CN111690570B - 一种谷氨酰胺转氨酶生产菌 - Google Patents

Abstract

本发明通过诱变筛选得到了一株谷氨酰胺转氨酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020194、CCTCC NO:M 2020195、CCTCC NO:M 2020196或者CCTCC NO:M 2020197。本发明的谷氨酰胺转氨酶生产菌比原始菌株的谷氨酰胺转氨酶产量提高了至少3.5倍，发酵液酶活达到33U/mL以上，工业化应用前景广阔。

Description

一种谷氨酰胺转氨酶生产菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种谷氨酰胺转氨酶生产菌。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13，Glutamine transaminase)又称转谷氨酰胺酶(Transglutaminase)，简称TGase或TG酶，是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，在自然界中广泛存在于人体、高级动物、鱼类、植物和微生物中，例如大量存在于哺乳动物的各种组织器官(如肝脏、毛囊、表皮、前列腺、血液)。TG酶是一种酰基转移酶，可通过催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应，使蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联。作为一种通过转谷氨酰胺作用形成共价化合物的聚合酶，其借助于两个蛋白质(包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等)之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等的功能特性。因此TG酶被称为“21世纪的超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、皮革、化妆品等领域具有广泛的用途。

以食品领域中的应用为例，TG酶能通过引入赖氨酸而提高蛋白质的营养效价，而被其处理过的食品具有良好的外观和质构，可延长货架期，减少食品中的过敏源。此外，该酶可分解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨，而谷氨酸在食品美味上起着重要作用，因此通过添加该酶可增强食品的风味。传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸，以提高其持水力、连贯性和质地。近些年来，少盐少磷酸的食物被广泛推广，但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂--磷酸盐，生产低盐肉制品。可应用于水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的量，即可达到明显的效果。

谷氨酰胺转氨酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis或者Streptomyces mobaraense)，是我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产谷氨酰胺转氨酶的安全菌株。

目前谷氨酰胺转氨酶生产厂家使用的发酵菌株的产酶能力普遍偏低，如何提高菌株的产酶能力始终是本领域科技人员的追求。

发明内容

为了现有谷氨酰胺转氨酶生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明结合化学诱变、物理诱变和杂交育种来筛选茂原链霉菌突变菌株，获得了高产谷氨酰胺转氨酶的生产菌株。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种谷氨酰胺转氨酶生产菌。

本发明的第二个目的在于提供上述谷氨酰胺转氨酶生产菌用于生产谷氨酰胺转氨酶的应用。

为了达到上述目的，本发明对于上海东之汇生物科技有限公司在专利文献CN202010645600.9中报道的茂原链霉菌DSHO0618设计了如下诱变筛选方案：

1)活化原始菌株茂原链霉菌DSHO0618；

2)对菌株进行化学诱变比如亚硝基胍(NTG)诱变育种、或者物理诱变比如紫外线(UV)诱变育种、或者化学法与物理法相结合的诱变育种，筛选出谷氨酰胺转氨酶表达水平明显提高的突变菌株。

上述步骤1)中使用的平板培养基(高氏一号)组成如下：20g/L可溶性淀粉，1g/LKNO₃，0.5g/L NaCl，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.5g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，琼脂粉2％。

通过数百次的诱变实验，终于筛选出谷氨酰胺转氨酶产量比原始菌株提高了3.5倍多的四个突变菌株，分别命名为C2、587、IPIE和IPIO，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020194(即C2)、CCTCC NO:M2020195(即587)、CCTCC NO:M2020196(即IPIO)和CCTCC NO:M 2020197(即IPIE)。

根据本发明的第二个方面，提供了上述谷氨酰胺转氨酶生产菌C2、587、IPIE和IPIO在谷氨酰胺转氨酶的生产中的应用。

在一种实施方式中，通过上述谷氨酰胺转氨酶生产菌的发酵来生产谷氨酰胺转氨酶。

其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于茂原链霉菌生长发酵的培养基。

根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O,2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

在一种优选的实施方式中，当用于工业化发酵生产时，上述谷氨酰胺转氨酶生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同，例如可以都是上述培养基组成。

优选地，上述发酵温度为30±3℃比如30±2℃或30±1℃。

本发明所构建的谷氨酰胺转氨酶生产菌通过发酵能够实现发酵液中谷氨酰胺转氨酶的有效积累，比原始菌株DSHO0618的产酶量提高了至少3.5倍，发酵液的酶活达到33U/mL以上，完全可以投入工业化应用。

本发明诱变筛选出的谷氨酰胺转氨酶生产菌的拉丁学名是Streptomycesmobaraensis，中文名称是茂原链霉菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2020年06月10日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020194、CCTCC NO:M2020195、CCTCC NO:M2020196和CCTCC NO:M 2020197。

