CN104789635A - 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 - Google Patents
一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104789635A CN104789635A CN201510224891.3A CN201510224891A CN104789635A CN 104789635 A CN104789635 A CN 104789635A CN 201510224891 A CN201510224891 A CN 201510224891A CN 104789635 A CN104789635 A CN 104789635A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspergillus niger
- spore
- absorbancy
- wheat bran
- suspension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗，过滤，获得黑曲霉麸曲孢子悬液；(2)添加0.05％(v/v)的吐温80，超声波处理，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子悬液浓度为106～107个/mL；(3)用磷酸缓冲液配置8～14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液；(4)将步骤(2)与(3)的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均匀密封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线；(5)测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。本发明可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；其它微生物孢子活力评价，均适用本技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种评价黑曲霉麸曲孢子活力的方法。
背景技术
柠檬酸(Citric Acid)是一种具有多种功能的重要有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域；是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸，全球产量超过170万吨。同时，柠檬酸又具有优良的生物特性，在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域有巨大的应用潜力，其需求量以每年5％的速度增长。
黑曲霉(Aspergillus niger)是一类重要的工业微生物，由于具有酶系安全，利用碳源种类多，产酸能力强，耐酸能力较强等优点而备受柠檬酸产业的亲睐。工业化生产中，一批成熟的黑曲霉孢子需要经过试管斜面培养、茄子瓶培养、麸曲桶等方式逐级扩大培养。由于孢子活力缺乏有效的考察标准，一般通过将其转接发酵培养基，通过比较发酵产酸效果，以此来作为传代扩大培养的指标；但这种方法所需周期较长、工作量相对较大，缺乏系统性和规范性，同时延长了孢子培养周期。
目前，关于细胞活力评价方法主要集中在生物医学工程方面，检测细胞的生长和增殖，新药筛选、细胞毒性试验等，价格低廉成为细胞活性检测的主要方法。常用的方法有MTT法，FCM法，ATP法等，测定的基本原理主要利用了细胞膜的完整性和新陈代谢的能力。但这些检测方法存在操作流程较长，反应试剂需要现用现配，像MTT具有致癌性，仪器价格昂贵等缺陷。
麸曲孢子为黑曲霉特殊的休眠体，孢子壁较厚且通透性差，外源物质难于介入；同时孢子之间作用力较强，孢子粘附在一起，很难形成分散均匀的单孢子；因而，关于黑曲霉麸曲孢子活力研究鲜有报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法。本发明可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；其它微生物孢子活力评价，均适用本技术。
本发明的技术方案如下：
一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法，包括如下步骤：
(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤，获得黑曲霉麸曲孢子悬液；
(2)在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05％(v/v)的吐温80，同时在超声波清洗仪中处理，获得分散均匀的单孢子悬液，并调节孢子悬液浓度为106～107个/mL；
(3)用磷酸缓冲液配置8～14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液；
(4)将步骤(2)与(3)的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均匀，并用盖子密封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线；
(5)测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。
步骤(1)与(3)缓冲液pH范围为6.5～9.0。
步骤(2)超声波清洗仪处理时间为30～120s。
亚甲基蓝用刃天青或其他还原性染料代替。
本发明有益的技术效果在于：
本发明技术目的是针对柠檬酸生产菌种的黑曲霉麸曲孢子逐级扩大培养存在流程复杂、周期长、孢子活力筛选工作量大等问题，提供一种评价黑曲霉麸曲孢子活力评价方法，提高种子活力，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。
亚甲基蓝染色法可对酵母细胞进行活性检测，活细胞中的还原酶能使浸入细胞内的亚甲基蓝脱色，但死细胞由于酶失活，不发生脱色作用而保留初始的蓝色。本发明在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加吐温80分散孢子，在超声波清洗仪中处理进一步分散孢子，同时能够疏松孢子壁提高通透性，从而便于基于亚甲基蓝还原性的特点，建立一种评价黑曲霉麸曲孢子活力的方法。
本发明相比于现有技术所具有的优点有：
(1)本发明能够定量直接反应孢子活力，具有准确度高，检测速度快，安全无毒，对设备要求低和成本低廉等优点；
(2)提高种子活力，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；
(3)可以解决传统孢子活力评价方法孢子活力筛选工作量大，灵敏度低，无需严格的无菌操作，易受杂菌污染影响，周期长等缺点，提高活力检测针对性。
附图说明
图1为实施例1不同活力的孢子与吸光度变化量曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。在下面所有的实施方案中，孢子计数采用血球计数板。孢子活力检测采用亚甲基蓝褪色程度表征，通过吸光度的变化表征活力。其它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是江苏国信协联能源有限公司生产菌种。
实施例1：
配置PDA平板，试管斜面和茄子瓶培养基。玉米芯颗粒与水按照1:1比例混合均匀，添加玉米浆调节总氮量含量(TN＝1％～3％)，灭菌，获得麸曲桶培养基。黑曲霉菌种接种于PDA平板培养基活化，35～38℃培养箱培养40～48h；挑取单菌落接种试管斜面，35～38℃培养箱，培养5～7天，获得成熟的黑曲霉孢子；挑取一环试管斜面孢子，接种茄子瓶培养基，35～38℃培养8～10天，获得成熟的黑曲霉孢子；无菌水清洗茄子瓶孢子，获得孢子菌悬液，转接麸曲桶，每天翻桶2～3次，35～38℃培养8～10天，获得成熟的黑曲霉麸曲孢子。
取一定量的麸曲孢子，用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤玉米芯颗粒。在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05％(v/v)的吐温80，在超声波清洗仪中处理30s，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子浓度107个/mL。取新鲜孢子液与灭活处理后的孢子液分别按照0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0比例混合均匀，配置不同活力的孢子悬液。
