CN102994387A

CN102994387A - 氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法

Info

Publication number: CN102994387A
Application number: CN2012105432214A
Authority: CN
Inventors: 姜文侠; 杨玉兰; 刘琦; 杨萍; 陈宁
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明公开了氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法，涉及一种氨肽酶及其高产微生物菌株的高通量筛选方法。将单菌落接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，摇床培养，将深孔板I深孔中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的深孔中，摇床培养，将深孔板II离心，上清液为粗酶液。在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，再加入稀释的待测粗酶液，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束时立即加入30～50％乙酸溶液并终止反应。采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活。本发明实现了高通量培养、粗酶液的高通量制备及酶活的高通量测定的目标。

Description

氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及一种氨肽酶及其高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种、酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一类，它们能从蛋白质和多肽链的N末端顺序水解氨基酸，其催化机理可以用下式表示：

在生物体内，氨肽酶不仅维持着细胞的动态平衡，对于细胞的成熟、生长和防御都具有重要的作用，还作为转录调控因子、特异性位点的重组因子和毒素受体参与抗生素的活化与转运。氨肽酶的种类多，不同氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力不同，即使同一类氨肽酶对N端不同氨基酸残基的水解能力也有一定的差异。根据不同氨肽酶对N端氨基酸残基水解的专一性程度不同，可以将氨肽酶分为两大类：一类氨肽酶对N端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，如亮氨酸氨肽酶、赖氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶，区分这类氨肽酶的依据是它们对不同氨基酸残基的水解速度的快慢，如亮氨酸氨肽酶水解末端亮氨酸残基速度最快，而赖氨酸氨肽酶水解末端赖氨酸残基速度最快。另一类氨肽酶对N端氨基酸残基有严格的专一性，只能特异地水解某一种或几种氨基酸残基，如脯氨酸氨肽酶只能水解末端脯氨酸残基。氨肽酶特有的水解方式和功能，决定了其广泛应用于食品、医药、发酵、饲料及生物技术等行业。

目前氨肽酶制剂主要应用于功能肽的制备和蛋白质水解物的生产加工过程，用以提高营养质量，改善产品的风味。由于氨肽酶能促进不良口感疏水肽的水解、释放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸，氨肽酶已经成为水解蛋白脱苦剂的首选。

随着发酵技术的发展，微生物发酵法已成为氨肽酶工业化生产方法的主流。菌种是工业发酵生产氨肽酶的物质基础，从自然界筛选并在实验室诱变进化一直是发现和创新工业微生物菌种的重要途径。常规的菌种选育方法工作量大、周期长、效率低、成本高。采用高通量方法筛选新型的氨肽酶和氨肽酶高产菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度。

发明内容

为了克服筛选新型氨肽酶及其高产菌株的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量筛选方法。高通量筛选氨肽酶及其高产菌株方法如下：

挑取氨肽酶产生菌的单菌落，适当稀释菌浓度，接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，每一孔由板号、行号和列号的组合标记，使每个孔有一个特定的编号。盖上深孔板的三明治盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养4～10h。将深孔板I深孔中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的深孔中，盖上三明治盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养16～48h。将深孔板II放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min。深孔板II的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释。在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，加入稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作空白对照，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束立即加入30～50％乙酸溶液终止反应。采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活。根据酶活测定结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得氨肽酶高产菌株。(见附图1)

氨肽酶产生菌的单菌落可以来自自然界的含菌样品，也可以来自出发菌株的人工诱变的突变株。

采用微量化梯度稀释法稀释菌浓度的具体步骤为：用带滤芯的无菌移液吸头以8通道移液器，自深孔板的A1～H1孔中吸取0.1mL氨肽酶产生菌的悬液，移至装有0.9mL无菌生理盐水的深孔板的A2～H2孔中，振荡混匀，再用8通道移液器吸取0.1mLA2～H2，对应地移至深孔板A3～H3深孔中，如此逐级稀释至适当浓度。

所述液体种子培养基为：麦芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min。

所述发酵培养基为：麦芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氢钾0.5～3.0g/L、硫酸镁0.05～0.5g/L、氯化钠0.5～1.5g/L，pH6.5～7.5、0.1MPa灭菌30min。

