CN104535511A

CN104535511A - 基于单酶反应的l-谷氨酰胺的比色测定方法以及测定试剂盒

Info

Publication number: CN104535511A
Application number: CN201410775824.6A
Authority: CN
Inventors: 陶淑芳
Original assignee: 陶淑芳
Current assignee: HANGZHOU MINGCHUAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-04-22

Abstract

基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法以及测定试剂盒，涉及生物检测技术领域，旨在解决现有测定方法存在的测定欠准确、测定成本高的问题。该方法包括：将已知不同浓度的L-谷氨酰胺标准品分别与indigoidine合成酶、ATP、可溶性镁盐溶液以及缓冲液在10-40℃温度下反应，并在600纳米下测定反应1-40分钟后溶液的吸光度值，绘制L-谷氨酰胺浓度与吸光度的标准曲线；测定待测样品同样条件下的吸光度值；测算L-谷氨酰胺的含量。该试剂盒包括indigoidine合成酶、浓度为0.1-10毫摩尔/升的ATP、浓度为0.1-10 毫摩尔/升的可溶性镁盐溶液以及pH值为7-11的缓冲液。该方法快速准确。

Description

基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法以及测定试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法以及基于该方法的测定试剂盒。

背景技术

L-谷氨酰胺是膳食中一种天然氨基酸，它在氨基酸代谢和生物合成中扮演着一个必不可少的角色，同时这个氨基酸也参与到其他许多的代谢途径。L-谷氨酰胺不仅是二十种蛋白氨基酸的一员，也是重要的能量来源以及体内的氨基供体。谷氨酰胺可以直接穿过血-脑屏障，它不仅在血液中循环，也能在骨骼肌中储存，而缺乏L-谷氨酰胺会引起一系列疾病。因此，测量L-谷氨酰胺在人体内的浓度可以作为一些疾病检测的依据。快速而准确的L-谷氨酰胺测定方法将大大促进对疾病的检测。另外，L-谷氨酰胺也是细胞培养中重要的营养物质和代谢物，测量它的浓度可以用来理解细胞代谢和优化细胞培养过程。

现有的L-谷氨酰胺测定方法都是基于两个酶的体系，例如，在一个紫外吸收光谱的方法中，L-谷氨酰胺先由一个谷氨酰胺酶转化成谷氨酸，而后再由谷氨酸脱氢酶和NAD催化脱氢形成α-酮戊二酸、铵离子、以及NADH。NADH的形成可以通过其在340纳米处的吸收值测量出来，从而推算出L-谷氨酰胺的浓度。但是，很多其他的化合物在340纳米下也有吸收，如果这些化合物存在于样品中，将影响整个测量的准确度。

双酶测定方法主要有以下几点不足：一是需要两个酶的参与；二是测定结果会受样品中其他杂质的干扰；三是反应中使用的酶越多，反应体系所需要的成分以及缓冲液也就越多，这不仅增加成本，也提高了测定的误差。现有的双酶测定方法还要求所有的底物必须完全被转化成谷氨酸，而谷氨酸也要在第二步反应中百分之百被脱氢。因此反应时间较长。此外，如果一个样品里已经含有谷氨酸，它的含量需要被预先测定，并从左旋谷氨酰胺最后的测定浓度中去除。

发明内容

针对上述背景技术中提到的现有的L-谷氨酰胺测定方法所存在的测定欠准确、测定成本高的技术问题，本发明的目的在于提供一种可快速准确地测定出L-谷氨酰胺含量的方法，且该方法成本较低。

为实现上述目的，本发明首先提供了这样一种基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)建立标准曲线：将已知不同浓度的L-谷氨酰胺标准品分别与indigoidine合成酶、ATP、可溶性镁盐溶液以及缓冲液混合反应，反应温度为10-40℃，并在600纳米下测定反应特定时间后溶液的吸光度值，然后根据L-谷氨酰胺的浓度与对应的吸光度值绘制标准曲线；

(2)将待测样品在与步骤(1)相同的反应环境和反应条件下反应相同的时间，并测定反应后的溶液在600纳米下的吸光度值；

(3)根据步骤(1)所绘制的标准曲线以及步骤(2)测得的吸光度值测算出L-谷氨酰胺的含量；

所述ATP的浓度为0.1-10毫摩尔/升，所述可溶性镁盐溶液的浓度为0.1-10毫摩尔/升，所述缓冲液的pH值为7-11，所述特定时间为1-40分钟；在参与反应之前，须使用磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶对所述indigoidine合成酶的巯基化结构域进行活化。

