CN103981130A

CN103981130A - 一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用

Info

Publication number: CN103981130A
Application number: CN201410193436.7A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 李玉燕; 李市场; 刘媛; 黄思思
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2034-05-09
Also published as: CN103981130B

Abstract

本发明公开了一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用，分类命名为一种吸水链霉菌（streptomyceshygroscopicus）NYU-70，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2014121。以吸水链霉菌（streptomyceshygroscopicus）NY-1为出发菌株，进行低能离子注入诱变，诱变后菌株经酪蛋白凝胶法比较、比色法进一步测定酶活性，筛选出产谷氨酰胺转氨酶活性较高的突变株，作为下一轮诱变的出发菌，重复上述步骤筛选得到。该菌株发酵产谷氨酰胺转氨酶活性高，遗传稳定性好。利用该突变株进行液体摇瓶发酵可得谷氨酰胺转氨酶，酶活为16.9U/mL。

Description

一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质—谷氨酸—谷氨酰胺转移酶，Transglutaminase，简称TG，EC2.3.2.13)，又称转谷氨酰胺酶，是一种催化蛋白质或多肽中谷氨酰胺残基的酰基转移反应的转移酶。由于能催化许多蛋白质进行共价交联聚合，改善各种蛋白质的功能特性，在食品工业、纺织工业和医药工业上具有广泛的应用前景及优势，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种之一，引起了国内外研究者的高度重视和兴趣。谷氨酰胺转氨酶在食品工业加工过程中的主要功能包括： (1)对各种食品蛋白质进行改性，保护赖氨酸不发生各种化学反应，包封类脂质和脂溶性物质;(2)形成抗热和抗水薄膜，胶凝蛋白质时避免进行热处理;(3)提高弹性和持水能力;(4)改变可溶性和各种功能性质，从而生产出营养价值较高并含有人体所必需氨基酸的食品蛋白。

近年来，国外对TG 的研究较多也较为深入，报道的生产方法主要有从动植物组织中提取和微生物发酵法生产。鉴于从动植物提取TG 的回收得率低，成

本过于昂贵等原因，人们开始转向用发酵法生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)。

较之其他来源的TG酶，从微生物中提取的TG酶(MTG)具有较高的热稳定性，在pH值5-9范围内都能保持较高的活性。并且其酶活性完全不依赖于Ca2+的存在。这些优势使其更易被加工处理，因而在食品等领域的应用更加广泛。

1989 年日本味之素公司的科研人员首先报告了利用链轮丝菌(Streptoverticillium)直接发酵生产MTG，酶的分离提纯、酶的基本结构分析、酶基因本身和化学合成基因的克隆表达、以及酶在各种食品加工中的广泛应用成果，并已获得了巨大经济效益，引起了国内外高度关注。目前，我国国内也有一些关于实验室水平发酵生产该酶及其应用的研究报道，但总体上说现在还处于研究的起步阶段，目前所知的发酵法产谷氨酰胺转氨酶中酶活最高的为专利CN200910223521.2中所述菌株CCTCC203062，其发酵产酶活为的6.47U/ml。而国外产品正准备大批量打入国内市场。因此，尽快强化对MTG的研究开发工作十分必要。

发明内容

本发明的目的是为了获得一株高产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其应用，使其发酵产谷氨酰胺转氨酶（MTG）的酶活大幅度提高。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：

一株谷氨酰胺转氨酶高产菌，其分类命名为吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70，已于2014年 4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2014121。

本发明所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株——吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的筛选方法如下：以吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NY-1为出发菌株，进行低能离子注入诱变，诱变后菌株经酪蛋白凝胶法比较筛选出具有一定活性的菌株，后经比色法进一步测定酶活性，筛选出产谷氨酰胺转氨酶活性较高的突变株，作为下一轮诱变的出发菌。重复上述步骤直至筛选到目标菌株吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70，其形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：白色