附图说明

图1为谷氨酰胺转氨酶的酶活测定反应原理图。

图2为诱变菌株C2、587、IPIO和IPIE的平板培养状态照片。其中左上图为C2，右上图为587，左下图为IPIO，右下图为IPIE，分别培养了72h。

具体实施方式

提高谷氨酰胺转氨酶生产菌的产酶能力是本领域科技人员的多年追求。一种提高微生物表达蛋白质能力的重要手段是基因工程技术，即在细菌或者酵母中导入外源的谷氨酰胺转氨酶基因，通过转化子发酵来表达谷氨酰胺转氨酶。但是基因工程菌发酵产品的食用安全性难以保障，需要长时期的系统考察才能确定；而且基因工程菌一般经数次传代后，遗传稳定性趋于下降。为了保障发酵产品谷氨酰胺转氨酶的食品级安全性，以及保持发酵菌株的遗传稳定性，发明人选择了传统的诱变育种手段对上海东之汇生物科技有限公司在中国专利文献CN202010645600.9中报道的谷氨酰胺转氨酶菌种DSHO0618进行突变和筛选。

众所周知，诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子、常压室温等离子体(ARTP)等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)、生物诱变因子(如噬菌体)以及复合诱变四大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。物理诱变主要是利用各种射线在一定剂量水平上对生物活体材料进行照射，造成生物细胞内染色体的畸变，其特点是对染色体伤害较大，这是早期诱变的主流形式。化学诱变是通过一定浓度范围的化学诱变剂对活体进行处理造成生物细胞内DNA的损伤和错误修复等，产生突变体，具备易操作，剂量易控制，对基因组损伤小，突变率高。由于物理和化学的诱变方法所产生的突变是随机的尽管基因突变频率较高，但突变无方向性，并不能确保增加正向突变的频率。与定向驯化和诱导不同，诱变育种的特点是结果不可预测，而且往往是负向突变，能否得到正向突变的理想结果，基本靠运气。

实施例中进行化学诱变时，选用亚硝基胍(NTG)作为诱变剂。NTG是一种非常强的化学诱变剂，其诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。

发明人采用亚硝基胍(NTG)诱变方式对出发菌DSHO0618进行诱变处理，得到了谷氨酰胺转氨酶产量明显提高的变异菌株，命名为C2；对C2进行紫外线诱变处理，得到了谷氨酰胺转氨酶产量进一步提高的变异菌株，命名为587；对587进行紫外线诱变处理，得到了谷氨酰胺转氨酶产量进一步提高的变异菌株，命名为IPIO；对587进行亚硝基胍(NTG)诱变处理，得到了谷氨酰胺转氨酶产量进一步提高的变异菌株，命名为IPIE。

在本文中，对于本发明，术语“谷氨酰胺转氨酶”、“转谷氨酰胺酶”和“TG酶”表示相同的意义，可以互换使用。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

茂原链霉菌DSHO0618，购自上海东之汇生物科技有限公司，参见专利文献CN202010645600.9。

亚硝基胍、培养基主要成分均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。

平板培养基(高氏一号)：20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO₃，0.5g/L NaCl，0.5g/LMgSO₄·7H₂O，0.5g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，琼脂粉2％。

摇瓶发酵培养基：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O，2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

pH6.0磷酸缓冲液：K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 8g/L，0.1MPa灭菌20min。

通过测定菌株发酵液的酶活力高低，评价茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶的能力，这是本领域技术人员容易理解的。

实施例1：菌种DSHO0618亚硝基胍诱变和筛选

亚硝基胍(NTG)是一种强烈的致癌性诱变物质，为防止对人体造成伤害，操作时要戴橡皮手套，穿工作服，戴口罩，诱变完成后，凡接触过亚硝基胍的器皿必须及时处理，将所用耗材放入1M的氢氧化钠溶液(8g氢氧化钠溶于200mL蒸溜水)中浸泡过夜，并用0.5％硫代硫酸钠(7.9g硫代硫酸钠溶于100mL蒸溜水)擦拭安全柜。

1.1菌种DSHO0618活化和孢子悬液制备：从菌种DSHO0618甘油管划线至高氏一号平板，30℃培养7天左右。

在培养平板(培养皿)中加入10ml磷酸缓冲液(pH6.0)，无菌牙签轻刮取菌体，用1ml移液器吹打混匀5次后放入100ml无菌锥形瓶中(装有2g的玻璃珠)，封瓶膜封口，放入恒温摇床200r/5min振荡打散菌体，用1ml移液器吸取菌液，用无菌的带有0.45μm滤纸的漏斗过滤到新的无菌锥形瓶中，得到孢子悬液。