Indigoidine合成酶是一种非核糖体多肽合成酶，可用来合成Indigoidine。目前已经有几个报道的Indigoidine合成酶，比如IndC(Erwinia chrysanthemi)、BpsA(Streptomyces lavendulae和Streptomycesaureofaciens)和Sc-IndC(Streptomyces chromofuscus)。这些Indigoidine合成酶的氨基酸序列很相近，基本构造是一样的，都含有C(缩合)-A(腺苷酰化)-Ox(氧化)-T(巯基化)这四个结构域。Indigoidine是一种来自细菌的天然蓝色素。Indigoidine合成酶可以利用两个分子的L-谷氨酰胺合成indigoidine。其反应过程如下：

本发明首次利用该反应来测量L-谷氨酰胺的含量。虽然反应产物indigoidine与L-谷氨酰胺的摩尔比是1：2，但因为反应产物indigoidine的不稳定性，反应时间过长，该化合物可能降解，因此无法利用完全反应后产生的蓝色素的量来准确计算出L-谷氨酰胺的量。本发明通过对该反应酶动力学的研究发现，该反应在初始阶段的0-40分钟之内，反应速度较快，反应速率保持一个较为稳定的状态。基于该稳定的初始反应速率，本发明通过测定反应初始阶段合成的产物的吸光度以及标准曲线来推算出L-谷氨酰胺的含量。

Indigoidine合成酶特指能够合成indigoidine的非核糖体多肽合成酶。编码该酶的基因可以直接从一个相关的微生物菌株的基因组、cDNA或化学合成的基因进行扩增，该基因可被修改以改进活性或表达。

Indigoidine合成酶可以在大肠杆菌，链霉菌，或其它微生物宿主中表达。任何适当的微生物菌株，载体或培养条件都可用于生产indigoidine合成酶。

当然，indigoidine合成酶还可以被改造，从而包含某些标记用于蛋白纯化，如C末端和/或N末端的组氨酸标签等。这种工程酶可以通过色谱方法，如亲和凝胶过滤色谱方法中的任何或组合进行纯化。

Indigoidine合成酶如果不经过活化是没有催化效果的，更具体地说，是它的巯基化(thiolation，T)结构域需要事先活化。活化过程可以在菌株体内进行，也可通过体外反应进行，无论体内或体外，都需要一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)将辅酶A上的4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移到巯基化结构域保守的丝氨酸残基上，使之活化。

优选地，所述indigoidine合成酶为IndC、BpsA，Sc-IndC,或者其他具有同样合成indigoidine功能的酶。所述IndC具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述BpsA具有如SEQ ID NO.2或者如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述Sc-IndC具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

优选地，所述特定时间为20-30分钟。

优选地，所述反应温度为20-30℃。

另外，本发明还提供了一种基于单酶反应的L-谷氨酰胺测定试剂盒，其特征在于包含以下组分：indigoidine合成酶、浓度为0.1-10毫摩尔/升的ATP、浓度为0.1-10毫摩尔/升的可溶性镁盐溶液以及pH值为7-11的缓冲液。

优选地，所述indigoidine合成酶为具有合成indigoidine功能的酶，例如IndC、BpsA或者Sc-IndC。所述IndC具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述BpsA具有如SEQ ID NO.2或者如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述Sc-IndC具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

优选地，所述试剂盒的反应温度为10-40℃。

更优选地，所述试剂盒的反应温度为20-30℃。

有益效果：

与现有技术相比，本发明提供了一种L-谷氨酰胺的单酶检测方法，这在国际上尚属首例。该方法使用单一indigoidine合成酶将L-谷氨酰胺迅速地转化为可以准确定量的蓝色化合物，并通过对该蓝色化合物在初始的一段时间内的合成速度的测定来计算出L-谷氨酰胺的含量，具有成本低、时间短(仅需10-40分钟)和精确度高(易于测定，不受杂质干扰)的特点。

附图说明

图1是本发明实施例反应得到的indigoidine的紫外吸收光谱；

图2是本发明实施例中对BpsA与L-谷氨酰胺反应产物吸光度值与时间关系的测定，图中的纵坐标为反应产物在600纳米下的吸光度值，横坐标为反应时间(秒)；

图3是本发明实施例中在酶标仪上建立的indigoidine的浓度和600纳米下吸光度的线性关系，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为indigoidine的浓度(微摩尔/升)；

