CN109142551A - 一种淬灭酶产业化生产中酶活力的快速精确检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型饲用酶制剂产业化的检测方法,即淬灭酶酶活的HPLC检测方法。本发明提供的用于检测淬灭酶酶活的HPLC方法,其流动相选择乙腈和三乙胺水溶液;所述方法还包括,在HPLC检测前,还对淬灭酶样品进行了抽提和稀释,所述抽提的提取液和稀释液为含有曲拉通或牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。实验证明,本发明提供的淬灭酶酶活的HPLC检测方法重复性和时效性好,准确性高。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂技术领域,具体涉及一种新型酶制剂产业化的检测方法,即淬灭酶生产中酶活力的快速精确检测方法。
背景技术
N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是许多革兰氏阴性菌群体感应系统中的信号分子,能够调节许多动植物病原菌致病菌基因的表达。研究发现AHLs的降解对细菌群体的生长并没有影响,但是能够抑制群体间的信号传递,从而使依靠群体感应来调节致病基因表达的病原菌毒性降低甚至丧失。这个发现为生物农药和疾病治疗提供了新的方法和思路。N-酰基高丝氨酸内酯酶可以水解AHLs的内酯键,使信号分子失去活性,从而降低病原菌产生的危害。因此对N-酰基高丝氨酸内酯酶的研究成为当前农业和医药领域的研究热点。
北京挑战生物技术有限公司和中国农业科学院饲料研究所历经5年联合研发,获得了国际领先高科技生物新产品-水产专用淬灭酶,其起效成分是N-酰基高丝氨酸内酯酶。作为国内唯一一家将N-酰基高丝氨酸内酯酶产业化的企业,多年来在淬灭酶的酶学特性分析、改进以及应用方面开展了大量的研究和推广工作。研究中包含淬灭酶产业化检测方法的建立。目前,已报道的淬灭酶检测方法主要有液相色谱法和生物传感器法两种,这两种方法都是通过测定酶的作用底物N-酰基高丝氨酸内酯(以下简称AHLs)的减少量来定义酶活力的大小。
生物传感器法是目前应用最广泛的淬灭酶定性检测方法,其主要原理是采用AHLs结构基因缺失菌株作为指示菌株,该菌株自身不能合成AHLs。在外源AHLs的作用下,它们能够发光、变色或者表达β-半乳糖苷酶活性,因而具有检测AHLs的功能。然后根据指示菌发光强弱或颜色变化距离来测定反应液中AHLs的残留量,通过计算可以得出AHLs的消耗量,进而计算出淬灭酶的酶活。利用细菌生物传感器法是检测AHLs的有效手段,该方法简单、易得、不需要昂贵的设备。基于A.tumefaciens和C.violaceum的细菌生物感应器是最常用的两种生物感应器。但是,由于该方法受操作人员和环境的影响较大,其定量的准确性和重复性较差。在实际应用过程中,该方法多用于AHLs产生菌株和淬灭酶表达菌株的筛选。此外,该生物法检测周期在24h以上,而在生产过程中需要快速检测酶活以便于指导发酵过程的控制以及半成品、成品的加工。因此,基于生物传感法所存在的检测精度低、可重复性差、时效性差的特点,该方法是满足不了产业化检测需求的。
液相色谱法是利用AHLs在201nm下具有强吸收,以峰面积和标准底物浓度建立标准曲线,根据反应液中底物的峰面积值计算出反应液中AHLs的残留量,通过计算得出AHLs的消耗量和淬灭酶的酶活。与生物传感器检测法相比,液相色谱法受人员操作和环境的影响小,检测时长短,适合生产过程中AHLs的定量检测。但目前采用该方法测量的精确度和重现性较差,还不能用于淬灭酶的精确测量。
综上,通过对已报道的酶活检测方法进行的测试和分析,发现已有的淬灭酶检测方法存在测量精度低、重现性差、测量周期长等缺点,难以满足淬灭酶产业化过程中的检测需求。
发明内容
本发明通过对目前液相色谱检测方法的深入研究和反复试验摸索,发现了现有的HPLC酶活检测方法精确度和重现性差的主要原因:1、缺乏酶的前处理工艺,现有的检测方法中多是直接将酶液和底物混合后,在一定的温度下反应一段时间,然后直接测量底物的减少量,这其中未考虑不同的提取溶液、稀释溶液对于酶的活力的影响,导致了测量结果的不准确;2、缺乏对于底物的认识,没有评价酶反应过程和测量过程中底物本身的降解情况,未考察底物稳定的最适条件,底物自身的降解对酶活的测定会产生很大的影响,造成检测结果的准确性和重复性差。3、现有检测方法以甲醇作为流动相,甲醇在底物的检测波长处具有吸收,影响了底物测量的准确性。
