CN112501058B - 一种产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物筛选及发酵工程领域，具体涉及一种产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其应用；本发明提供一种黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus)DF‑32，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020494，保藏日期：2020年9月14日；黄灰链霉菌DF‑32经活化后的种子液接入发酵培养基中，再经发酵后即实现黄灰链霉菌DF‑32产谷氨酰胺转氨酶的用途；结合优化的培养基以及发酵条件，使之具有较高产TG酶的能力，可用于生产谷氨酰胺转氨酶，效果显著，为TG酶的实际生产提供理论依据和技术支持。

Description

一种产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物筛选及发酵工程领域，具体涉及一种产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其应用。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC.2.3.2.13)简称TG酶，是一种能够改善蛋白质组织、风味及货架期等的生物酶。蛋白质或多肽在TG酶催化的酰基转移反应作用下发生交联，促进分子间形成复杂的网络结构；也可促使蛋白质分子与游离的伯胺基发生连接，进而在蛋白分子中引入一些必需氨基酸，提高产品的营养价值。
TG酶存在于自然界的多种生物中，根据来源一般将其分为组织谷氨酰胺转氨酶和微生物谷氨酰胺转氨酶。组织谷氨酰胺转氨酶是从动植物组织中分离得到的，这类TG酶热稳定性差，具有Ca2+依赖性，分离纯化困难，产量较低。微生物来源的TG酶属于胞外酶，能够以酶原的形式分泌到培养基中，其催化作用不依赖于Ca2+，具有较高的热稳定性和广泛的酰基供体底物特异性；分子量较小(约为23～45kDa)，空间结构灵活，易分离纯化。
1989年，Ando等首先从土壤中分离到能够产生TG酶的链霉菌(Streptomyces sp.)S-8112。随后具有产TG酶能力的其他微生物被相继发现，如肉桂链霉菌(Streptomycescinnamoneum)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、扁平链霉菌(Streptomycesplatensis)、黎巴嫩链霉菌(Streptomyces libani)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、多头绒泡菌(Physarum polycephalum)、恶疫霉(Phytophthoracactorum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。虽然能够产生TG酶的菌种多种多样，但研究发现来源于真菌的TG酶大多和组织型TG酶一样具有Ca2+依赖性，而来源于细菌的TG酶多存在于芽孢孢衣中，不易分离，TG酶产量低。因此，放线菌始终处于TG酶生产菌株开发及应用领域的主导地位。然而已有的研究表明，除茂源链霉菌外的其他能够产生TG酶的放线菌的原始菌株产酶能力较低，如链霉菌WZFF.W-12产TG酶的能力为0.24U/mL；吸水链霉菌109.5产TG酶能力为0.312U/mL。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，先提供一株分离自江苏省邳州市陈楼镇牛奶厂土壤中的具有产谷氨酰胺转氨酶能力的链霉菌菌株。
本发明所提供的产谷氨酰胺转氨酶黄灰链霉菌DF-32是从江苏省邳州市陈楼镇牛奶厂的土壤中分离得到的，于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020494，建议的分类命名为黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus)DF-32。
本发明所提供的产谷氨酰胺转氨酶菌株在合适的培养基及30℃和200r/min条件下能较好地生长并具有较强的产谷氨酰胺转氨酶能力，具有潜在的应用价值。
本发明还提供一种黄灰链霉菌DF-32产谷氨酰胺转氨酶的用途，具体按照以下步骤进行：
(1)种子液培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：可溶性淀粉20g，胰蛋白胨20g，MgSO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min；
(2)发酵培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：葡萄糖10～50g，胰蛋白胨10～50g，鱼粉蛋白胨10～50g，酵母膏1～10g，CaCO3 1～8g，MgSO4·7H2O 1～3g，K2HPO4 1～3g，KH2PO4 1～3g，KNO3 0.5～2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(3)菌种活化：首先将黄灰链霉菌DF-32接入步骤(1)配制的种子液培养基中，于28～30℃、180～200r/min条件下培养10～96h，得到活化后的种子液；
(4)发酵：将步骤(3)活化后的种子液接入步骤(2)配制的发酵培养基中，经发酵后即实现黄灰链霉菌DF-32产谷氨酰胺转氨酶的用途。
优选的，步骤(2)中所述发酵培养基的配制：葡萄糖20g，胰蛋白胨15g，鱼粉蛋白胨20g，酵母膏5g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 2g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，KNO3 1g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