图4是本发明实施例中利用BpsA在酶标仪测量的L-谷氨酰胺标准曲线，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为L-谷氨酰胺的浓度(毫摩尔/升)，反应时间为30分钟；

图5是本发明实施例中利用BpsA在紫外可见分光光度计测量的L-谷氨酰胺标准曲线，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为L-谷氨酰胺的浓度(毫摩尔/升)，反应时间为30分钟；

图6是本发明实施例中利用BpsA在酶标仪测量的L-谷氨酰胺标准曲线，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为L-谷氨酰胺的浓度(毫摩尔/升)，反应时间为20分钟；

图7是本发明实施例中利用BpsA在紫外可见分光光度计测量的L-谷氨酰胺标准曲线，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为L-谷氨酰胺的浓度(毫摩尔/升)，反应时间为20分钟；

图8是本发明实施例中利用Sc-IndC在酶标仪测量的L-谷氨酰胺标准曲线，图中的纵坐标为吸光度值，横坐标为L-谷氨酰胺的浓度(毫摩尔/升)，反应时间为30分钟。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。同样道理，实施例1和2分别使用两种indigoidine合成酶对本发明进行说明，但该发明所阐述的L-谷氨酰胺的比色测定方法并不只是局限于这两种酶，也适用于其他能合成indigoidine的非核糖体多肽合成酶。

实施例1

本实施例描述通过来自Streptomyces lavendulae的indigoidine合成酶BpsA来测定L-谷氨酰胺的含量的方法。

一、细菌菌株，载体和培养条件

Streptomyces lavendulae ATCC 11924从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。它可以在YEME培养基(酵母提取物3克/升，蛋白胨5克/升，麦芽膏3克/升，葡萄糖10克/升)中30℃下生长，以获得细胞来提取基因组DNA。大肠杆菌XL1-Blue是从安捷伦公司购买，大肠杆菌BL21(DE3)是从美国New England Biolabs公司购买。

大肠杆菌XL1-Blue(安捷伦)和pJET1.2载体(Fermentas公司)用于基因克隆和测序。大肠杆菌BL21(DE3)以及pET28a(Novagen公司)和pACYCDuet-1(EMD Millipore公司)表达载体用于蛋白表达。大肠杆菌细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中培养。必要时，合适的抗生素，加入以下浓度：氨苄青霉素，50微克/毫升；卡那霉素，50微克/毫升；氯霉素，25微克/毫升。对于蛋白质表达，200微摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)加入到大肠杆菌BL21(DE3)的培养液中诱导蛋白表达。

二、DNA操作

S.lavendulae ATCC 11924的基因组DNA用标准方法分离出来。大肠杆菌中的质粒用GeneJET^TM质粒小量提取试剂盒(Fermentas公司)提取。

三、BpsA在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

利用S.lavendulae ATCC 11924的基因组DNA做模板，用PCR将3.9-kb的bpsA基因扩增出来。我们使用热启动高保真DNA聚合酶(New England Biolabs公司)和一对特异性引物，5'-aaCATATGactcttcaggagaccagcgtgctc-3'(NdeI位点以粗体表示)和5'-atAAGCTTctcgccgagcaggtagcggatgtg-3'(HindIII位点以粗体表示)。扩增的bpsA利用T4DNA连接酶连到克隆载体pJET1.2中得到pJET1.2-bpsA。测序后，用NdeI和HindIII将bpsA基因从质粒pJET1.2-bpsA中切下，并连接到pET28a载体中的相同位点之间，产生质粒pET28a-bpsA。

用同样的方法，可以将一个来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SEQ ID NO.5)基因sfp从该菌的基因组中克隆并连接到pACYCDuet-1的NcoI和EcoRI位点之间，得到pACYCDuet-1-sfp。所用的引物为5'-aaCCATGGatgaagatttacggaattta-3'(NcoI位点以粗体表示)和5'-aaGAATTCttataaaagctcttcgtacg-3'(EcoRI位点以粗体表示)。

将pET28a-bpsA和pACYCDuet-1-sfp导入大肠杆菌BL21(DE3)中，正确的菌落利用LB琼脂加50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素来选择。为了表达BpsA，含有pET28a-bpsA和pACYCDuet-1-sfp的大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长在含有50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素的LB液体培养基中。生长温度37℃，转速250rpm。当OD₆₀₀达到0.4～1.0时，加入200微毫摩尔/升的IPTG以诱导BpsA和Sfp的表达。将温度调至较低的温度(15℃-25℃)，继续培养14小时。