上述的深孔板可以是：6孔板、12孔板、24孔板、48孔和96孔板。深孔板的三明治盖，是从上依次由带孔的不锈钢盖子、除菌微滤膜片和硅胶孔垫三层组成，不锈钢盖子和硅胶孔垫上的孔与深孔板的深孔对应，以保证各微孔独立地与外界交换空气。

培养基装液量为深孔板孔体积的5～30％。接种量是发酵培养基体积的4～14％。

采用微量化梯度稀释法稀释粗酶液的具体步骤为：吸取深孔板里的粗酶液0.1mL一一对应地移至装有0.9mL蒸馏水的深孔板中充分混匀，然后再吸取0.1mL至另一个装有0.9mL蒸馏水的深孔板，如此逐级稀释至适当浓度。

酶反应所用的缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、HEPES缓冲液和氨-氯化铵缓冲液之中的一种。缓冲液的pH为6.5～8.5。缓冲液浓度为0.02～0.2mol/L。

所述的显色底物是氨基酸对硝基苯胺，为下列化合物之一：丙氨酸对硝基苯胺(Ala-pNA)、精氨酸对硝基苯胺(Arg-pNA)、天冬酰胺对硝基苯胺(Asn-pNA)、天冬氨酸对硝基苯胺(Asp-pNA)、半胱氨酸对硝基苯胺(Cys-pNA)、谷氨酰胺对硝基苯胺(Gln-pNA)、谷氨酸对硝基苯胺(Glu-pNA)、组氨酸对硝基苯胺(His-pNA)、异亮氨酸对硝基苯胺(Ile-pNA)、甘氨酸对硝基苯胺(Gly-pNA)、亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)、赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)、甲硫氨酸对硝基苯胺(Met-pNA)、苯丙氨酸对硝基苯胺(Phe-pNA)、脯氨酸对硝基苯胺(Pro-pNA)、丝氨酸对硝基苯胺(Ser-pNA)、苏氨酸对硝基苯胺(Thr-pNA)、色氨酸对硝基苯胺(Trp-pNA)、酪氨酸对硝基苯胺(Tyr-pNA)、缬氨酸对硝基苯胺(Val-pNA)。

所述的荧光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素，为下列化合物之一：丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Ala-AMC)、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Arg-AMC)、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素(Asn-AMC)、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Asp-AMC)、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Cys-AMC)、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素(Gln-AMC)、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Glu-AMC)、组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(His-AMC)、异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Ile-AMC)、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Gly-AMC)、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Leu-AMC)、赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Lys-AMC)、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Met-AMC)、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Phe-AMC)、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Pro-AMC)、丝氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Ser-AMC)、苏氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Thr-AMC)、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Trp-AMC)、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Tyr-AMC)、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Val-AMC)。

显色底物溶液浓度为2～20μmol/L，荧光底物溶液浓度2～20nmol/L。

显色底物用于酶活测定比色的波长为360～450nm。

荧光底物用于酶活测定的激发光波长为340～400nm，发射光波长为420～480nm。

氨肽酶酶活的定义：在指定的温度和pH条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯胺(pNA)或1nmol7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)所需的酶量，为一个酶活单位(U)。

显色底物酶标板法标准曲线的绘制：配制系列适当浓度梯度的对硝基苯胺标准溶液，以蒸馏水为对照，在360～450nm波长处，用酶标板法测定对硝基苯胺的含量。以吸光度为纵坐标，对硝基苯胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。

荧光底物酶标板法标准曲线的绘制：配制系列适当浓度梯度的荧光底物标准溶液，以蒸馏水为对照，测定的激发光波长为340～400nm，发射光波长为420～480nm，用酶标板法测定反应后释放的7-氨基-4-甲基香豆素的荧光强度。以荧光强度为纵坐标，荧光底物浓度为横坐标，绘制标准曲线。

氨肽酶种类的判断：若底物为亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Leu-AMC)时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物为甲硫氨酸对硝基苯胺(Met-pNA)或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Met-AMC)时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有甲硫氨酸氨肽酶。其它的氨肽酶如此类推。

有益效果：

本发明使用深孔板进行微型化培养，每个深孔相当于一个摇瓶，实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备。利用酶标板和酶标仪代替比色杯和分光光度计测定氨肽酶的酶活，只需几十秒就能完成酶标板各微孔中粗酶液的酶活测定。本发明筛选工作的效率高，速度快；培养和检测的微型化，消耗的培养基和试剂少；容易实现机械化自动化操作，借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量，提高筛选通量。