优选的，步骤(3)中活化培养的条件为：30℃、200r/min条件下培养48h。
优选的，步骤(4)中所述种子液与发酵培养基的体积比为1:15～20。
优选的，步骤(4)中所述发酵的条件为：温度30℃，转速200r/min，时间72h。
有益效果：
本发明提供了一株尚未被报道过的黄灰链霉菌DF-32，结合优化的培养基以及发酵条件，使之具有较高产TG酶的能力，为TG酶的实际生产提供理论依据和技术支持。其中，在组成为葡萄糖20g，胰蛋白胨15g，鱼粉蛋白胨20g，酵母膏5g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 2g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，KNO3 1g，蒸馏水定容至1000mL(pH 7.0，121℃灭菌20min)的发酵培养基中，于30℃，200r/min条件下发酵72h效果最好，此时菌体生物量达到22.36g/L，TG酶活力达到1.52U/mL；具备突出的效果。
附图说明
图1为本发明黄灰链霉菌DF-32的菌落形态。
图2为本发明黄灰链霉菌DF-32的革兰氏染色。
图3为本发明黄灰链霉菌DF-32插线法培养后的菌丝形态。
图4为本发明黄灰链霉菌DF-32基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
图5为本发明黄灰链霉菌DF-32的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
菌种的分离与鉴定：
黄灰链霉菌DF-32的分离：
(1)于江苏省邳州市陈楼镇牛奶厂采集土壤样品，采样时挑选颜色偏黑、颗粒较细、干燥、偏碱性的土壤。土样自然风干三天，再于60℃烘箱中干燥一周，备用；
(2)10g土样与90mL无菌水充分混合，静置30min；梯度稀释成浓度为10-1～10-7的菌悬液，依次吸取浓度10-4～10-7的菌液0.2mL涂布于高氏一号平板培养基(可溶性淀粉20g，KNO3 1g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min)上，28℃培养3～7天，挑取疑似放线菌的单个菌落划线接种于高氏一号斜面培养基上，28℃培养3～7天后于4℃冰箱保存；
(3)初筛：挑取斜面单个孢子接种到50mL发酵培养基中，于30℃、200r/min培养3天；4℃、4000r/min离心后取上清液，用蛋白质交联凝絮沉淀法初筛；
蛋白质交联凝絮沉淀法：将酪蛋白溶解在0.02M、pH 6.5的磷酸缓冲液中，使其浓度为6～12％；将酪蛋白溶液与初筛发酵上清液按照1:1(v/v)的比例混合，37℃反应3h后置4℃冰箱中过夜；对混合溶液进行观察，能够使酪蛋白溶液产生沉淀的菌株被初步判断为具有产TG酶的能力；
(4)复筛：将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中于30℃、200r/min活化培养48h；取2.5mL活化后的种子液接种于50mL发酵培养基中，在30℃，200r/min条件下发酵72h。参照《GB/T 34795-2017谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》测定发酵液中TG酶活性。酶活定义：在37℃、pH 6.0时，每分钟催化N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺盐形成1μmol异羟肟酸盐所需的酶量为1个单位。菌体生物量的测定采用重量法：10mL发酵液于4000r/min离心20min，用蒸馏水洗涤沉淀两次，于80℃真空干燥箱中干燥至恒重后称重。经测定，发酵液中菌体生物量为11.65～22.36g/L，TG酶活力为0.37～1.52U/mL，获得具有产TG酶能力的菌株。
黄灰链霉菌DF-32的鉴定：
(1)菌落形态观察：将上述分离到的菌株接种到种子液培养基中活化40h后，将其梯度稀释到适宜浓度后涂布于高氏一号平板培养基，28℃培养3～7天，观察菌落形态(图1)。黄灰链霉菌DF-32菌落呈圆形，表面干燥、粗糙、不透明、呈细小颗粒状，菌落中央略微突起，边缘不规则延伸，菌落正反颜色不一致，气生菌丝呈灰白色、营养菌丝呈黄色；菌体经革兰氏染色后在光学显微镜下观察为蓝紫色，呈革兰氏阳性(图2)；
(2)菌丝及孢子丝形态观察：用接种环挑取少量上述分离菌株，在高氏一号平板上呈Z字形密集划线，将洗净灭菌的盖玻片垂直于划线部分呈45°斜插入培养基中，使菌丝沿着盖玻片生长；将平板倒置在28℃培养箱中培养3～7天，取出盖玻片，将没长菌的一面用擦净纸擦净后用显微镜观察菌丝形态及孢子丝形态(图3)。黄灰链霉菌DF-32的营养菌丝细长、多分枝、少有断裂，颜色呈浅黄色，培养到后期呈褐色，气生菌丝比营养菌丝稍粗，呈直条形、波曲形或部分分化成连接紧密的孢子丝；
(3)分子生物学鉴定：对分离出的菌株进行16S rDNA序列分析，将测序结果经NCBI比对后用MEGA软件构建系统进化树(图4)。该菌株与Streptomyces flavogriseus strainP.S.461(KF991651.1:8-1477)聚在同一分支上，且同源性高达99.86％；结合形态特征及生长条件可确定该菌株为黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus)，目前尚未有该菌株能产生谷氨酰胺转氨酶的报道；
上述黄灰链霉菌DF-32于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020494，建议的分类命名为黄灰链霉菌DF-32(Streptomyces flavogriseus DF-32)。
黄灰链霉菌DF-32的生长曲线测定：