四、蛋白表达的SDS-PAGE分析

上述第三项中的BpsA在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达可以通过SDS-PAGE进行分析。将50毫升的培养液在2700×g的转速下离心5分钟。细胞重新悬浮于3毫升的裂解缓冲液(20毫摩尔/升Tris-HCl，500毫摩尔/升氯化钠，pH值7.9)中。超声处理10分钟后(18瓦，间隔30秒)，将细胞裂解液在21000×g下离心10分钟。不可溶的蛋白用8摩尔/升的尿素溶解。可溶和不溶的蛋白都用12％的SDS-PAGE胶分析。

五、从大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bpsA+pACYCDuet-1-sfp中纯化BpsA

将质粒pET28a-bpsA和pACYCDuet-1-sfp导入到大肠杆菌BL21(DE3)中。将该菌株在2个两升的大三角瓶中培养。每个摇瓶中含有500毫升的LB培养基以及50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素。培养温度37℃，转速250rpm。当OD₆₀₀达到0.6时，加入200微摩尔/升(终浓度)的IPTG在18℃下表达。

14小时后，在2700×g下将该大肠杆菌培养液离5分钟。将细胞重新悬浮于裂解缓冲液(20毫摩尔/升Tris-HCl，500毫摩尔/升氯化钠，pH值7.9)中，并在冰上通过超声裂解细胞。细胞碎片通过在21000×g离心30分钟除去。将所得的上清液与Ni-NTA树脂孵育4小时后，将混合物装到一个开放柱，通过逐步增加咪唑的浓度(0毫摩尔/升，10毫摩尔/升，50毫摩尔/升和250毫摩尔/升)的缓冲液A(50毫摩尔/升Tris-HCl，pH值7.9，2毫摩尔/升EDTA，2毫摩尔/升DTT)来洗脱带有C端组氨酸标签的BpsA。利用Amicon-15离心式过滤器将含BpsA的部分进行浓缩并交换到50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液(pH 7.8)。

纯化后的BpsA存于50％的甘油中并保存在-20℃，或者，也可将磷酸钠缓冲液中的酶冷冻干燥以方便存储和以后使用。

六、在酶标仪上测定BpsA合成indigoidine速率与时间的关系

将146.15毫克的L-谷氨酰胺溶解于10毫升50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液中，得到100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液。将9.52毫克的氯化镁和55.12毫克的ATP分别溶解于1毫升pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液中。

用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液稀释成10毫摩尔/升。96孔板的每个孔中含有250微升的反应体系，其组成为2.5毫摩尔/升ATP和氯化镁、2.5毫摩尔/升的L-谷氨酰胺、1微摩尔/升的BpsA以及pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。该96孔板震荡20秒，在室温下反应。该反应有三个平行。酶标仪连续地扫描不同时间点反应体系在600纳米下的吸光度。图2显示的为测得的数值，其中吸光度数据为三个平行反应的平均值。如图2所示，反应开始阶段初速度较快，速度稳定，40分钟以后，速率变慢。我们在以下的实验中选择了30和20分钟作为反应时间。

七、在酶标仪上测定indigoidine浓度和600纳米下吸收值的线性关系

在第六项中我们测定的是BpsA与L-谷氨酰胺反应产物在600纳米下吸收值与时间的关系。接下来我们用酶标仪来测定不同浓度的indigoidine在600纳米下的吸收值。我们首先将1毫克的indigoidine完全溶解在1毫升的二甲基亚砜中。然后将该溶液用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液稀释至一系列浓度(表1)。将250微升的这些不同浓度的indigoidine溶液转至96孔板中，并在酶标仪上测量它们在600纳米下的吸光值。pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液作为空白对照。测量的数值列在表1中。

表1

根据不同indigoidine浓度下的不同吸光度值，可以建立一个两者线性关系的标准曲线，如图3所示。因而，我们可以确定indigoidine浓度和其在酶标仪上600纳米下的吸光度值成正比。利用这个线性关系，我们在检测L-谷氨酰胺的过程中只需要测定吸光度值即可，而无需计算出indigoidine的实际浓度。

