CN108410792B - 一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。本发明解决了茄子瓶种源的局限性和不稳定性，而且使种源的制作量大大降低，减少了制曲过程中接种的操作步骤，避免染菌的情况发生，同时也大大节省了企业的人力成本，为企业创造了较好的经济效益。

Description

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法。

背景技术

麸曲的制备是柠檬酸生产的基础，目前柠檬酸生产的制曲方法主要有两种，一是使用麸皮在玻璃三角瓶中培养，其方法为将麸皮水洗，洗掉麸皮中的面粉，去除麸皮中的一部分水份，使麸皮含水约50％左右，松散装入2000ml的三角瓶，每瓶约35克，灭菌后接入一环茄子瓶中黑曲霉孢子进行培养7-10天，每个茄子瓶可接50-60个三角瓶，培养成熟抽检合格后使用。使用时每个种子罐需接入150瓶左右的麸曲，目前柠檬酸生产企业基本使用该制曲方法，但该方法麸曲检验率低，操作人员数量多，操作技术要求高。二是以玉米芯颗粒为载体，添加黑曲霉生长所需的营养物质，在大容器中培养(大麸曲)，每个种子罐只需接入3-4个培养单位，该方法大大降低了操作人员的工作量和人数，并且由于数量少，用于生产的麸曲能做到100％检验，保证了麸曲的可靠性。

由于麸曲容量大，所以种源的孢子数量需求也大，目前的方法是使用茄子瓶为种源，其局限性是茄子瓶为斜面培养，面积有限，孢子数量不多，所以为一个茄子瓶对应一个麸曲培养容器，其操作过程是将无菌水倒入茄子瓶中，用无菌针将茄子瓶中的黑曲霉孢子刮下形成孢子悬液，再倒入麸曲培养容器中，然后放入培养室培养。这种接种方法的弊端为茄子瓶制作量较大，接种操作繁琐，且每个茄子瓶之间刮下来的孢子数量，质量会有一定的差异，这造成麸曲质量有一定的波动。因此解决种源孢子问题，保证麸曲的质量，是企业急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法。本发明解决了茄子瓶种源的局限性和不稳定性，而且使种源的制作量大大降低，减少了制曲过程中接种的操作步骤，避免染菌的情况发生，同时也大大节省了企业的人力成本，为企业创造了较好的经济效益。

本发明的技术方案如下：

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；

(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。

步骤(1)中所述玉米芯培养基由玉米芯颗粒和黑曲霉生长所需的营养液组成；所述玉米芯颗粒是挑选吸水性好，干净的玉米芯为原料，水分含量≤10％，用粉碎机粉碎，过筛，选出直径为5-10mm的颗粒；所述营养液组成为：玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵60-120g，豆粕酶解过滤液0-6L；

所述豆粕酶解过滤液通过下述方法制得：

①将蛋白含量为46％的豆粕粉碎，过40目筛网；

②加水调浆，豆粕与水的重量比为1:6；

③用40％氢氧化钠调pH至6.5，然后加热至60℃；

④加入碱性蛋白酶粉，酶粉加量为2000酶活力单位每克豆粕粉，保温酶解3小时；

⑤酶解后将酶解液加温至100℃，趁热过滤，将过滤液的固形物含量加水调至10％备用。

所述玉米芯培养基制备方法为：取玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵60-120g，豆粕酶解过滤液0-6L，加水溶解，溶解后定容6L，将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃，烘干后即为培养基成品。

步骤(1)中所述培养种源孢子的方法为：将玉米芯培养基装入三角瓶中，按照培养基与水的重量比1:1.2-1.6的比例加水，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养7-14天，培养结束后种源水份低于20％。

步骤(2)中所述载体吸附分离法制取种源孢子菌剂的方法为：

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20％NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH为7，烘干灭菌备用；

②将灭菌的细沙倒入培养好种源孢子的三角瓶中，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀，孢子均匀的吸附在细沙上，由于玉米芯培养基的颗粒大小为5-10mm，与细沙的颗粒大小相差较大，使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，将分离后的细沙分装成若干个无菌瓶中，制得种源孢子菌剂。

步骤(3)中所述制曲的方法为：

①将玉米芯成品培养基装填到麸曲培养容器中，容器上有进气和排风口，按照培养基与水的重量比1:1.6～1.8的比例加水，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于28-32℃培养室通风培养。

本发明种源孢子菌剂制备及制曲的流程为：

三角瓶种源→加入细沙摇匀→过筛筛出孢子→分装小瓶→倒入大麸曲

本发明有益的技术效果在于：

本发明很好的解决了制曲过程中茄子瓶种源的弊端，将孢子菌剂应用于现有生产中，其应用后大麸曲的合格率应不低于现有以二代茄子瓶为种源的大麸曲合格率。孢子菌剂的应用可以有效降低操作人员的工作量，不使用茄子瓶使接种环节大大简化，人员数量可减少3-5人。

本发明孢子菌剂是以三角瓶培养为孢子来源，通过细沙作为分离介质，分离出黑曲霉孢子，每个三角瓶制备的孢子可以对应多桶大麸曲，在一定程度上减少了种源质量和数量上不一致而造成的麸曲波动。同时在制曲过程中只要直接将孢子菌剂倒入大麸曲桶即可，免去了在二代茄子瓶中先倒入无菌水再刮孢子的繁琐步奏，减轻工作量的同时更能减少染菌的机会，实现步骤越少染菌机会越少。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各800g，硫酸铵120g，加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

取4个2000ml三角瓶，每瓶装入玉米芯培养基40g，加入60ml水，121℃灭菌30min，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养8天，培养后水份含量分别为12.3％、14.5％、10.1％、13.2％。

(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20％NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH7，烘干灭菌备用；

②每瓶加入灭菌的细沙400g，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀后使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，分别得到细沙孢子菌剂398g、380g、386g、390g，将其分装到无菌瓶中，每瓶重量为15g细沙孢子，分别得到26瓶、25瓶、25瓶、26瓶，共102瓶孢子菌剂。同时取少量的细沙进行摇瓶检验，合格后作为种源孢子菌剂使用。

(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。

①将1.9kg玉米芯成品培养基装填到25L麸曲培养容器中，加水3.4L，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于30℃培养室通风培养制曲。制曲结束后摇瓶检验麸曲合格率。孢子菌剂与茄子瓶制曲的结果对比如表1所示。

实施例2

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各200g，硫酸铵60g，豆粕水解液3.4L加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

取4个1000ml三角瓶，每瓶装入玉米芯培养基40g，加入50ml水，121℃灭菌30min，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养12天，培养后水份含量分别为9％、8.6％、10.3％、7.6％。

(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20％NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH7，烘干灭菌备用；

②每瓶加入灭菌的细沙400g，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀后使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，分别得到细沙孢子菌剂392g、381g、395g、399g，将其分装到无菌瓶中，每瓶重量为15g细沙孢子，分别得到26瓶、25瓶、26瓶、26瓶，共103瓶孢子菌剂。同时取少量的细沙进行摇瓶检验，合格后作为种源孢子菌剂使用。

(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。

①将2.0kg玉米芯成品培养基装填到25L麸曲培养容器中，加水3.5L，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于30℃培养室通风培养制曲。制曲结束后摇瓶检验麸曲合格率。孢子菌剂与茄子瓶制曲的结果对比如表1所示。

实施例3

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取玉米浆粉和葡萄糖各400g，硫酸铵120g，豆粕水解液1L加水混合溶解，溶解后定容6L。将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

取4个2000ml三角瓶，每瓶装入玉米芯培养基60g，加入84ml水，121℃灭菌30min，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养10天，培养后水份含量分别为16.1％、16.5％、15.1％、17.2％。

(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20％NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH7，烘干灭菌备用；

②每瓶加入灭菌的细沙600g，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀后使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，分别得到细沙孢子菌剂581g、579、590g，将其分装到无菌瓶中，每瓶重量为15g细沙孢子，分别得到38瓶、38瓶、39瓶，共115瓶孢子菌剂。同时取少量的细沙进行摇瓶检验，合格后作为种源孢子菌剂使用。

(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。

①将2.5kg玉米芯成品培养基装填到25L麸曲培养容器中，加水4L，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于30℃培养室通风培养制曲。制曲结束后摇瓶检验麸曲合格率。孢子菌剂与茄子瓶制曲的结果对比如表1所示。

实施例4

一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)玉米芯培养基中培养种源孢子；

玉米芯载体的选取和豆粕水解液的制备如前所述，营养液的配制如下；取豆粕水解液6L。将6L豆粕水解液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃。烘干后即为培养基成品。

取4个2000ml三角瓶，每瓶装入玉米芯培养基60g，加入72ml水，121℃灭菌30min，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养14天，培养后水份含量分别为5.6％、6.3％、5％、7.2％。

(2)采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20％NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH7，烘干灭菌备用；

②每瓶加入灭菌的细沙600g，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀后使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，分别得到细沙孢子菌剂598g、596g、591g，将其分装到无菌瓶中，每瓶重量为15g细沙孢子，分别得到39瓶、39瓶、39瓶，共117瓶孢子菌剂。同时取少量的细沙进行摇瓶检验，合格后作为种源孢子菌剂使用。

(3)将步骤(2)制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲。

①将2.4kg玉米芯成品培养基装填到25L麸曲培养容器中，加水4.3L，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将上述制备的种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于30℃培养室通风培养制曲。制曲结束后摇瓶检验麸曲合格率。孢子菌剂与茄子瓶制曲的结果对比如表1所示。

对比例：

将2.4kg玉米芯成品培养基装填到25L麸曲培养容器中，加水4.3L，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用。将无菌水分别倒入100个茄子瓶中，每个茄子瓶用无菌针将茄子瓶中的黑曲霉孢子刮下形成孢子悬液，再倒入麸曲培养容器中，每个茄子瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于30℃培养室通风培养制曲。制曲结束后摇瓶检验麸曲合格率。孢子菌剂与茄子瓶制曲的结果对比如表1所示。

表1

通过实施实例可以看出，本发明的种源孢子菌剂与现有的茄子瓶种源在制曲中的合格率相比优于茄子瓶，从表中可以看出，在麸曲的染菌率上，孢子菌剂和茄子瓶基本一致，但在麸曲的变异率上，孢子菌剂明显好于茄子瓶，这是由于茄子瓶制备悬浮液时无菌针不仅把孢子刮下来，同时也刮下了大量的菌丝，在显微镜下可以直观的观察到，菌丝过多是造成麸曲变异的原因，而孢子菌剂的制备过程则避免了这一点。同时在种源的制作上，每百个麸曲容器所需的种源，孢子菌剂的种源制作量比茄子瓶减少了95％以上，这大大降低了操作人员的工作量，并且由于数量少，对种源的控制更加精细化，有利于提高生产水平。

Claims (5)

1.一种黑曲霉制曲过程中种源孢子菌剂的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）玉米芯培养基中培养种源孢子；

（2）采用载体吸附分离法制得种源孢子菌剂；

（3）将步骤（2）制得的种源孢子菌剂接入麸曲培养容器中培养制曲；

步骤（2）中所述载体吸附分离法制取种源孢子菌剂的方法为：

①选用40目-60目之间的细沙，经水洗后，1：1盐酸浸泡24小时后，水洗至pH7，再用20%NaOH溶液浸泡24小时，用水洗至pH为7，烘干灭菌备用；

②将灭菌的细沙倒入培养好种源孢子的三角瓶中，摇动瓶子使得细沙与孢子充分混匀，孢子均匀的吸附在细沙上，由于玉米芯培养基的颗粒大小为5-10mm，与细沙的颗粒大小相差较大，使用过滤孔径2-3mm的过滤漏斗将培养基和细沙分离，将分离后的细沙分装成若干个无菌瓶中，制得种源孢子菌剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述玉米芯培养基由玉米芯颗粒和黑曲霉生长所需的营养液组成；所述玉米芯颗粒是挑选吸水性好，干净的玉米芯为原料，水分含量≤10%，用粉碎机粉碎，过筛，选出直径为5-10mm的颗粒；所述营养液组成为：玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵60-120g，豆粕酶解过滤液0-6L；

所述豆粕酶解过滤液通过下述方法制得：

①将蛋白含量为46%的豆粕粉碎，过40目筛网；

②加水调浆，豆粕与水的重量比为1:6；

③用40%氢氧化钠调pH至6.5，然后加热至60℃；

④加入碱性蛋白酶粉，酶粉加量为2000酶活力单位每克豆粕粉，保温酶解3小时；

⑤酶解后将酶解液加温至100℃，趁热过滤，将过滤液的固形物含量加水调至10%备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述玉米芯培养基制备方法为：取玉米浆粉和葡萄糖各200-800g，硫酸铵60-120g，豆粕酶解过滤液0-6L，加水溶解，溶解后定容6L，将6L营养液均匀地混入8kg玉米芯中，待玉米芯将营养液完全吸附后，置于低温烘干箱中烘干，温度不超过60℃，烘干后即为培养基成品。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述培养种源孢子的方法为：将玉米芯培养基装入三角瓶中，按照培养基与水的重量比1:1.2-1.6的比例加水，灭菌后冷却至35℃，用接种针挑一环孢子接种，置于35℃培养室静止培养7-14天，培养结束后种源水份低于20%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中所述制曲的方法为：

①将玉米芯成品培养基装填到麸曲培养容器中，容器上有进气和排风口，按照培养基与水的重量比1:1.6~1.8的比例加水，待成品玉米芯完全吸水后，放入灭菌锅121℃灭菌90min，灭菌后冷却处理备用；

②将种源孢子菌剂在无菌条件下倒入麸曲培养容器中接种，每个无菌瓶接一个麸曲培养容器，接种后容器置于28-32℃培养室通风培养。