挑取黄灰链霉菌DF-32单孢子接种到50mL种子液培养基中，在30℃及200r/min条件下分别培养0、10、24、30、36、48、54、60、72、78、84和96h，于600nm处测定培养液的OD值并利用重量法测定生物量，绘制生长曲线。该菌株的延滞期约为10h，随后进入对数生长期，培养70h后到达稳定生长期，如图4所示。
实施例1：
(1)种子液培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：可溶性淀粉20g，胰蛋白胨20g，MgSO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min；
(2)发酵培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，鱼粉蛋白胨10g，酵母膏1g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 1g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，KNO3 0.5g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；
(3)菌种活化：挑取一环于4℃冰箱中保存的黄灰链霉菌DF-32接入种子液培养基中，于30℃、200r/min条件下培养48h；
(4)发酵：用移液枪吸取2.5mL活化后的种子液接入50mL发酵培养基中，于30℃、200r/min条件下发酵72h。经测定，发酵液中菌体生物量为11.65g/L，TG酶活力为0.37U/mL。
实施例2：
操作步骤同实施例1，区别在于：发酵培养基组成为葡萄糖50g，胰蛋白胨50g，鱼粉蛋白胨50g，酵母膏10g，CaCO3 8g，MgSO4·7H2O 3g，K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，KNO3 2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
经测定，发酵液中菌体生物量为16.85g/L，TG酶活力为0.93U/mL。
实施例3：
操作步骤同实施例1，区别在于：发酵培养基组成为葡萄糖20g，胰蛋白胨15g，鱼粉蛋白胨20g，酵母膏5g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 2g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，KNO3 1g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
经测定，发酵液中菌体生物量为22.36g/L，TG酶活力为1.52U/mL。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus)DF-32，于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020494。
2.权利要求1所述的黄灰链霉菌DF-32的用途，其特征在于，用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途。
3.权利要求2所述的用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途，其特征在于，具体步骤如下：
(1)种子液培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：可溶性淀粉20g，胰蛋白胨20g，MgSO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min；
(2)发酵培养基的配制，配制1L种子液培养基需要的组分及用量如下：葡萄糖10～50g，胰蛋白胨10～50g，鱼粉蛋白胨10～50g，酵母膏1～10g，CaCO3 1～8g，MgSO4·7H2O 1～3g，K2HPO4 1～3g，KH2PO4 1～3g，KNO3 0.5～2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；
(3)菌种活化：首先将黄灰链霉菌DF-32接入步骤(1)配制的种子液培养基中，于28～30℃、180～200r/min条件下培养10～96h，得到活化后的种子液；
(4)发酵：将步骤(3)活化后的种子液接入步骤(2)配制的发酵培养基中，经发酵后即实现黄灰链霉菌DF-32产谷氨酰胺转氨酶的用途。
4.根据权利要求3所述的用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基的配制：葡萄糖20g，胰蛋白胨15g，鱼粉蛋白胨20g，酵母膏5g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 2g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，KNO3 1g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求3所述的用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途，其特征在于，步骤(3)中活化培养的条件为：30℃、200r/min条件下培养48h。
6.根据权利要求3所述的用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途，其特征在于，步骤(4)中所述种子液与发酵培养基的体积比为1:15～20。
7.根据权利要求3所述的用于谷氨酰胺转氨酶生产的用途，其特征在于，步骤(4)中所述发酵的条件为：温度30℃，转速200r/min，时间72h。
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