分别取1mL上述孢子悬液与1mL的8mg/L亚甲基蓝溶液于比色皿中，盖上比色皿盖，反应420s，于663nm波长处吸光度-时间扫描曲线，测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。获得不同活力孢子与吸光度的变化量如图1所述。
从图1中可以看出，随着体系中孢子活力(即活孢子浓度)增加，其对亚甲基蓝的褪色反应程度越剧烈，亚甲基蓝的褪色程度ΔA与体系中鲜活孢子含量之间存在较好的线性相关(y＝0.008x+0.227，R2＝0.995)。由此可以说明，亚甲基蓝的褪色程度，可以很好的反映体系中细胞的活力情况。
实施例2
配置PDA平板，试管斜面和茄子瓶培养基。玉米芯颗粒与水按照1:1比例混合均匀，添加玉米浆调节总氮量含量(TN＝1％～3％)，灭菌，获得麸曲桶培养基。黑曲霉菌种接种于PDA平板培养基活化，35～38℃培养箱培养40～48h；挑取单菌落接种试管斜面，35～38℃培养箱，培养5～7天，获得成熟的黑曲霉孢子；挑取一环试管斜面孢子，接种茄子瓶培养基，35～38℃培养8～10天，获得成熟的黑曲霉孢子；无菌水清洗茄子瓶孢子，获得孢子菌悬液，转接麸曲桶，每天翻桶2～3次，35～38℃培养8～10天，获得成熟的黑曲霉麸曲孢子。
取一定的麸曲孢子，用pH 9.0的磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤玉米芯颗粒。在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05％(v/v)的吐温80，在超声波清洗仪中处理120s，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子浓度107个/mL。取5mL新鲜麸曲孢子悬液，依次向试管中加入0、1、2、3、4、5mL加热杀死的孢子悬液，剩余体积用pH 9.0的磷酸缓冲液补充，定容体积10mL，配置同等活力、不同浓度的麸曲孢子悬液。
分别取1mL上述孢子悬液与1mL的12mg/L亚甲基蓝溶液于比色皿中，盖上比色皿盖，反应420s，于663nm波长处吸光度-时间扫描曲线，测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。获得同等活力、不同浓度的麸曲孢子悬液与吸光度的变化量如表1所述。从表1中可以看出，同等活力孢子、不同浓度的麸曲孢子悬液的褪色程度基本是一致的。由此可以说明，亚甲基蓝的褪色程度，可以很好的反映体系中细胞的活力情况。
表1同等活力孢子的亚甲基蓝还原反应
以上所述仅为本发明的交叉实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (4)
1.一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤，获得黑曲霉麸曲孢子悬液；
(2)在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05％(v/v)的吐温80，同时在超声波清洗仪中处理，获得分散均匀的单孢子悬液，并调节孢子悬液浓度为106～107个/mL；
(3)用磷酸缓冲液配置8～14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液；
(4)将步骤(2)与(3)的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均匀，并用盖子密封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线；
(5)测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)与(3)缓冲液pH范围为6.5～9.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)超声波清洗仪处理时间为30～120s。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于亚甲基蓝用刃天青或其他还原性染料代替。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510224891.3A CN104789635B (zh) | 2015-05-05 | 2015-05-05 | 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510224891.3A CN104789635B (zh) | 2015-05-05 | 2015-05-05 | 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104789635A true CN104789635A (zh) | 2015-07-22 |
| CN104789635B CN104789635B (zh) | 2017-05-03 |
Family
ID=53554826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510224891.3A Active CN104789635B (zh) | 2015-05-05 | 2015-05-05 | 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104789635B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543113A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-05-04 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 |
| CN105695341A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法 |
| CN106148205A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-11-23 | 日照金禾博源生化有限公司 | 一种黑曲霉麸曲培养基及其制备方法 |
| CN107815421A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-20 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104031975A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-09-10 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法 |
| CN104402120A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-03-11 | 湖南大学 | 用白腐菌处理废水中亚甲基蓝的方法 |
| CN104634768A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选方法及试剂盒 |
-
2015
- 2015-05-05 CN CN201510224891.3A patent/CN104789635B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104634768A (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-20 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选方法及试剂盒 |
| CN104031975A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-09-10 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法 |
| CN104402120A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-03-11 | 湖南大学 | 用白腐菌处理废水中亚甲基蓝的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RICHARD WAX等: "Initiation of the Germination of Bacillus subtilis Spores by a Combination of Compounds in Place of L-Alanine", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