基于这些重要发现,本发明对淬灭酶的提取过程进行了细致的研究,开发出了适合淬灭酶检测的特有的抽提溶液和稀释液,最大程度的降低了酶在抽提和测量过程中的损失。此外,本发明进一步明确了底物的最适pH,降低了底物的自然降解,增加了检测的准确性。最后,本发明对流动相的组成和色谱条件进行了优化,开发出了乙腈:三乙胺水溶液的流动相检测方法,相比已报道的甲醇流动相的检测方法,在AHLs的检测上具有很高的精度,重现性好。
按照本发明建立的方法进行测量,每个样品的测量周期仅为1h,能够及时测量发酵过程中发酵液的酶活变化,为发酵调控提供有效指导。快速检测缩短了淬灭酶半成品加工的等待周期,提高了工作效率。此外,该本发明方法的建立,大大提升了淬灭酶检测的准确性,其良好的重现性也保证了生产的稳定性。综上,本发明所建立的淬灭酶产业化检测方法为淬灭酶的产业化生产提供了有力的支持,保证了淬灭酶的产业化推广。
本发明的一个目的是提供一种淬灭酶酶活的HPLC检测方法,所述方法包括:所述HPLC的流动相包括乙腈和三乙胺水溶液。
具体的,所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量为0.01%-0.05%;所述乙腈和三乙胺水溶液的体积比为(0.36-0.40):(0.64-0.60);和/或,所述三乙胺水溶液的pH值为7.0-7.5。
具体的,所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量为0.03%;所述三乙胺水溶液的pH值为7.3;所述乙腈和三乙胺水溶液的体积比为0.36:0.64。
具体的,所述方法还包括,在HPLC检测前:对淬灭酶样品进行抽提,所述抽提的提取液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白;对淬灭酶样品进行稀释,所述稀释的稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白;和/或,制备反应液,所述反应液包括底物溶液、淬灭酶样品稀释液,所述底物溶液中的溶液为pH值为6-7的缓冲液。
具体的,所述底物溶液中的底物为N-酰基高丝氨酸内酯;具体的,所述底物溶液中的溶液为pH值为6.5的缓冲液;具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾;所述缓冲液的浓度为0.01moL/L;
所述反应液的反应条件为30℃水浴保温30min;所述反应液反应完成后,还需加入SDS溶液终止反应。
具体的,所述抽提包括,将淬灭酶样品与所述提取液混合后,25℃震荡30min。
再具体的,所述震荡为200转/分钟。
具体的,所述抽提后,还需8000r/min离心5min,取上清液;所述上清液可进行下一步的稀释。
具体的,所述提取液、和/或稀释液还包括缓冲液。
具体的,所述曲拉通的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;
所述牛血清白蛋白的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;
和/或,所述抽提液中缓冲液的pH具体为7.5,所述稀释液中缓冲液的pH具体为6.5。
具体的,所述缓冲液的浓度为0.01moL/L;再具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾。
具体的,所述稀释后,在50μg/mL底物浓度的情况下,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.2U/mL~5U/mL;再具体的,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.6~4U/mL。
具体的,所述曲拉通具体为曲拉通X-100。
具体的,所述HPLC检测时,HPLC的流速设定为1ml/min;所述HPLC的柱温箱温度设定为30℃;和/或,所述HPLC所用的色谱柱为C18反相柱,4.6×250mm。
本发明的另一个目的是提供一种用于HPLC检测淬灭酶酶活的流动相溶液,所述流动相溶液包括:乙腈和三乙胺水溶液。