附图说明：

图1为氨肽酶及其高产菌的高通量筛选流程图。

图2是酶标板法的对硝基苯胺光吸收曲线。

图3是常规法的对硝基苯胺光吸收曲线。

图4是酶标板法测定酶活的对硝基苯胺标准曲线。

图5是常规法测定酶活的对硝基苯胺标准曲线。

图6是微型化发酵培养装液量对产酶的影响。

图7是微型化和摇瓶发酵培养氨肽酶产生菌的生物量对比。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行更为具体的说明，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1：

酶标板法和常规对硝基苯胺法最大吸收波长的比较。

配制400μmol/L的对硝基苯胺，分别用酶标板和酶标仪法、比色杯和紫外可见分光光度计，从280nm至480nm连续扫描。绘制对硝基苯胺的吸光度曲线，见图2和图3。由图2和图3可见酶标板法最大吸收峰与常规对硝基苯胺法一致，均在380nm左右，吸光度也一致。

实施例2：

甲硫氨酸氨肽酶酶活力的高通量测定。

在酶标板的微孔中加入40μL的氨-氯化铵缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)和20μL的甲硫氨酸对硝基苯胺底物溶液(6mmol/L)，然后加入20μL已适当稀释的待测粗酶液，空白对照以20μL的蒸馏水代替粗酶液。盖上盖子于60℃水浴反应10min，反应结束立即加入50％乙酸溶液120μL终止反应。以酶标仪优选380nm测定吸光度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算粗酶液的酶活。酶活定义：温度为60℃，每分钟水解甲硫氨酸对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量，定义为一个酶活单位(U)。

本实施例采用微量化梯度稀释法稀释粗酶液的具体步骤为：用移液器吸取0.1mL的粗酶液一一对应地移至装有0.9mL蒸馏水的微孔A中充分混匀，以移液器从微孔A吸取0.1mL，移至另一个装有0.9mL蒸馏水的微孔B中，如此逐级稀释至适当浓度。

标准曲线的绘制：准确称取对硝基苯胺标准品(sigma公司，N2128-50G)，用蒸馏水稀释到400μmol/L，再将其依次稀释到150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L和350μmol/L。取20μL上述各浓度的对硝基苯胺标准溶液加入到装有40μL氨-氯化铵缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)和20μL蒸馏水的酶标板中，以20μL的蒸馏水作空白对照。盖上盖子于60℃水浴反应10min，反应结束立即加入50％乙酸溶液120μL终止反应。以酶标仪于380nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对硝基苯胺浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图4。标准曲线的二元拟合方程为：y＝812.38x-45.618，R²＝0.999。

实施例3：

酶标板法和常规对硝基苯胺法酶活测定结果的比较。

配制浓度分别为150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L、350μmol/L和400μmol/L的对硝基苯胺标准溶液，以0含量为对照，在380nm波长处，分别用酶标板法和常规对硝基苯胺法测定对硝基苯胺的含量。以吸光度为横坐标，对硝基苯胺浓度为纵坐标，绘制标准曲线，两种方法的标准曲线如图4、图5。由图4、图5所示，酶标板法对硝基苯胺的标准曲线满足回归相关系数0.999以上的回归直线的两个端点所对应的对硝基苯胺浓度为20.720～55.252μg/mL，与常规方法一致。

分别从麦酱、臭豆腐和腐乳分离到三株甲硫氨酸氨肽酶产生菌：11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL。分别挑取菌种11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL、12-3-16-14AL斜面各一环接入种子培养基中，250ml三角瓶装液量25ml，于36℃摇床200rpm培养6h。按8％的接种量，接种发酵培养基，250ml三角瓶装液量25ml，于36℃摇床200rpm培养24h。将发酵液于4℃，10000×g离心10min，上清液即为粗酶液。上述三株菌的粗酶液分别用酶标板法和常规对硝基苯胺法测定酶活，每种粗酶液平行测定三次，取平均值，结果见表1。表1结果显示，酶标板法和常规法检测氨肽酶酶活的结果基本一致，酶标板法可以用于氨肽酶的高通量筛选。