菌落大小：2mm～5mm

菌落形态：表面干燥、突起，不规则

气生菌丝：初期为白色，后期菌落中心显灰色

基内菌丝：灰色

色素：无

镜检形态：气生菌丝直、分枝多、生长较旺盛、基丝无横隔、不断裂、孢子圆形、表面光滑、孢子丝为紧密螺旋

需氧方式：好氧

营养方式：化能异养

适宜生长温度：30～40℃。

本发明所提供的谷氨酰胺转氨酶高产菌的诱变选育方法，具体步骤如下：

（a）单孢悬液制备：用无菌的生理盐水洗下产孢固体培养基平板上的孢子，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡 20min，用脱脂棉过滤， 4000rpm 离心 10min 后弃上清，取沉淀洗涤，制得孢子悬浮液。用血球计数板直接记数，调整孢子浓度为约 10⁶个/mL，备用。

（b）低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤（a）中的菌悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在注入能量为20 KeV，注入剂量为2×10¹⁵ions/cm²下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在32℃下倒置培养7d。

（c）摇瓶发酵：将步骤（b）筛选到的生长良好的菌株接种至斜面培养基，在32℃下培养5d，取斜面培养物接种至种液培养基，250ml三角瓶中装液量为30ml，于30℃恒温摇床，转速为200rpm培养24小时，后以1/3的接种量接种至发酵培养基，250ml三角瓶中装液量为30ml，于30℃恒温摇床，转速为200rpm培养72小时。

（d）酶活初测： 1g 酪蛋白用少量 NaOH 湿润后，加入磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH=6.5)使酪蛋白浓度达到 12%。酪蛋白溶液与发酵上清液按一定比例混合均匀，于 37℃反应3h 后，置于 4摄氏度冰箱中过夜观察，根据有无凝胶现象确定上清液有无酶活。选取有凝胶现象的菌株用比色法进一步酶活测定。

（e）酶活复测：底物试剂中各物质的浓度分别是，盐酸羟胺0.1 mol/ L，CBZ-Gln-Gly 30 mmo l/ L， Tris-乙酸缓冲液0. 2 mo l/ L( pH6. 0) ，还原型谷胱甘肽10 mmol/ L，1 mL 底物试剂与0. 4 mL 上清液37℃预热5 min后，混合、反应10 min，迅速加入0. 4 mL 氯化铁-三氯乙酸试剂( 5% FeCl₃： 12%CCl3 COOH： 3，mol/ L H Cl= 1 ：1 ：1) 终止反应， 4000 r/ min 离心，弃去沉淀，测上清夜在500 nm 下的吸光度。37 ℃每min 催化形成1 Lmol 氧肟酸所需的酶量定义为1 个酶活单位，以r-单异氧肟酸作标准曲线。将测定出酶活最高的菌株作为下一轮诱变选育的出发菌，重复以上步骤，直至筛选到目标菌株。

在上述筛选方法中：步骤（a）、步骤（b）和步骤（c）所采用的平板培养基和斜面培养基包含如下质量组分（g/L）：碳源30～50、氮源10～30、无机盐2～8，中和剂5，琼脂18，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙。

在上述筛选方法中：步骤（c）所采用的种液培养基和摇瓶发酵培养基包含如下组分（g/L）：碳源20～40、氮源20～40、无机盐2～8，中和剂5，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙。

吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，包括以下步骤：

1)平板培养：将吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70接种至平板培养基上培养，培养温度为30～40℃，培养时间为7d。

2)斜面培养：将步骤1）平板培养的吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70接种至斜面培养基培养，培养温度为30～40℃，培养时间为5d。

3)种液培养：将步骤2）中吸水链霉（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的斜面培养物接种至种液培养基中培养，培养温度为30～40℃，摇床转速为200rpm，恒温培养24h。

4)发酵培养：将步骤3）中吸水链霉（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的种液接种至发酵培养基中培养，培养温度为30～40℃，摇床转速为200rpm搅拌速度为220rpm，恒温培养72h。

步骤1）和步骤2）中所采用的平板培养基和斜面培养基包含如下组分（g/L）：碳源30～50、氮源10～30、无机盐2～8，中和剂5，琼脂18，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙。

步骤3）和步骤4）中所采用的种液培养基和发酵培养基包含如下组分（g/L）：碳源20～40、氮源20～40、无机盐2～8，中和剂5，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙或氢氧化钠。