具体的,所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量为0.01%-0.05%;
具体的,所述乙腈和三乙胺水溶液的体积比为(0.36-0.40):(0.64-0.60);
和/或,所述三乙胺水溶液的pH值为7.0-7.5。
再具体的,所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量为0.03%;所述三乙胺水溶液的pH值为7.3;所述乙腈和三乙胺水溶液的体积比为0.36:0.64。
本发明的还一个目的是提供一种淬灭酶酶活的检测方法,所述方法包括,在检测前,需对淬灭酶样品进行抽提,所述抽提的提取液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
具体的,所述提取液还包括缓冲液。
具体的,所述曲拉通的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;所述牛血清白蛋白的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;和/或,所述缓冲液具体为pH为7.5的缓冲液。
具体的,所述缓冲液的浓度为0.01moL/L;再具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾。
具体的,所述抽提包括,将淬灭酶样品与所述提取液混合后,25℃震荡30min。
具体的,所述震荡为200转/分钟。
具体的,所述抽提后,还需8000r/min离心5min,取上清液;所述上清液可进行下一步的稀释。
具体的,所述检测为HPLC检测。
本发明的还一个目的是提供一种淬灭酶酶活的检测方法,所述方法包括,在检测前,需对淬灭酶样品进行稀释,所述稀释的稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
具体的,所述稀释液还包括缓冲液。
具体的,所述曲拉通的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;所述牛血清白蛋白的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;和/或,所述缓冲液具体为pH为6.5的缓冲液。
具体的,所述缓冲液的浓度为0.01moL/L;再具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾。
具体的,所述稀释后,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.2U/mL~5U/mL;再具体的,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.6~4U/mL。
具体的,所述检测为HPLC检测。
本发明的还一个目的是提供一种用于淬灭酶酶活检测的淬灭酶样品抽提液和/或稀释液,所述抽提液和/或稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
具体的,所述检测为HPLC检测。
具体的,所述抽提液和/或稀释液还包括缓冲液。
具体的,所述曲拉通的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;所述牛血清白蛋白的质量体积百分含量为0.03%-0.2%;和/或,所述抽提液中缓冲液的pH具体为7.5,所述稀释液中缓冲液的pH具体为6.5。
具体的,所述缓冲液的浓度为0.01moL/L;再具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾。
具体的,加入所述稀释液后,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.2U/mL~5U/mL;再具体的,淬灭酶样品稀释液中酶量控制在1.6~4U/mL。
具体的,所述曲拉通具体为曲拉通X-100。
本发明的再一个目的是提供一种用于淬灭酶酶活检测的底物溶液,所述底物溶液包括:N-酰基高丝氨酸内酯和pH值为6-7的缓冲液。
具体的,所述缓冲液的pH值为6.5;具体的,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;所述磷酸盐具体为磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾;所述缓冲液的浓度为0.01moL/L。