实施例4：

将氨肽酶产生菌以48孔深孔板进行微型化培养，比较摇瓶和深孔板培养的发酵参数，以证实微型化培养方法的可行性。

(1)微型化培养的生长情况，微孔间的平行性以及是否发生深孔间的交叉污染。

在同一深孔板，全部微孔加入发酵培养基，灭菌后，间隔地接入氨肽酶产生菌的菌悬液，36℃摇床220rpm培养2h，观察微孔内菌的生长情况，测定深孔内发酵液的吸光度，结果见表2。接种的微孔内，菌的浓度与其在摇瓶中培养相近，深孔板微孔间的相对标准偏差(RSD)和摇瓶间的相对标准偏差(RSD)分别为3.36％、2.78％，RSD均＜5％，说明深孔间的平行性良好，与摇瓶的对应性也很好。微型化培养完全能满足氨肽酶产生菌的生长。对未接种的深孔内的培养基进行无菌检查，未见微生物生长，这表明微型化培养的深孔之间可以避免交叉污染，且三明治盖能满足通氧和过滤除菌的要求。微型化培养可代替传统摇瓶培养。

(2)微型化培养的装液量考察。

将培养6h的氨肽酶产生菌的种子液转接到48孔深孔板的发酵培养基中，单孔装液量分别为0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL和1.1mL，每个数据做三个平行，于36℃摇床220rpm培养24h，培养结束于4℃10000×g离心10min，上清液即为粗酶液。按照实施例2中所述酶标板法检测各个粗酶液的酶活，结果见图6。从图6可以看出，当装液量为0.6mL时，氨肽酶的发酵水平最高。

(3)微型化培养和摇瓶培养的生长曲线对比以及最适种龄的确定。

将氨肽酶产生菌分别接种到48孔深孔板和摇瓶的种子培养基中，容积4.6mL的深孔中装液量为0.6mL，250mL的摇瓶装液量为25mL，均于36℃摇床220rpm培养18h，每隔1h取样，测定发酵液的吸光度，以发酵液的吸光度代表发酵液中的菌浓，考察种子培养过程中菌体浓度随时间的变化情况，结果见图7。从图7可以看出，微型化培养的生长曲线与其在摇瓶中相近，均经2h培养进入对数期，培养7h达到平衡期。据此确定最适种龄为6h。

实施例5：从麦酱中高通量筛选氨肽酶产生菌。

对含菌样品——麦酱进行80℃水浴10min热处理。取1mL热处理样品接入富集培养基，于36℃摇床220rpm富集培养20h，对富集培养液进行适当的梯度稀释后涂布于营养琼脂平板上，36℃培养20h。无菌地挑取生长状态较好的单菌落，接入装有液体种子培养基的深孔板I中，于36℃摇床220rpm培养6h。将深孔板I中的种子液，按10％的接种量对应地转接入装有发酵培养基的深孔板II中，于36℃摇床220rpm培养24h。深孔板I中剩余的种子液加入等体积的50％甘油于-80℃冷冻保藏。将深孔板II于孔板离心机4℃，6000×g离心10min沉淀菌体，上清液即为粗酶液。用酶标板法进行高通量的氨肽酶酶活测定，结果表明当底物溶液为甲硫氨酸对硝基苯胺时氨肽酶酶活最高，因此确定所筛到的为甲硫氨酸氨肽酶产生菌。底物溶液为甲硫氨酸对硝基苯胺(Met-pNA)时的酶活测定结果见表3，共筛选得到14株甲硫氨酸氨肽酶(MetAP)生产菌，发酵酶活均在10U/mL以上，其中有两株发酵酶超过20U/mL，酶活最高的达21.21U/mL。根据测定结果，对-80℃超低温冰箱保存的深孔板的对应高产菌进行平板划线后，挑取单菌落进行摇瓶复筛。

本实施例所用的富集培养基(g/L)：麦芽糊精5，酵母粉5，蛋白胨5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.2，pH7.2，0.1MPa灭菌30min。

本实施例所用的液体种子培养基(g/L)：麦芽糊精8，酵母粉2，蛋白胨8，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.2，pH7.2，0.1MPa灭菌30min。

本实施例所用的液体发酵培养基(g/L)：麦芽糊精15，酵母粉10，蛋白胨5，牛肉膏2，磷酸二氢钾2.7，硫酸镁0.1，氯化钠1，pH7.5，0.1MPa灭菌30min。