1.2亚硝基胍诱变：

分别称取10-20mg亚硝基胍，溶于孢子悬液中(必要时可加入少许丙酮或者甲酰胺助溶)，得到分别为1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml共3个浓度的亚硝基胍处理液。于28℃，250r/min震荡，分别诱变60min、90min、120min，然后用无菌水终止诱变。诱变后稀释10^-5和10^-4涂布。将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天，培养4天时取出平板计数，选取100以内的菌落数为准计数。

1.3致死率计算：致死率(％)＝[(A-B)/A]*100％

A：未经亚硝基胍处理的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

B：亚硝基胍处理后的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

亚硝基胍对菌株致死率统计结果见表1。

表1、亚硝基胍诱变致死率统计

1.4筛选：选择致死率在91％以上即1.5mg/ml亚硝基胍处理120min的平板，挑取板上单菌落，用无菌96孔板发酵，用酶标仪在OD525nm处读数，将挑取的OD值高的菌株找到对应的对照板的孔，全部吸取到高氏一号平板上涂布，将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天。

挑取板上单菌落，摇瓶发酵，筛选OD值高(即生长速度快)的菌株，检测发酵液酶活力。发酵液酶活力测定方法参见实施例2。

实施例2：产谷氨酰胺转氨酶菌株发酵及产量测定

2.1菌株摇瓶发酵

种子培养：将发酵培养基配制混匀后分装50ml/瓶至250ml摇瓶中，用接种环刮取实施例1.4中得到的培养平板上四分之一平板孢子接种于摇瓶中，于30℃，220rpm培养24h，得种子培养液。

摇瓶发酵：发酵培养基配制混匀分装30ml/瓶至250ml摇瓶中，接种3ml种子培养液至发酵摇瓶中，30℃，220rpm培养约28h。发酵液高速离心，取上清，检测酶活。

2.2谷氨酰胺转氨酶的酶活测定

2.2.1原理

谷氨酰胺转氨酶的酶活测定原理如图1所示。通过将伯胺羟基引入到合成基质CBZ-Gln-Gly，然后测量生成的氧肟酸量。氧肟酸的量可通过测定它与FeCl₃-TCA形成的红色络合物在OD525nm处的吸光度而测得。

2.2.2试剂配制

6M盐酸：用50mL量筒量取盐酸50mL，倒入100mL广口瓶。加水50mL，左右轻微摇晃5次，混匀。

3M盐酸：用50mL量筒量取盐酸25mL，倒入100mL广口瓶。加水50mL，左右轻微摇晃5次，混均。

12％三氯乙酸：称取240g三氯乙酸于2L烧杯中，加水溶解，定容至2000mL。

3％三氯化铁：称取60g无水FeCl₃于2L烧杯中，加0.1M的盐酸溶解，定容至2000mL。

A试剂：称取12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5.06g底物(Na-CBZ-Gln-Gly)、3.475g盐酸羟胺、1.536g还原型谷胱甘肽于500mL烧杯中，加入450mL水，用磁力搅拌器低速搅拌2min混合均匀。用6M盐酸调节pH为6.0，将混合液体转移至500mL容量瓶，加水定容至500mL。置于棕色广口瓶，贴标签，于-4℃冰箱贮存，4天内用完。

B试剂：将3M盐酸、12％三氯乙酸、3％三氯化铁3种溶液混合，滤纸过滤，置于棕色试剂瓶中，贴标签，常温避光贮存。

2.2.3标准曲线的作法

称取64.8mg的标准品(39.98μmol/mL)L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸(MW＝162.1)加10mL水。用水通过2倍稀释法依次稀释5个梯度。取出适量A试剂装入100mL蓝口瓶，放入37℃水浴预热10min。分别用移液管吸取150μL各标准液于试管中，37℃保温1min。每管加入1.5mL A试剂进行反应，从加入的第一支试管开始计时，每隔5s加下一支，保证每支试管反应时间一致。10min后，加入1.5mL B试剂终止反应。在OD525nm下测定反应液的吸光度。以吸光度比氧肟酸的量做直线，有直线的斜率得到了一个转换系数K，在样品酶活测定中得到吸光度后就可以通过K计算出氧肟酸的生成量。

2.2.4液体酶液检测

移液管吸取1mL上下颠倒或左右摇晃3次的待测样品至2mL Ep管中。对称放入冷冻离心机中，4℃，7000rpm离心10min。根据待测样品大致酶活选择稀释倍数，原则上保证测得吸光值在0.2-0.8之间，使数值准确。以稀释50倍为例，取2mL Ep管，移液器吸取上清液100μL，加入900μL水，上下震荡3次混均。吸取混均后的溶液200μL,加入800μL水，上下震荡3次混均。此时为待测样品。取出适量A液装入100ml蓝口瓶，放入37℃水浴预热10min。实验组试管加入150μL待测样品，做2-3个平行，空白组试管加入150μL水，预热1min。每管加入1.5mL A试剂进行反应，从加入的第一支试管开始计时，每隔5s加下一支，保证每支试管反应时间一致。10min后，加入1.5mL B试剂终止反应。以空白组反应液为空白，将反应液倒入0.5cm石英比色皿中，于波长525nm处记录吸光值。