本发明的最后一个目的是提供上述所述任一方法在淬灭酶酶活检测中的应用;所述流动相溶液,和/或所述淬灭酶样品抽提液和/或稀释液、底物溶液,在淬灭酶酶活检测中的应用,和/或在制备淬灭酶酶活检测产品中的应用。
具体的,所述淬灭酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶。
具体的,所述产品包括淬灭酶酶活检测试剂盒。
综上所述,本发明建立了一种适合淬灭酶产业化检测方法,该方法具有检测精度高、重现性好、成本低、速度快等优点,适合于产业化检测应用。相比于目前应用最为广泛的生物传感器法,本发明具有检测周期短、重复性好、测量准确、测量范围广的特点。
附图说明
图1为不同比例的乙腈-三乙胺水溶液的HPLC图谱;
其中,1表示40%乙睛-三乙胺水溶液;2表示38%乙腈-三乙胺水溶液;3表示36%乙腈-三乙胺水溶液;其中,40%、38%、36%为所述溶液中乙腈的体积百分含量。
图2为采用36%乙腈-三乙胺水溶液方案所绘制的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所用试剂,除特殊说明外,均指色谱纯试剂;水均为符合GB/T 6682中规定的蒸馏水或去离子水。
下述实施例中试剂与溶液的配制:
浓度为0.1moL/L磷酸氢二钠溶液的配制:
称取无水Na2HPO4(M=142)1.42g,溶解于蒸馏水中,定容至100mL。
浓度为0.1moL/L磷酸二氢钾溶液的配制:
称取无水KH2PO4(M=136.1)1.361g,溶解于蒸馏水中,定容至100mL。
磷酸盐缓冲液(1)即酶提取液(浓度为0.01moL/L,pH为7.5,含0.05%的牛血清白蛋白BSA)的配制:
称取无水Na2HPO4 1.06g、无水KH2PO4 0.34g,0.5g BSA溶解于蒸馏水中,以上述所配制的浓度为0.1moL/L(调节pH之前,将其浓度稀释到0.01moL/L)的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钾溶液调节pH至7.5,定容至1000mL。配置完毕后4℃放置,有效期为15d。
磷酸盐缓冲液(2)即酶稀释液(浓度为0.01moL/L,pH为6.5,含0.05%的曲拉通X-100)的配制:
称取无水Na2HPO4 0.355g、无水KH2PO4 1.021g,0.5g曲拉通X-100溶解于蒸馏水中,以上述所配制的浓度为0.1moL/L(调节pH之前,将其浓度稀释到0.01moL/L)的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钾溶液调节pH至6.5,定容至1000mL。配置完毕后4℃放置,有效期为15d。
实施例1、酶提取液和稀释液的选择
(一)酶提取液的选择
本实施例采用了四种抽提液对淬灭酶的酶活进行了比较,确定酶的活性的释放。
本实施例所选用抽提液为pH值7.5的浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(以下简称PB)、PB+0.05%曲拉通X-100、PB+0.05%BSA、PB+0.05%曲拉通X100+0.05%BSA。
不同抽提液中酶活性差异如表1所示,从表1中可以看出PB+0.05%BSA、PB+0.05%曲拉通X100+0.05%BSA的组合所抽提的酶液具有较大酶活,相比于其它组合酶的释放相率更高,选择成本较低的PB+0.05%BSA组合即上述配制的磷酸盐缓冲液(1)作为后续检测中的抽提溶液使用。
表1
(二)酶稀释液的选择
本实施例采用了四种稀释液对抽提后的酶液进行稀释,在保证酶活力的同时,稳定剂的加入不影响测量的准确性。所选用稀释液为pH值6.5的浓度为0.01mol/L的PB,PB+0.05%曲拉通X-100,PB+0.05%BSA,PB+0.05%曲拉通X100+0.05%BSA。
不同稀释液中淬灭酶酶活差异如表2所示。从表2中可以看出未加入保护剂的PB溶液,稀释造成了酶的大量损耗。用加入BSA或曲拉通的PB溶液进行样品稀释,大幅的降低了酶活力的损失。由于加入BSA的PB溶液在底物测量波长前具有强稀释,会干扰底物定量。因此,后续检测选择PB+0.05%曲拉通即上述配制的磷酸盐缓冲液(2)作为酶的稀释液使用。