本实施例所用的孔板为48孔深孔板，体积为4.6mL，单孔装液量为0.6mL。

本实施例所用的微量检测方法酶标板法，具体操作如下：

在酶标板的微孔中加入40μL的氨-氯化铵缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)和20μL的氨基酸对硝基苯胺底物溶液(6mmol/L)，然后加入20μL已适当稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作为空白对照。盖上盖子置60℃水浴反应10min，反应结束立即加入50％乙酸溶液120μL终止反应。以酶标仪于380nm测定吸光度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活。酶活定义：温度为60℃，每分钟水解氨基酸-对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需酶量，定义为一个酶活单位。

表1是酶标板法和常规法酶活测定的结果对比。

表2是微型化培养深孔间与摇瓶间的吸光度平行性对比。

表3是高通量筛选甲硫氨酸氨肽酶产生菌的酶活测定结果。

表1、酶标板法和常规法酶活测定的结果对比

菌株的粗酶液	酶标板法酶活(U/mL)	常规法酶活(U/mL)	相对标准偏差(％)
				11-11-16-2-5AL	42.71±1.15	40.92±0.72	2.1
11-10-18-7AL	48.11±1.34	46.82±1.32	1.3
				12-3-16-14AL	38.89±1.40	37.39±1.03	1.9

表2微型化培养深孔间与摇瓶间的吸光度(OD600)平行性对比

注：“-”代表未接种，且培养后未见微生物生长。表3、高通量筛选甲硫氨酸氨肽酶产生菌的酶活测定结果(U/mL)

	1	2	3	4	5	6
							A	10.09	-	12.45	-	9.04	1.23
B	6.89	12.34	11.90	4.32	8.33	3.45
							C	1.02	11.45	12.78	-	5.67	-
D	-	3.09	13.45	-	3.21	4.78
							E	18.45	12.46	18.76	-	1.09	2.34
F	14.56	13.65	3.45	5.12	3.56	14.56
							G	21.21	-	6.78	3.78	6.78	-
H	3.45	2.97	4.67	8.32	7.89	20.21

Claims

1.氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：

挑取氨肽酶产生菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，盖上深孔板的盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养4～10h；将深孔板I中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II中，于30～40℃、180～300rpm摇床培养16～48h；将深孔板II放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min；深孔板II的深孔中的上清液为粗酶液；以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释；用酶标板法测定粗酶液的酶活，在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，加入稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作空白对照，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束立即加入30～50%乙酸溶液终止反应；采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活；根据酶活测定结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得氨肽酶高产菌株。

2.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶产生菌的单菌落为自然界的含菌样品或突变株。

3.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述液体种子培养基为：麦芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、pH7.0、0.1MPa灭菌30min。

4.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述发酵培养基为：麦芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氢钾0.5～3.0g/L、硫酸镁0.05～0.5g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、pH6.5～7.5、0.1MPa灭菌30min。

5.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、HEPES缓冲液和氨-氯化铵缓冲液之中的一种。所述缓冲液的pH为6.5～8.5；缓冲液浓度为0.02～0.2mol/L。

6.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物是氨基酸对硝基苯胺。

7.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨基酸对硝基苯胺为丙氨酸对硝基苯胺、精氨酸对硝基苯胺、天冬酰胺对硝基苯胺、天冬氨酸对硝基苯胺、半胱氨酸对硝基苯胺、谷氨酰胺对硝基苯胺、谷氨酸对硝基苯胺、组氨酸对硝基苯胺、异亮氨酸对硝基苯胺、甘氨酸对硝基苯胺、亮氨酸对硝基苯胺、赖氨酸对硝基苯胺、甲硫氨酸对硝基苯胺、苯丙氨酸对硝基苯胺、脯氨酸对硝基苯胺、丝氨酸对硝基苯胺、苏氨酸对硝基苯胺、色氨酸对硝基苯胺、酪氨酸对硝基苯胺或缬氨酸对硝基苯胺。

8.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述荧光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素为下列化合物之一：丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、丝氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苏氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。

9.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物溶液浓度为2～20μmol/L，荧光底物溶液浓度2～20nmol/L；显色底物用于酶活测定比色的波长为360～450nm；荧光底物用于酶活测定的激发光波长为340～400nm，发射光波长为420～480nm。

10.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶种类的判断方法如下：若底物为亮氨酸对硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物为甲硫氨酸对硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此类推。