有益效果：

本发明提供的吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70产谷氨酰胺转氨酶活性高。在5L发酵罐中，最终产谷氨酰胺转氨酶酶活达到16.9U/ml，比原始出发菌株产谷氨酰胺转氨酶酶活提高了8.04倍，也超过现有菌株的发酵水平。本发明中菌株遗传稳定性好，具有应用于工业生产的前景。有着重大的社会意义及经济价值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明吸水链霉菌NYU-70的诱变选育方法。

具体步骤如下：

（a）菌悬液制备：取32℃恒温培养5d的吸水链霉菌NY-1，用无菌的生理盐水洗下产孢固体培养基平板上的孢子，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡 20min，用脱脂棉过滤， 4000rpm 离心 10min 后弃上清，取沉淀洗涤，制得孢子悬浮液。用血球计数板直接记数，调整孢子浓度为约 10⁶个/mL，取0.1ml菌悬液均匀涂布于100cm培养皿。

（b）低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤（a）中菌悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程中心装置。在20KeV的能量下对吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）进行离子注入。注入剂量为2×10¹⁵ions/cm²，靶室真空度为10^-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在32℃下倒置培养7d。

（d）酶活初测： 1g 酪蛋白用少量 NaOH 湿润后，加入磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH=6.5)使酪蛋白浓度达到 12%。酪蛋白溶液与发酵上清液按体积比（1：1）的比例混合均匀，于 37℃反应3h 后，置于 4℃冰箱中过夜观察，根据有无凝胶现象确定上清液有无酶活。选取有凝胶现象的菌株用比色法进一步测定酶活。

（e）酶活复测：底物试剂中各物质的浓度分别是，盐酸羟胺0.1 mol/ L，CBZ-Gln-Gly 30 mmo l/ L， Tris-乙酸缓冲液0. 2 mo l/ L( pH6. 0) ，还原型谷胱甘肽10 mmol/ L，1 mL 底物试剂与0. 4 mL 上清液37℃预热5 min后，混合、反应10 min，迅速加入0. 4 mL 氯化铁-三氯乙酸试剂( 5% FeCl₃： 12%　Cl₃ COOH： 3mol/ L H Cl= 1 ：1 ：1) 终止反应， 4000 r/ min 离心，弃去沉淀，测上清夜在500 nm 下的吸光度。37 ℃每min 催化形成1 Lmol 氧肟酸所需的酶量定义为1 个酶活单位，以r-单异氧肟酸作标准曲线。将测定出酶活最高的菌株作为下一轮诱变选育的出发菌，重复以上步骤，直至筛选到目标菌株。

其中，所使用的培养基配方（g/L）

步骤（b）和步骤（c）中所采用的平板培养基和斜面培养基为（g/L）：麦芽汁50、酵母膏10、磷酸氢二钾2，碳酸钙5，琼脂18，其余为水，初始pH7.2；

步骤（c）中所采用的种液培养基为：甘油15，葡萄糖10，鱼粉蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，轻质碳酸钙5，pH7.2

步骤（c）中所采用的发酵培养基为：甘油20，葡萄糖15，鱼粉蛋白胨25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，轻质碳酸钙5，pH7.2

实施例2 本实施例说明吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的生化特征及其遗传稳定性

吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70形态学及生理生化学特征为：菌落颜色：白色；菌落大小：2mm～5mm；菌落形态：表面干燥、突起，不规则；气生菌丝：初期为白色，后期菌落中心显灰色；基内菌丝：灰色；色素：无；镜检形态：气生菌丝直、分枝多、生长较旺盛、基丝无横隔、不断裂、孢子圆形、表面光滑、孢子丝为紧密螺旋；需氧方式：好氧；营养方式：化能异养；适宜生长温度：30～40℃。

传代发酵试验结果如表1所示

表1 吸水链霉菌NYU-70的遗传稳定性

传代次数	发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活（U/ml）
		1	16.8
2	16.9
		3	16.7
4	16.5
		5	16.4
6	16.4

从遗传稳定性实验结果可知，经过6次连续传代，突变株吸水链霉菌NYU-70发酵产谷氨酰胺转氨酶（MTG），发酵液中MTG的产量比较稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3