表2
此外,本实施例通过将抽提液或酶稀释液中的曲拉通或BSA的浓度调节到0.03%、0.1%、0.2%进行检测,发现,该浓度均对淬灭酶的酶活检测没有影响。
实施例2、底物最适pH值的选择
用上述配制的0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液配置不同pH的PB溶液,配置浓度为0.01mol/L,用于溶解底物,检测底物在不同pH值分别为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0条件下的水解情况。检测结果见表3。从表3中可以看出随着pH值的增加,底物的稳定性逐步降低,在pH值8.0的情况下底物的4h的水解值已经达到了4.2μg/mL,相当于酶反应底物消耗值的20%以上,已经不能满足检测的要求。底物在pH值6.5的情况下最为稳定,结合淬灭酶在不同pH值条件下的酶活力,选择pH6.5的,0.01mol/L的磷酸缓冲液溶液作为淬灭酶反应的缓冲液。
表3
实施例3、流动相的选择
(一)不同比例的乙腈-三乙胺水溶液的配制
水相三乙胺水溶液的配制:
将0.3mL的三乙胺加入到800mL蒸馏水中,混匀,用磷酸将pH调整到7.3,蒸馏水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤,超声脱气10min,作为水相。配置完毕后,常温放置,有效期7d。
有机相乙腈的配制:
将色谱纯的乙腈过0.22μm的有机膜,超声脱气10min,作为有机相。配置完毕后,常温放置,有效期30d。
使用时根据要求,设置流动相中乙腈和三乙胺水溶液的比例。
(二)不同比例的乙腈—三乙胺水溶液的HPLC图谱
不同比例的乙腈—三乙胺水溶液的HPLC图谱见图1。从图1中可以看出,36%~40%的乙腈水溶液底物所出峰型都较好。但当38%和40%的乙腈水溶液目标峰和杂质峰的分离相对于36%的乙腈水溶液稍差,但不影响检测结果,考虑到检测时长,本研究选择36%的乙腈-0.03%三乙胺水溶液作为底物检测的流动相。所述百分数为乙腈的体积百分含量。
实施例4、淬灭酶的HPLC检测
(一)方法原理
淬灭酶能够将N-酰基高丝氨酸内酯(下文简称底物)的内酯键断裂生成N-酰基高丝氨酸,底物的减少量与反应液中淬灭酶的活力成正比。因此,通过HPLC测定底物的减少量可以计算反应液中的淬灭酶的活力。基本反应如下:
(二)淬灭酶活力单位的定义
在30℃,pH6.5条件下,底物浓度为50μg/mL时、每分钟水解1nmoL底物所需要的酶量,定义为一个酶活单位。
(三)试剂与溶液
浓度为1mg/mL的辛酰高丝氨酸内酯[3-oxo-C8-HSL]底物溶液的配制:
取10mg 3-oxo-C8-HSL溶于无水乙醇,定容至10mL,配置完毕后-20℃放置,有效期为3个月。
浓度为100g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的配制:
将约10g SDS(M=288.38)溶液到约80mL蒸馏水中,加热溶解,定容至100mL。配置完毕后常温放置,有效期3个月。
(四)仪器与设备
分析天平:感量0.001g。
pH计:精确至0.01。
恒温振荡器。
电磁振荡器或漩涡混合仪。
离心机:8000r/min以上。
恒温水浴锅:温度控制范围在20~60℃之间,精度为0.1℃。
秒表:每小时误差不超过5s。
移液器:精度为1μL。
高效液相色谱:色谱柱规格为C18,4.6×250mm。
超声波清洗机
(五)标准曲线的绘制
标准品准备
吸取400μL上述配制的1mg/mL底物溶液,加入1.6mL的上述配制的浓度为0.01moL/L,pH为6.5,含0.05%的曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液(2),稀释了5倍。分别吸取稀释后底物50μL、100μL、150μL、200μL、250μL,加入到1.5mL的离心管中,再向各离心管中加入100μL上述配制的浓度为100g/L的SDS溶液,然后依次加入350μL、300μL、250μL、200μL、150μL的上述配制的磷酸盐缓冲液(2),定容至500μL,用旋涡混合仪震荡混匀,移取450μL至自动进样瓶中。
标准曲线的绘制
