CN104543401B - 一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，首先采用酒精工业黄水、麸皮、粉渣、玉米粉等工农业副产物为原料制备发酵基质，然后通过微生物筛选与驯化培养获得富锰微生物，并将其接种在所得的发酵基质中进行发酵，再将发酵后的物料进行干燥、粉碎、包装即制得产品。与化学合成的有机态锰饲料添加剂相比，本发明采用粉渣、麸皮、酒精工业黄水等副产物作为培养原料和基质，从而扩大了资源利用，降低了锰饲料添加剂的生产成本，而且制得的发酵态锰饲料添加剂生物有效性更稳定，其吸收率是无机硫酸锰吸收率的5.1倍，是氨基酸螯合锰吸收率的1.35倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物饲料加工领域，尤其是利用微生物制备发酵态锰饲料添加剂的方法。
背景技术
锰是动物体必需的微量矿物元素之一，其在动物体内的含量约0.2~0.3mg/kg。动物缺锰可导致采食量下降、生长减慢、饲料利用率降低、骨骼异常、共济失调及繁殖功能异常等。动物体对锰的需求，主要通过在饲料中添加锰制剂达到。和其他微量矿物元素相似，一直以来，锰的添加形式多为无机态锰，其吸收利用率不高。研发有机态合成锰制剂被认为是改善锰饲料添加剂利用效率的重要措施。如近些年开发出的一系列氨基酸螯合锰，虽然在生产中得到了应用，但利用效率并不稳定。研究发现，氨基酸螯合锰的生物学效率与其螯合率以及螯合强度密切相关，螯合率低的锰制剂其生物学效率也低，在已经螯合的锰制剂中，中等螯合强度的锰制剂利用率最好，螯合强度弱或强均不利于锰的利用。
微生物作为自然界存在最为广泛的生命体，能够降解饲料中抗营养因子，减少抗营养因子对锰离子的束缚，同时，微生物能够吞噬锰离子，形成自身有机态锰源，当动物体食入经过微生物发酵后的锰源后，可不同程度提高锰的生物学效率。
本发明是从中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》批准使用的微生物中筛选可用微生物，并通过驯化培养、发酵参数筛选等，研制具有较高锰吸收率的发酵态锰饲料添加剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，通过对微生物的筛选以及驯化培养获得富锰能力强的微生物菌种，并且采用酒精工业黄水、麸皮等工、农业副产物作为微生物培养基质，进行发酵态锰饲料添加剂的制备，以有效提高锰的吸收率，并大大降低有机态锰饲料添加剂的生产成本，同时达到资源再利用，降低环境污染等目的，而且也解决了制备过程中各项参数的确定及发酵物料的干燥、包装等技术问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，首先，将固体原料和液体原料以1:1~2的比例混合得到发酵底物，再向其中接种微生物进行发酵，发酵完毕后将得到的物料干燥、包装即制得产品，其中所述的微生物为经过筛选及驯化培养而获得的富锰能力强的微生物，所述制备方法包括以下具体步骤：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料，其中的固体原料按照重量百分比，其组成为：锰2.85%、粉渣26.0%、麸皮52.4%、玉米粉18.4%、尿素0.18%、糖0.12%、碳酸氢钠0.05%，并混合均匀备用，其中所述的锰选择硫酸锰、氯化锰等无机态锰；所述的液体原料为从板框压滤机的板框直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用碳酸氢钠或氢氧化钠将pH调节至7.0~7.2后得到，并将处理后的酒精工业黄水放入冰箱中贮存备用。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、配制含锰基础培养基和含锰梯度培养基
含锰基础培养基的制法是：将氯化钠2g、锰50mg、尿素5g、糖2g溶解于步骤1处理所得的酒精工业黄水中并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
含锰梯度培养基的制法是：按照上述含锰基础培养基的制法，将锰的含量在50mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锰梯度培养基备用；
2.2、微生物的筛选
按照5~8%的接种量，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锰基础培养基中，并且一个含锰基础培养基上接种一种微生物，然后将接种后的含锰基础培养基在36~36.5℃、55r/min的恒温培养箱内培养20h，记录各种微生物数量，数量最多者被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的微生物菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锰梯度培养基中，然后测定微生物中的锰含量，锰含量高者为富锰能力强，从而获得富锰能力强的微生物菌种，备用。
3、微生物的接种发酵
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2中经筛选和驯化培养得到的富锰能力强的微生物菌种按照5~8%的接种量接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度36~36.5℃，培养时间20h，从而获得用于发酵的微生物菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取步骤3.1所得的微生物菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5~8%的接种量接种在步骤1的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将步骤3.2所得的发酵基质置于35~36.5℃的恒温培养箱内发酵20~22h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，直至物料含水量达到12%~14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锰饲料添加剂成品，并真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
所述的酒精工业黄水的灭菌方法是将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，冷却。
所述的固体原料中的糖可以为葡萄糖、白砂糖、红糖、糖蜜等中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）与化学合成的有机态锰饲料添加剂相比，本发明采用粉渣、麸皮、酒精工业黄水等副产物作为培养原料和基质，从而扩大了资源利用，降低了锰饲料添加剂的生产成本；
（2）与化学合成的有机态锰饲料添加剂相比，本发明研制的发酵态锰饲料添加剂生物有效性更稳定，吸收率更高。采用Caco-2上皮细胞吸收模型研究发现，发酵态锰饲料添加剂锰吸收率在24.6%以上，无机硫酸锰吸收率为4.83%，氨基酸螯合锰（复合氨基酸，市售品）为18.2%。本发明提供的发酵态锰饲料添加剂锰吸收率是无机硫酸锰的5.1倍，是氨基酸螯合锰1.35倍；
（3）本发明通过对微生物进行筛选和驯化培养，更具针对性，提高了微生物发酵的效率，并保证了发酵态锰饲料添加剂中具有较高的锰吸收率；
（4）本发明提供了一种基于酒精工业黄水、麸皮等工、农业副产物为基质制作发酵态锰饲料添加剂的一系列方法步骤，包括固体物料组成与比例、培养物料化学性质调控、发酵参数筛选等。
具体实施方式
下面通过具体实施例以及相关的试验例对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装得到发酵态锰饲料添加剂，所述制备方法具体步骤如下：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锰、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锰选择硫酸锰，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锰含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量为22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖为葡萄糖；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锰2.85%（以锰计）、马铃薯粉渣26.0%、小麦麸52.4%、玉米粉18.4%、尿素0.18%、糖0.12%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用碳酸氢钠或氢氧化钠将pH调节至7.0后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中121℃灭菌15min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、含锰基础培养基和含锰梯度培养基的配制