2.3菌株发酵液的谷氨酰胺转氨酶酶活：

根据步骤2.1中的发酵方案和步骤2.2中的测定方法，筛选突变菌株。经过55轮筛选，得到了一些生长速度快、且发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活力提高的菌株，其中一株谷氨酰胺转氨酶产量是原始菌株3.5倍的突变菌株，命名为C2。突变菌株C2的平板培养状态如图2所示。

比较出发菌DSHO0618和突变菌株C2的产酶量即发酵液酶活，每个菌株做3个平行实验，结果如表3所示。

实施例3：突变菌株C2的紫外线诱变

3.1制备孢子悬液：在菌株C2培养平板(培养皿)中加入5ml无菌水，无菌牙签轻刮取菌体，用1ml移液器吹打混匀5次后放入100ml无菌锥形瓶中(装有2g的玻璃珠)，封瓶膜封口，放入恒温摇床200r/5min振荡打散菌体，用1ml移液器吸取菌液用无菌的带有0.45μm滤纸的漏斗过滤到新的无菌锥形瓶中，吸取滤液放入无菌2ml EP管(2管)，3000g/min 10min离心，移液器吸取上清弃去。

3.2诱变(以下操作均需避光)：每管加1ml无菌水，用1ml移液器吹打混匀5次后，用1ml移液器吸取1ml的菌液放入无菌90mm培养板中，打开紫外诱变仪(CB10-UV8A，北京赛百奥科技有限公司)254nm预热15min，将装有菌液的无菌90mm培养板放入紫外诱变仪中，打开盖子，分别计时45s、60s、90s、120s、180s后盖上盖子，在超净台中10倍稀释涂布(100μl的菌液加900μl的水)。对照稀释10^-5和10^-6涂布，诱变后稀释10^-5和10^-4涂布。将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天，培养四天时取出平板计数，选取100以内的菌落数为准计数。

3.3致死率计算：致死率(％)＝[(A-B)/A]*100％

A：未经紫外处理的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

B：紫外处理后的孢子在高氏一号培养基上长出的菌落总数

紫外诱变C2致死率统计结果见表2。

表2、紫外诱变C2致死率统计

照射时间	45s	60s	90s	120s	180s
						致死率	85％	92％	>99％	>99％	>99％

3.4筛选：选择致死率在92％即紫外照射60s的平板，挑取板上单菌落，用无菌96孔板发酵，用酶标仪在OD525nm处读数，将挑取的OD值高的菌株找到对应的对照板的孔，全部吸取到高氏一号平板上涂布，将涂布好的平板倒置放入28℃的培养箱培养7天。

挑取板上单菌落，摇瓶发酵，筛选OD值高(即生长速度快)的菌株，检测发酵液酶活力。发酵液酶活力测定方法参见实施例2。

经过60轮筛选，得到了一些生长速度快、且发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活力进一步提高的菌株，其中一株谷氨酰胺转氨酶产量比C2提高了大约40％，命名为587。菌株587的平板培养状态如图2所示。其摇瓶发酵液酶活力测定结果如表3所示。

实施例4：突变菌株587的紫外线诱变

按照实施例3所示的方法，继续对菌株587进行紫外线诱变。

经过10轮诱变筛选，又得到了一株突变菌株，其发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活力比587提高了大约21％，命名为IPIO。菌株IPIO的平板培养状态如图2所示。其摇瓶发酵液酶活力测定结果如表3所示。

实施例5：突变菌株587的亚硝基胍诱变

按照实施例1所示的方法，继续对菌株587进行亚硝基胍诱变。

经过25轮诱变筛选，又得到了一株突变菌株，其发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活力比587提高了大约20％，命名为IPIE。菌株IPIE的平板培养状态如图2所示。其摇瓶发酵液酶活力测定结果如表3所示。

表3、菌株发酵液的谷氨酰胺转氨酶酶活水平比较

由表3可见，诱变菌株C2、587、IPIE和IPIO的产酶能力比原始菌株DSHO0618的产酶量提高了至少3.5倍，发酵液的酶活达到33U/mL以上，在发酵液中能够有效实现谷氨酰胺转氨酶的积累，足以满足实施工业化应用的要求。

Claims (5)

1.一种谷氨酰胺转氨酶生产菌，其为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020195、CCTCC NO:M 2020196或者CCTCC NO:M 2020197。

2.如权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶生产菌用于生产谷氨酰胺转氨酶的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶生产菌的发酵来生产谷氨酰胺转氨酶。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO₄·7H₂O，2g/L K₂HPO₄·3H₂O，NaOH调pH至7.4。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵温度为30±2℃。

Images