色谱条件:流动相中水相与有机相(所述水相和有机相分别为实施例3所配制的三乙胺水溶液和乙腈)比例设置为0.64:0.36,流速为1mL/min,柱温30℃,检测波长为201nm,进样量为20μL,所有检测的样品在上样前都用0.22μm膜过滤。
以底物浓度为X轴、峰面积为Y轴,绘制标准曲线,所绘制的标准曲线如图2和表4所示。每次新配置底物溶液或更换色谱柱时需要重新绘制标准曲线。
表4
底物浓度(μg/ml) | 峰面积 |
20 | 519255 |
40 | 1061416 |
60 | 1613918 |
80 | 2128693 |
100 | 2649888 |
(六)反应用酶液的制备
固体样品的反应用酶液制备:
抽提:样品酶活力与建议称样量对应关系见表5,参照表5中建议称样量称取试样两份,精确至0.001g,置于200mL三角瓶中,加入约50mL上述配制的浓度为0.01moL/L,pH为7.5,含0.05%的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(1),25℃恒温(200转/分钟)震荡30min,移至100mL容量瓶中,用上述磷酸盐缓冲液(1)定容至100mL,并摇匀,取适量的抽提液,8000r/min离心5min,然后取上清液用上述磷酸盐缓冲液(2)进行适当稀释。
表5
淬灭酶活性/(U/g)(或者mL) | 称样量/g(或者mL) |
≧10000 | 0.2~0.5 |
5000~10000 | 0.5~1.0 |
1000~5000 | 1.0~2.0 |
400~1000 | 2.0~5.0 |
反应用酶液稀释倍数的选择:
对酶活为11000U/g的淬灭酶样品按照上述方法进行抽提,取抽提后的酶液用稀释液即上述磷酸盐缓冲液(2)分别稀释到1000倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍、6000倍、8000倍后,检测不同稀释倍数下的淬灭酶酶活性,即按照上述标准曲线的绘制中所述的色谱条件进行底物浓度的测定,最后换算为淬灭酶酶活性,检测结果见表6。
从表6中可以看出当稀释倍数在2000倍到8000倍之间时,检测酶活的标准偏差为127U/mL,变异系数仅为1.16,说明在50μg/mL底物浓度的情况下,淬灭酶样品的酶活稀释到1.2U/mL~5U/mL时,淬灭酶的检测具有很好的准确性和可加性。
表6
液体样品的反应用酶液制备:
液体样品可以直接用上述磷酸盐缓冲液(2)进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH偏离6.5,可以用上述配制的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钾溶液调节pH至6.5,然后再用磷酸盐缓冲液(2)进行适当稀释、定容。
上述固体和液体样品的反应用酶液稀释后,待测酶液中淬灭酶活力控制在1.6U/mL~4U/mL之间。
(七)测定步骤
吸取1.25mL的上述磷酸盐缓冲液(2),置于10mL离心管中,加入150μL底物溶液,混匀,制成底物和磷酸盐混合液,30℃水浴保温5min。
吸取5mL经过适当稀释的酶液,30℃水浴保温5min。
吸取800μL经过适当稀释的酶液(已经过30℃保温),加入到5mL离心管中,再加入900μL的底物和磷酸盐的混合液(已经过30℃保温),涡旋震荡3S,制成反应液。然后向四个1.5mL的离心管中分别加入400μL反应液,从中选取一只作为对照样,加入100μL上述配制的SDS溶液,涡旋震荡3S。30℃水浴保温30min,向三只样品管中分别加入100μL SDS溶液终止反应后,按照上述标准曲线的绘制中所述的色谱条件进行底物浓度的测定。
(八)酶活力计算和表示
试样中淬灭酶的活性以X表示,单位为酶活性单位每克(U/g)或酶活性单位每毫升(U/mL),按公式(1)和公式(2)进行计算:
公式中:
XD:酶稀释液中淬灭酶的活力,单位为U/mL;
ΔC:底物的浓度变化,单位为μg/mL;
0.5:反应液的体积,单位为mL;
M:底物的摩尔质量,M(3-oxo-C8-HSL)=241.8g/moL;
t:酶的反应时间,单位为分钟(min);
1.7:分装前混合液的体积,单位为mL;
0.8:分装前加入的稀释酶液体积,单位为mL;
0.4:为分装体积,单位为mL;
1000:为转化因子。
