酵液酶活力测定结果如表3所示。

表3、菌株发酵液的转谷氨酰胺酶酶活水平比较

由表3可见，诱变菌株DSHO0618和NTG-1的产酶能力比原始菌DSM40587提高了4倍多，在发酵液中能够实现转谷氨酰胺酶的有效积累，足以满足实施工业化应用的要求。

Claims (5)

1.一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。

2.如权利要求1所述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述转谷氨酰胺酶生产菌的发酵来生产转谷氨酰胺酶。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O,2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵温度为30±2℃。

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