含锰基础培养基的制法是：将氯化钠2g、锰50mg（以锰计）、尿素5g、糖2g溶解于步骤1处理所得的酒精工业黄水中并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
含锰梯度培养基的制法是：按照上述含锰基础培养基的制法，将锰含量在50mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置锰含锰梯度培养基备用；
2.2、微生物的筛选
按照5%的接种量，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别接种至步骤2.1所制备的含锰基础培养基中，并且一个含锰基础培养基上接种一种微生物，在36℃、55r/min的恒温培养箱内培养20h后，记录各种微生物数量，其中地衣芽孢杆菌的数量最多，因此地衣芽孢杆菌被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的地衣芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锰梯度培养基中，通过平板计数法统计不同含锰梯度培养基中地衣芽孢杆菌能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锰能力强；同时，在3000r/min下离心，获得地衣芽孢杆菌，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定地衣芽孢杆菌中的锰含量，锰含量高即为富锰能力强，从而获得富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种，备用。
3、微生物的接种发酵
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中所得的富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种按照5%的接种量接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度36℃，培养时间20h，从而获得用于发酵的地衣芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的地衣芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5%的接种比例接种于经步骤1混合后的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于35℃的恒温培养箱内发酵20h，得到发酵物料。
4、发酵后物料的干燥与包装
将步骤3.3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，并每间隔半个小时取样进行水分测定，直至物料水分损失至12%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锰饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085Mpa。
实施例2：一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装等步骤得到发酵态锰饲料添加剂，所述制备方法的具体步骤如下：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锰、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锰选择硫酸锰，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锰含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖选用葡萄糖；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锰2.85%（以锰计）、马铃薯粉渣26.0%、小麦麸52.4%、玉米粉18.4%、尿素0.18%、糖0.12%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用碳酸氢钠或氢氧化钠将pH调节至7.1后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中121℃灭菌18min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、含锰基础培养基和含锰梯度培养基的配制
含锰基础培养基的制法是：将氯化钠2g、锰50mg（以锰计）、尿素5g、糖2g溶解于步骤1处理所得的酒精工业黄水中并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
含锰梯度培养基的制法是：按照上述含锰基础培养基的制法，将锰含量在50mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置锰含锰梯度培养基备用；
2.2、微生物的筛选
按照6%的接种量，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锰基础培养基中，并且一个含锰基础培养基上接种一种微生物，然后将接种后的含锰基础培养基在36.2℃、55r/min的恒温培养箱内培养20h后，记录各种微生物数量，其中地衣芽孢杆菌的数量最多，因此将地衣芽孢杆菌筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的地衣芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锰梯度培养基中，通过平板计数法统计地衣芽孢杆菌能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锰能力强；同时，在3000r/min下离心，获得地衣芽孢杆菌，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定地衣芽孢杆菌中的锰含量，锰含量高即为富锰能力强，从而获得富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种，备用。
3、微生物的接种发酵
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中所得的富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种按照6%的接种量接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度36.2℃，培养时间20h，从而获得用于发酵的地衣芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的地衣芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照6%的比例混入步骤1制备的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于35.8℃的恒温培养箱内发酵21h，得到发酵物料。
4、发酵后物料的干燥与包装
将步骤3.3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时进行取样测定水分含量，直至物料水分损失至13%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锰饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.09Mpa。