XD值应在1.6U/mL~4U/mL之间,如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。
X=XD×Df····················(2)
公式中:
X:淬灭酶的酶活力,单位为U/g(或U/mL);
Df:样品的稀释倍数;
两份平行试样的测定结果用算术平均值表示,酶制剂样品结果保留整数。
(九)注意事项
称量要精确,并且确定酶样恰当的稀释倍数,酶量应控制在1.6~4U/mL之间;
底物在常温下分解,为了保证测量的准确性,每次同时测量的样品数不超过3个,总测量时间不超过4h;当同时反应样品较多,预计超过4h时,将酶反应后待测样品放置在4℃冰箱中,进样前再取出进行测量,但不要超过6h。
实施例5、测量结果的可重现性
取一份固体酶制剂样品,按照上述实施例4所述抽提方法连续抽提7次,并按照上述实施例4所述方法进行HPLC测量,测量结果见表7。
从表7测量结果可以看出不同次提取的同一个样品的酶活测量值很接近,变异系数仅为1.98,说明本发明方法在淬灭酶活力测定中的重复性很好。结合上述表6结果,可证明本发明提供的测量方法准确性、稳定性均很好。
表7
实施例6、不同流动相时本发明测量方法的准确性
(一)将酶活为11000U/mL的淬灭酶样品稀释2000倍,抽提液采用上述配制的磷酸盐缓冲液(1),稀释液为上述配制的磷酸盐缓冲液(2),流动相采用pH值为7.0的40%的乙腈-0.01%的三乙胺水溶液作为流动相进行测量,测量样品酶活为10920U/mL。
(二)将酶活为11000U/mL的淬灭酶样品稀释4000倍,抽提液采用上述配制的磷酸盐缓冲液(1),稀释液为上述配制的磷酸盐缓冲液(2),流动相采用pH值为7.5的38%的乙腈-0.05%的三乙胺水溶液作为流动相进行测量,测量样品酶活为11089U/mL。
上述(一)、(二)实验结果表明,采用上述流动相的条件下,也可实现淬灭酶样品中酶活的检测,检测的准确性好。
Claims (10)
1.一种淬灭酶酶活的HPLC检测方法,其特征在于,所述方法包括:所述HPLC的流动相包括乙腈和三乙胺水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量为0.01%-0.05%;
所述乙腈和三乙胺水溶液的体积比为(0.36-0.40):(0.64-0.60);
和/或,所述三乙胺水溶液的pH值为7.0-7.5。
3.根据权利要求1和/或2所述的方法,其特征在于,所述方法还包括,在HPLC检测前:
对淬灭酶样品进行抽提,所述抽提的提取液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白;
对淬灭酶样品进行稀释,所述稀释的稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白;
和/或,制备反应液,所述反应液包括底物溶液、淬灭酶样品稀释液,所述底物溶液中的溶液为pH值为6-7的缓冲液。
4.一种用于HPLC检测淬灭酶酶活的流动相溶液,其特征在于,所述流动相溶液包括:乙腈和三乙胺水溶液。
5.一种淬灭酶酶活的检测方法,其特征在于,所述方法包括,在检测前,需对淬灭酶样品进行抽提,所述抽提的提取液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述抽提包括,将淬灭酶样品与所述提取液混合后,25℃震荡30min。
7.一种淬灭酶酶活的检测方法,其特征在于,所述方法包括,在检测前,需对淬灭酶样品进行稀释,所述稀释的稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
8.一种用于淬灭酶酶活检测的淬灭酶样品抽提液和/或稀释液,其特征在于,所述抽提液和/或稀释液中包括:曲拉通和/或牛血清白蛋白。
9.一种用于淬灭酶酶活检测的底物溶液,其特征在于,所述底物溶液包括:N-酰基高丝氨酸内酯和pH值为6-7的缓冲液。
10.权利要求1-3、和/或权利要求5-7任一所述方法在淬灭酶酶活检测中的应用;
权利要求4所述流动相溶液、权利要求8所述淬灭酶样品抽提液和/或稀释液、和/或权利要求9所述的底物溶液,在淬灭酶酶活检测中的应用,和/或在制备淬灭酶酶活检测产品中的应用。
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