八、建立一个用于在酶标仪上30分钟测定L-谷氨酰胺的标准曲线

在第六项中我们发现在反应的初始阶段0-40分钟，反应速率保持一个较为稳定的状态。我们选择30分钟作为测定L-谷氨酰胺的反应时间。在第七项中我们发现反应产物indigoidine的浓度与600纳米下的吸光度成线性关系。据此我们将建立一个标准曲线来描述L-谷氨酰胺浓度与反应初速度的关系。基本方法是将不同浓度的L-谷氨酰胺溶液与BpsA反应30分钟，再测定反应产物在600纳米下的吸光度。

L-谷氨酰胺、ATP、和氯化镁溶液的配制如第六项中所述。

用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液稀释成以下浓度：30毫摩尔/升，20毫摩尔/升，10毫摩尔/升，8毫摩尔/升，4毫摩尔/升，3毫摩尔/升，2毫摩尔/升。

96孔板的每个孔中含有250微升的反应体系，其组成为2.5毫摩尔/升ATP和氯化镁、12.5微升的L-谷氨酰胺、1微摩尔/升的的BpsA以及pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。反应开始之前，先制备含有50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，BpsA，ATP和氯化镁的母液。再将237.5微升此母液加入到各个孔当中。然后添加12.5微升的L-谷氨酰胺溶液，组成总体积为250微升的反应体系。各个反应中L-谷氨酰胺的终浓度分别为1.5毫摩尔/升、1毫摩尔/升、0.5毫摩尔/升、0.4毫摩尔/升、0.2毫摩尔/升、0.15毫摩尔/升和0.1毫摩尔/升。不含L-谷氨酰胺的母液作为阴性对照。所有反应都有三个平行。

该96孔板震荡20秒，在室温下反应30分钟。利用酶标仪对反应体系在600纳米处的吸光度值进行测量，结果如表2所示：

表2

根据不同L-谷氨酰胺浓度下反应产物的不同吸光度值，可以建立一个线性关系的标准曲线，如图4所示。通过该标准曲线，我们可以根据待测样品与BpsA反应30分钟后在600纳米的吸光度来推算出其L-谷氨酰胺的含量。

九、三种已知浓度的L-谷氨酰胺标准溶液在酶标仪上的测定

为了检测第八项中建立的标准曲线的准确性，我们对三个已知浓度的L-谷氨酰胺溶液进行了测定。反应条件如第八项所述，每个反应体系中含有12.5微升的待测样品。这三个已知L-谷氨酰胺样品在反应体系中分别为1毫摩尔/升，0.5毫摩尔/升和0.2毫摩尔/升。反应条件和测定方法如第八项中所述。结果如表3所示：

表3

根据测定的吸光度值以及第八项中的标准曲线，对于1毫摩尔/升，0.5毫摩尔/升和0.2毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液，利用本发明的方法测得的浓度分别是1.01、0.53和0.19毫摩尔/升。由此可见，利用本发明的测定方法测定的浓度与实际浓度高度一致。

十、利用酶标仪测定动物细胞培养液样品中L-谷氨酰胺的浓度

利用第八项中建立的标准曲线，我们用本发明的方法测定了一种3T3小鼠胚胎成纤维细胞培养物中L-谷氨酰胺的浓度。取出12.5微升培养液加入到96孔板中含237.5毫升反应母液的孔中。三组平行实验同时进行。反应条件，反应时间及吸光度值测定方法如第八项所述。通过所测吸光度值和第八项中建立的标准曲线，该培养液中的L-谷氨酰胺浓度被确定为1.37±0.12毫摩尔/升。

十一、建立一个用于在紫外可见分光光度计上30分钟测量L-谷氨酰胺浓度的标准曲线

L-谷氨酰胺、ATP、和氯化镁溶液的配制如第六项中所述。

用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液稀释成以下浓度：30毫摩尔/升，20毫摩尔/升，10毫摩尔/升，8毫摩尔/升，4毫摩尔/升。

每个比色皿中含有750微升的反应液，包括7.5微升的1毫摩尔/升的ATP和氯化镁，37.5微升的L-谷氨酰胺溶液，1微尔/升的BpsA，和50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。该反应液需要先制备含有pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，BpsA，ATP和氯化镁的母液。然后将712.5微升的母液分装到不同的比色皿中。最后将37.5微升的L-谷氨酰胺溶液加入到比色皿中，即得到750微升的反应液。以没有加L-谷氨酰胺的母液作为阴性对照。所有反应都有三个平行。