本实施例说明突变株吸水链霉菌NYU-70在250ml摇瓶中发酵产谷氨酰胺转氨酶。

本实施例所述的培养基配方：

平板培养基和斜面培养基为（g/L）：麦芽汁50、酵母膏5、磷酸氢二钾2，轻质碳酸钙5，琼脂18，其余为水，初始pH7.2；

种液培养基为：甘油15，葡萄糖10，鱼粉蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，轻质碳酸钙5，pH7.2

发酵培养基为：甘油20，葡萄糖15，鱼粉蛋白胨25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，轻质碳酸钙5，pH7.2

将筛选到得突变株吸水链霉菌NYU-70接种至平板基本培养基上于32℃条件下倒置培养7d后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度32℃，培养时间5d。取斜面培养物接种至种液培养基，250ml三角瓶中装液量为30ml，于30℃恒温摇床，转速为200rpm培养24小时，后以1/3的接种量接种至发酵培养基，250ml三角瓶中装液量为30ml，于30℃恒温摇床，转速为200rpm培养72小时。

发酵培养72h后用比色法测定发酵液中管氨酰胺转氨酶（MTG）的酶活性，达到了15.9g/L，是同等培养条件下的原始出发菌NY-1的MTG产酶活性的7.57倍。

实施例4

本实施例说明突变株吸水链霉菌NYU-70在5L发酵罐中发酵产谷氨酰胺转氨酶（MTG）。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板培养基和斜面培养基为（g/L）：麦芽汁50、酵母膏5、磷酸氢二钾2，碳酸钙5，琼脂18，其余为水，初始pH7.2；

发酵培养基为：甘油20，葡萄糖15，鱼粉蛋白胨25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，pH7.2，中和剂为氢氧化钠，由发酵罐自动控制添加。

将筛选到得突变株吸水链霉菌NYU-70接种至平板基本培养基上于32℃条件下倒置培养7d后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度32℃，培养时间5d。取斜面培养物接种至种液培养基，250ml三角瓶中装液量为30ml，于30℃恒温摇床，转速为200rpm培养24小时，后以1/3的接种量接种至5L发酵培养基，发酵罐设定转速为220rpm，温度为30℃，pH7.2培养64小时。

发酵培养64h后用比色法测定发酵液中管氨酰胺转氨酶（MTG）的酶活性，达到了16.9g/L，是同等培养条件下的原始出发菌NY-1的MTG产酶活性的8.04倍。

Claims

1.一株谷氨酰胺转氨酶高产菌，其分类命名为吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2014121。

2.权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶高产菌在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

3.权利要求2所述谷氨酰胺转氨酶高产菌在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

平板培养：将吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70接种至平板培养基上培养，培养温度为30～40℃，培养时间为7d；

斜面培养：将步骤1）平板培养的吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70接种至斜面培养基培养，培养温度为30～40℃，培养时间为5d；

种液培养：将步骤2）中吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的斜面培养物接种至种液培养基中培养，培养温度为30～40℃，摇床转速为200rpm，恒温培养24h；

发酵培养：将步骤3）中吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）NYU-70的种液接种至发酵培养基中培养，培养温度为30～40℃，摇床转速为200rpm搅拌速度为220rpm，恒温培养72h。

4.权利要求3所述谷氨酰胺转氨酶高产菌在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于：步骤1）的平板培养基和步骤2）的斜面培养基包含如下组分：碳源30～50 g/L、氮源10～30 g/L、无机盐2～8 g/L，中和剂5 g/L，琼脂18 g/L，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙。

5.权利要求3所述谷氨酰胺转氨酶高产菌在发酵产谷氨酰胺转氨酶中的应用，其特征在于：步骤3）的种液培养基和步骤4）的发酵培养基包含如下组分：碳源30～50 g/L、氮源10～30 g/L、无机盐2～8 g/L，中和剂5 g/L，其余为水，初始pH7.2；其中所述碳源为葡萄糖、麦芽汁和甘油中的一种或两种的混合；所述氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合，所述无机盐为钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为轻质碳酸钙或氢氧化钠。