实施例3：一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装得到发酵态锰饲料添加剂的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锰、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锰选择氯化锰，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锰含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖为葡萄糖；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锰2.85%（以锰计）、粉渣26.0%、麸皮52.4%、玉米粉18.4%、尿素0.18%、糖0.12%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用碳酸氢钠或氢氧化钠将pH调节至7.2后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、含锰基础培养基和含锰梯度培养基的配制
含锰基础培养基的制法是：将氯化钠2g、锰50mg（以锰计）、尿素5g、糖2g溶解于步骤1处理所得的酒精工业黄水中并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
锰含锰梯度培养基的制法是：按照上述含锰基础培养基的制法，将锰含量在50mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置锰含锰梯度培养基备用；
2.2、微生物的筛选
按照8%的接种量，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锰基础培养基中，并且一个含锰基础培养基上接种一种微生物，然后将接种后的含锰基础培养基在36.5℃、55r/min的恒温培养箱内培养20h后，记录各种微生物数量，其中地衣芽孢杆菌的数量最多，因此地衣芽孢杆菌被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的地衣芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锰梯度培养基中，通过平板计数法统计地衣芽孢杆菌能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锰能力强；同时，在3000r/min下离心，获得地衣芽孢杆菌，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定地衣芽孢杆菌中的锰含量，锰含量高即为富锰能力强，从而获得富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种，备用。
3、微生物的接种发酵
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中所得的富锰能力强的地衣芽孢杆菌菌种按照8%的接种量接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度36.5℃，培养时间20h，从而获得用于发酵的地衣芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的地衣芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照8%的接种接种于步骤1制备的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于36.5℃的恒温培养箱内发酵22h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3.3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时取样进行含水量测定，直至物料水分损失至14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锰饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.095Mpa。
试验例：采用Caco-2上皮细胞吸收模型研究发现，本发明所制备的发酵态锰饲料添加剂锰吸收率在24.6%以上，无机硫酸锰吸收率为4.83%，氨基酸螯合锰（复合氨基酸，市售品）为18.2%，因此，本发明制备的发酵态锰饲料添加剂锰吸收率是无机硫酸锰的5.1倍，是氨基酸螯合锰1.35倍。
Claims (3)
1.一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，首先，将固体原料和液体原料以1:1~2的比例混合得到发酵底物，再向其中接种微生物进行发酵，发酵完毕后将得到的物料干燥、包装即制得产品，所述液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，然后经过滤、灭菌后将pH调节至7.0~7.2得到，其特征在于：所述的固体原料按照重量百分比，其组成为：锰2.85%、粉渣26.0%、麸皮52.4%、玉米粉18.4%、尿素0.18%、糖0.12%、碳酸氢钠0.05%，其中，锰为无机态锰，所述的微生物为经过筛选及驯化培养而获得的富锰能力强的微生物，微生物的筛选及驯化培养方法如下：
（1）配制含锰基础培养基和含锰梯度培养基
含锰基础培养基的制法是：将氯化钠2g、锰50mg、尿素5g、糖2g溶解于经处理的酒精工业黄水中，并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
含锰梯度培养基的制法是：按照上述含锰基础培养基的制法，将锰的含量在50mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配制含锰梯度培养基备用；
（2）微生物的筛选
将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物按照5~8%的接种量，分别接种在步骤（1）所制备的含锰基础培养基中，并且一个含锰基础培养基上接种一种微生物，然后将接种后的含锰基础培养基在36~36.5℃、55r/min的恒温培养箱内培养20h，记录各种微生物数量，地衣芽孢杆菌的数量最多，被筛选作为发酵用的微生物菌种；
（3）微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤（2）所筛选的微生物菌种依次培养于步骤（1）中所制备的含锰梯度培养基中，然后测定微生物中锰含量，锰含量高者为富锰能力强，从而获得富锰能力强的微生物菌种，备用；
所述微生物的接种发酵方法如下：
（1）微生物菌种的扩大培养
将经过微生物的筛选以及驯化培养得到的富锰能力强的微生物菌种接种于处理过的酒精工业黄水中进行培养，其接种量为5~8%，培养温度36~36.5℃，培养时间20h，从而获得用于发酵的微生物菌种液，备用；
（2）制备发酵基质
取经扩大培养所得的微生物菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5~8%的接种量接种在所述的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加处理过的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
（3）发酵基质的发酵
将所得的发酵基质置于35~36.5℃的恒温培养箱内发酵20~22h，得到发酵物料。
2.根据权利要求1所述的一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵物料的干燥与包装方法是将发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，直至物料含水量达到12%~14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锰饲料添加剂成品，并真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
3.根据权利要求1所述的一种发酵态锰饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述的酒精工业黄水的灭菌方法是将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，冷却。
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