| 李慧蓉: "《白腐真菌生物学和生物技术》", 30 June 2005 * |
| 李秋萍等: "藓类植物孢子生活力的快速检测方法初探", 《西北植物学报》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543113A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-05-04 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 |
| CN105543113B (zh) * | 2016-03-07 | 2020-10-02 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 |
| CN105695341A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法 |
| CN105695341B (zh) * | 2016-03-16 | 2020-01-03 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法 |
| CN106148205A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-11-23 | 日照金禾博源生化有限公司 | 一种黑曲霉麸曲培养基及其制备方法 |
| CN107815421A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-20 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法 |
| CN107815421B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-06-05 | 江苏国信协联能源有限公司 | 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104789635B (zh) | 2017-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106167782B (zh) | 高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法 | |
| Chandrasekaran et al. | Production and optimization of protease by filamentous fungus isolated from paddy soil in Thiruvarur District Tamilnadu | |
| CN104928202A (zh) | 一种芽孢杆菌的发酵培养方法 | |
| CN104789635A (zh) | 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法 | |
| CN102994387A (zh) | 氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法 | |
| CN100368519C (zh) | 黑曲霉脂肪酶及其用途 | |
| CN104311348A (zh) | 改良的杏鲍菇液体发酵培养基以及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法 | |
| CN114381378B (zh) | 降解木质素的产黄青霉及其应用 | |
| CN107699499A (zh) | 一株米曲霉za127及其应用 | |
| CN103146624A (zh) | 一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺 | |
| CN105385607A (zh) | 一种香菇液体深层发酵培养基配方及发酵工艺 | |
| CN103614445B (zh) | 一种利用菌体蛋白替代部分酵母粉的金霉素发酵生产方法 | |
| CN110157624A (zh) | 一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法 | |
| CN103981130A (zh) | 一株谷氨酰胺转氨酶高产菌及其应用 | |
| CN106929441A (zh) | 一种粪肠球菌的培养方法 | |
| CN104450571A (zh) | 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株 | |
| CN109423462A (zh) | 一种用于植物秸秆和动物粪便腐熟复合微生物制剂制造方法 | |
| CN105441350B (zh) | 产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN106035985A (zh) | 一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法 | |
| CN105385608A (zh) | 一种香菇液体菌种深层发酵工艺 | |
| CN104541983A (zh) | 海鲜菇液化专用菌种培养基及相应的培养法 | |
| CN102061279A (zh) | 高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法 | |
| CN105200116B (zh) | 一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法 | |
| CN103756950A (zh) | 玫烟色棒束孢scau-ifcf02菌株液体发酵环境条件优化工艺 | |
| CN111004764A (zh) | 一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20151208 Address after: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Applicant after: Jiangnan University Applicant after: Joint limited energy company of Jiangsu China Telecom Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Applicant before: Jiangnan University |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Shi Guiyang Inventor after: Ding Zhongyang Inventor after: Li Ying Inventor after: Gu Zhenghua Inventor after: Chen Jian Inventor after: Wang Baoshi Inventor after: Zhang Jie Inventor after: Hu Zhijie Inventor after: Jiang Xiaodong Inventor after: Sun Fuxin Inventor after: Zhang Liang Inventor after: Li Youran Inventor before: Shi Guiyang Inventor before: Li Ying Inventor before: Gu Zhenghua Inventor before: Wang Baoshi Inventor before: Zhang Jie Inventor before: Hu Zhijie Inventor before: Jiang Xiaodong Inventor before: Sun Fuxin Inventor before: Zhang Liang Inventor before: Li Youran Inventor before: Ding Zhongyang |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |