CN105695341B - 一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法，针对现有技术中的黑曲霉菌种麸曲装填厚度不能过厚而导致的瓶数过多以及抽检率不高而导致的菌种污染等问题，通过采用玉米芯颗粒为培养基的载体并添加黑曲霉生长所需的营养液而制备出专用的培养基，并且对培养方式、制曲方法都进行了革新，很好地解决了现有技术的不足。使麸曲的检验率达到100%，排出了因麸曲问题造成的种子罐染菌，每个独立的培养单位的扩大及操作工艺流程的简化使操作人员减少80%，这不仅降低了企业的人员成本，而且有利于专业技术人员的培养，同时操作人员的减少也利于麸曲品质的波动，生产调度更加灵活，对企业的产量调整能快速及时的反馈。

Description

一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及一种微生物培养基及培养方法，特别是涉及柠檬酸发酵生产的黑曲霉菌种麸曲扩大培养的麸曲培养基及培养方法。

背景技术

柠檬酸在食品行业广泛地用作酸味剂，被称为第一食用酸味剂，也是发酵法生产的最重要的有机酸; 另外柠檬酸及柠檬酸盐类、酯类和柠檬酸衍生物都有广泛的用途。

黑曲霉菌种麸曲的制备是柠檬酸生产的基础，麸曲的品质直接关系到产品的质量。现在生产企业的制曲方式还是传统的方式，即使用麸皮在玻璃三角瓶中培养，其方法为将麸皮水洗，洗掉麸皮中的面粉，去除麸皮中的一部分水份，使麸皮含水约50%左右，松散装入2000ml的三角瓶，每瓶约35克，灭菌后接入一环黑曲霉孢子进行培养7-10天，培养成熟抽检合格后使用。使用时先将每瓶麸曲加无菌水制成菌悬液，将一定数量的菌悬液合在一个钢瓶里便于接入种子罐，由于发酵罐的大型化，每个种子罐需接入3-5个钢瓶的黑曲霉菌悬液。随着发酵罐的日趋庞大，这种制曲方法的弊端逐渐显现出来，一是工作量大，玻璃三角瓶容量有限，年产10万吨柠檬酸的企业每天制曲量就要达到1500瓶左右，并且接种过程中工序复杂，每瓶麸曲需加入无菌水，合瓶，才能接入种子罐。我国现有的柠檬酸企业产能基本都已达到20万吨以上，麸曲的制造已经成为企业发展急需解决的问题。二是麸曲的抽检率低，培养的瓶数数量多，检验麸曲时只能抽取5%左右的麸曲进行摇瓶发酵检验。由于每瓶麸曲都是一个独立的培养单位，每个种子罐需接入150瓶左右的麸曲，所以即使抽检合格也不能完全保证麸曲的品质，由麸曲造成的种子罐染菌时有发生，这对生产的调度带来了困难，影响了发酵的正常运行，降低了设备的生产效率。三是操作人员数量多，操作技术要求高。由于制曲工作完全为手工操作，菌种麸曲工段的人员需求非常大，每个企业都要几十人才能满足生产需要，并且这些人都需要较高的专业技能才能保证麸曲的合格生产，这对企业的人员配备提出了更高的要求。因此传统菌种麸曲的制备工艺已成为柠檬酸发酵生产的瓶颈，也降低了企业的生产效益。改进制曲方式成为企业的迫切要求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的黑曲霉菌种麸曲的培养方法，该方法不仅解决了麸皮培养基的不稳定性的问题，而且使单位麸曲的培养量大大提高，并且可以做到100%的检验，减少了制曲工段的操作步骤，避免染菌的情况发生，同时也大大节省了企业的人力成本。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基，所述培养基以玉米芯颗粒为载体，并添加黑曲霉生长所需的营养液；所述营养液由豆粕水解液、玉米浆粉、硫酸铵、葡萄糖组成。

该方案相对于传统的培养方法，在多个方面均有改进，例如：

1.麸曲培养基的开发方面；在传统制曲方法中，由于麸皮为小的片状结构，它的使用存在无法避免的弊端，就是麸皮的装填厚度不能过厚，约1-2cm，过厚则导致麸曲结块，中心内部由于菌种生长产生的热量不能及时的散出，造成菌种不能正常生长，这就限制了麸曲培养容器的大小，所以现在只能通过麸曲培养的瓶数来达到满足生产的需要。本发明使用了玉米芯颗粒为载体，并添加黑曲霉生长所需的营养液，制备出专用的培养基。

2.培养方式的改变：传统方式麸曲培养为静态培养，每隔一定时间进行翻曲，菌种生长所需的氧气和产生的二氧化碳通过玻璃三角瓶的棉塞进行交换，这也使每个三角瓶只能装填很少量的麸皮才能保证麸曲不会因为缺氧以及二氧化碳过高而影响菌种性能。而本发明由于使用玉米芯颗粒培养基，解决了结块问题，就可以使用大的容器，并且将原有的静态培养方式改为通风式培养，氧气和二氧化碳的交换通过通风来解决，通风也能带走菌种生长产生的热量，这样的方式就可以加大培养基的装填量，从而可以减少需要的三角瓶的数量。

综上所述，本发明通过对传统的培养基成分的变革，解决了现有的培养基数量多质量小的问题；同时，也将传统的静态培养改变为通风式培养，减小了培养过程中的工作量；并且较少的单位麸曲数量也可以实现100%检验，保证后续发酵过程所使用的孢子的品质，有利于后续缩短后续发酵过程的时间和提高转化率。

优选地，所述玉米芯颗粒是挑选吸水性好，干净的玉米芯为原料，水分含量≤10%，用粉碎机粉碎，过筛，选出直径为5-10mm的颗粒。

优选地，所述豆粕水解液是通过下述方法制备的：

1）将蛋白含量为46%的豆粕粉碎，过40目筛网；

2）加水调浆，豆粕与水的重量比为1:6；

3）用40%氢氧化钠调pH至6.5，然后加热至60℃；

4）加入碱性蛋白酶粉，酶粉加量为2000酶活力单位每克豆粕粉，保温酶解3小时；

5）酶解后将酶解液加温至100℃，趁热过滤，将过滤液的固形物含量加水调至10%备用。

过滤液的固形物含量测定以折光仪测量为准即过滤液折光为10%。豆粕水解液的制备中豆粕的调浆浓度、碱性蛋白酶的加量以及酶解的时间相互关联，可以有不同的配制条件，来达到获得豆粕水解液的目的，这里不再一一列举。

优选地，所述营养液中各组分的份数为：玉米浆粉和葡萄糖各200-800重量份，硫酸铵30-120重量份，豆粕酶解过滤液0-5体积份，所述豆粕酶解过滤液的体积份为玉米浆粉、葡萄糖和硫酸铵每克对应豆粕酶解过滤液1L。

例如，取玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵30-120g，豆粕酶解过滤液0-5L。

进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

1）取玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵30-120g，豆粕酶解过滤液0-5L，加水溶解，溶解后定容6L；

2）将上述步骤获得的6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃；烘干后即为培养基成品。

上述各原料的质量仅是具体的实施例用量，实际可以根据需要进行按比例的变化。

一种用于黑曲霉扩大培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）按上述的配方和制备方法制备培养基；

2）将上述步骤制备的培养基装入培养容器中，按照培养基与水的重量比1:1.6~1.8的比例加水，灭菌处理后冷却备用；

3）向上述备用的培养容器中接种并置于28-32℃培养室培养，通入无菌空气进行通风培养，通气量为1：0.1-1.0，培养过程中进行翻曲，培养前4天每8-12小时翻曲一次，其后每12-24小时翻曲一次，培养8-12天结束；

4）培养结束后，取水量麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后供发酵使用。

该培养方法在制曲方面较现有技术中的有较大的改进，将传统的静态培养变为通风式培养；将玉米芯成品培养基装填到容器中，容器上有进气和排风口，这里“通气量”是以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积的空气体积比来表示(V ／ V·min)，例如通气比为1 ：0.1-1，简称通气量为0.01-1体积：（体积·分钟）。

优选地，所述步骤2）中的灭菌处理条件为121℃灭菌90min。

优选地，所述步骤3）中的通风条件为：前三天通风量为1：0.25体积，后七天通风量为1：0.5体积。

进一步地，所述步骤3）中的前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次; 培养10天结束。

进一步地，所述步骤3）中的培养容器为20-25L。虽然本发明的使用使麸曲培养容器可扩性增强，容器容积已没有限制，但是在实际生产中体积太大不利于人员的操作，故20-25L的培养容器为最佳。

本发明很好的解决了传统菌种制曲的弊端，麸曲的检验率达到100%，排出了因麸曲问题造成的种子罐染菌，复合的培养基成分比天然培养基麸皮更趋于稳定，麸曲的品质得到保证，每个独立的培养单位的扩大及操作工艺流程的简化使操作人员减少80%，这不仅降低了企业的人员成本，而且有利于专业技术人员的培养，同时操作人员的减少也利于麸曲品质的波动，生产调度更加灵活，对企业的产量调整能快速及时的反馈，保证生产正常。

具体实施方式

下面通过最佳实施例进一步具体说明本发明，以使本领域技术人员可以更好地理解本发明，从而对本发明要求保护的范围作出更清楚的限定。

实施例一

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各800g，硫酸铵120g，加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

采用中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）保藏的黑曲霉CICC40021作为菌种源。将培养基成品1.9kg装入20L的培养容器中，加入3.2L水，121℃灭菌90min，冷却后接种培养。培养条件为：前三天通风量为1：0.25体积：（体积·分钟），后七天通风量为1：0.5体积：（体积·分钟），前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次。培养10天结束。麸曲培养结束后每个容器取少量的麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后备用。

300立方发酵罐生产应用：

取4个20L检验合格的麸曲加入无菌水制成孢子悬浮液，直接接入30立方种子罐中培养，种子成熟后接入发酵罐进行发酵，发酵结果与传统制曲的发酵结果对比如表一。

实施例二

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各200g，硫酸铵30g，豆粕酶解过滤液5L，加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

将培养基成品1.9kg装入20L的培养容器中，加入3.2L水，121℃灭菌90min，冷却后接种培养。培养条件为：前三天通风量为1：0.25体积：（体积·分钟），后七天通风量为1：0.5体积：（体积·分钟），前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次。培养10天结束。麸曲培养结束后每个容器取少量的麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后备用。

300立方发酵罐生产应用：

取4个20L检验合格的麸曲加入无菌水制成孢子悬浮液，直接接入30立方种子罐中培养，种子成熟后接入发酵罐进行发酵，发酵结果与传统制曲的发酵结果对比如表一。

实施例三

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各400g，硫酸铵60g，豆粕酶解过滤液2L，加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

将培养基成品3kg装入30L的培养容器中，加入4.8L水，121℃灭菌90min，冷却后接种培养。培养条件为：前三天通风量为1：0.25体积：（体积·分钟），后七天通风量为1：0.5体积：（体积·分钟），前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次。培养10天结束。麸曲培养结束后每个容器取少量的麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后备用。

300立方发酵罐生产应用：

取3个30L检验合格的麸曲加入无菌水制成孢子悬浮液，直接接入30立方种子罐中培养，种子成熟后接入发酵罐进行发酵，发酵结果与传统制曲的发酵结果对比如表一。

实施例四

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各800g，硫酸铵120g，豆粕酶解过滤液1L，加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

将培养基成品1.9kg装入25L的培养容器中，加入3.2L水，121℃灭菌90min，冷却后接种培养。培养条件为：前三天通风量为1：0.25体积：（体积·分钟），后七天通风量为1：0.5体积：（体积·分钟），前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次。培养10天结束。麸曲培养结束后每个容器取少量的麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后备用。

300立方发酵罐生产应用：

取4个20L检验合格的麸曲加入无菌水制成孢子悬浮液，直接接入30立方种子罐中培养，种子成熟后接入发酵罐进行发酵，发酵结果与传统制曲的发酵结果对比如表一。

表一

通过实施实例可以看出，本发明的制曲方法在生产中应用结果与传统制曲方式的结果一致，发酵液中的菌球数量优于传统制曲，每罐接入麸曲的单位数量减少了40-50倍，大大降低了操作人员的工作量，并且由于数量少，用于生产的麸曲能做到100%检验，保证了麸曲的可靠性。本发明的使用使麸曲培养容器可扩性增强，容器容积已没有限制，但是在实际生产中体积太大不利于人员的操作，故20-25L的培养容器为最佳。

Claims (4)

1.一种用于黑曲霉扩大培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基，所述培养基以玉米芯颗粒为载体，并添加黑曲霉生长所需的营养液；所述营养液由豆粕酶解过滤液、玉米浆粉、硫酸铵以及葡萄糖组成；所述营养液为玉米浆粉和葡萄糖各200-800重量份、硫酸铵30-120重量份以及豆粕酶解过滤液0-5体积份；

所述玉米芯颗粒是挑选吸水性好，干净的玉米芯为原料，水分含量≤10％，用粉碎机粉碎，过筛，选出直径为5-10mm的颗粒；

所述豆粕酶解过滤液是通过下述方法制备的：

①将蛋白含量为46％的豆粕粉碎，过40目筛网；

②加水调浆，豆粕与水的重量比为1:6；

③用40％氢氧化钠调pH至6.5，然后加热至60℃；

④加入碱性蛋白酶粉，酶粉加入量为2000酶活力单位每克豆粕粉，保温酶解3小时；

⑤酶解后将酶解液加温至100℃，趁热过滤，将过滤液的固形物含量加水调至10％备用；

加水混合溶解，溶解后定容6L，将获得的6L营养液均匀地混入8kg玉米芯颗粒中，待玉米芯颗粒将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃；烘干后即为培养基成品；

2)将制备的培养基成品装入培养容器中，按照培养基与水的重量比1:1.6～1.8的比例加水，灭菌处理后冷却备用；

3)向培养容器中接种并置于28-32℃培养室培养，通入无菌空气进行通风培养，通气量为1：0.1-1.0，培养过程中进行翻曲，培养前4天每8-12小时翻曲一次，其后每12-24小时翻曲一次，培养8-12天结束；通风条件为：前三天通风量为1：0.25体积，后七天通风量为1：0.5体积；培养容器为20-25L；

4)培养结束后，取水量麸曲孢子进行摇瓶检验，合格后供发酵使用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于黑曲霉扩大培养的麸曲培养基的营养液中取玉米浆粉和葡萄糖各200-800g、硫酸铵30-120g以及豆粕酶解过滤液0-5L，加水混合溶解，溶解后定容6L。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的前四天每隔8小时翻曲一次，后六天每隔24小时翻曲一次；培养10天结束。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的灭菌处理条件为121℃灭菌90min。