将比色皿中的的反应液用移液枪混合。在室温下反应30分钟。用紫外可见分光光度计上在600纳米下测量反应液的吸光度值，其结果如表4所示：

表4

利用表4中的数据，可以建立一个标准曲线描述在该分析条件下L-谷氨酰胺和600纳米下吸光度值的比例关系，如图5所示。通过该标准曲线，我们可以根据待测样品与BpsA反应30分钟后在600纳米的吸光度来推算出其L-谷氨酰胺的含量。

十二、紫外可见分光光度计上测量两个已知浓度的L-谷氨酰胺溶液

为了检测第十一项中建立的标准曲线的准确性，两种单独制备的L-谷氨酰胺的溶液被分别加入到含有750微升的反应液的比色皿中。这两种L-谷氨酰胺溶液的实际制备浓度分别为1.5毫摩尔/升和1毫摩尔/升。最终反应产物的吸光度值的测量如上所述。两个平行实验的测量结果如表5所示：

表5

根据表5中的测量数据，再对照第十一项中建立的标准曲线，我们可以算出这两个溶液中L-谷氨酰胺的浓度分别是1.47毫摩尔/升和1.03毫摩尔/升。可见，L-谷氨酰胺的测定浓度非常接近于L-谷氨酰胺的实际浓度，证明该方法是一种快速而准确的L-谷氨酰胺测定法。

十三、在紫外可见分光光度计上测定微生物培养物中的L-谷氨酰胺含量

为了进一步检验在比色皿中的L-谷氨酰胺测量方法，本实施例选用微生物培养物作为测试样品。该细菌名为Streptomyces chromofuscus，培养在YM培养基中(0.4％葡萄糖，0.4％酵母提取物，1％麦芽提取物，pH值7.3)。将37.5微升的发酵液中加入到三个含有712.5微升的反应母液的比色皿中，以形成总体积750微升的反应体系。测定方法如第十一项所述。根据第十一项中建立的标准曲线，L-谷氨酰胺在此微生物培养物的浓度被测定为0.134±0.004毫摩尔/升。

十四、建立一个用于在酶标仪上20分钟测定L-谷氨酰胺的标准曲线

在第六项中我们发现在反应的初始阶段0-40分钟，反应速率保持一个较为稳定的状态。在第八到第十三项中，我们选择了30分钟作为测定L-谷氨酰胺的反应时间。在实施例1的接下来的实验中，我们测试了反应20分钟检测L-谷氨酰胺的方法。在第七项中我们发现反应产物indigoidine的浓度与600纳米下的吸光度成线性关系。据此我们可以建立一个标准曲线来描述L-谷氨酰胺浓度与反应初速度的关系。基本方法是将不同浓度的L-谷氨酰胺溶液与BpsA反应20分钟，再测定反应产物在600纳米下的吸光度。

L-谷氨酰胺、ATP、和氯化镁溶液的配制如第六项中所述。

用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液稀释成以下浓度：40毫摩尔/升，30毫摩尔/升，20毫摩尔/升，10毫摩尔/升。

96孔板的每个孔中含有250微升的反应体系，其组成为2.5毫摩尔/升ATP和氯化镁、12.5微升的L-谷氨酰胺、1微摩尔/升的的BpsA以及pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。反应开始之前，先制备含有50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，BpsA，ATP和氯化镁的母液。再将237.5微升此母液加入到各个孔当中。然后添加12.5微升的L-谷氨酰胺溶液，组成总体积为250微升的反应体系。各个反应中L-谷氨酰胺的终浓度分别为2毫摩尔/升，1.5毫摩尔/升、1毫摩尔/升和0.5毫摩尔/升。不含L-谷氨酰胺的母液作为阴性对照。所有反应都有三个平行。

该96孔板震荡20秒，在室温下反应20分钟。利用酶标仪对反应体系在600纳米处的吸光度值进行测量，结果如表6所示：

表6

根据不同L-谷氨酰胺浓度下反应产物的不同吸光度值，可以建立一个线性关系的标准曲线，如图6所示。通过该标准曲线，我们可以根据待测样品反应20分钟后在600纳米的吸光度来推算出其L-谷氨酰胺的含量。

十五、两种已知浓度的L-谷氨酰胺标准溶液在酶标仪上反应20分钟的测定

我们随后用BpsA对两种L-谷氨酰胺标准溶液进行了测定。反应条件如第十四项所述，每个反应体系中含有12.5微升的待测样品。这两个已知L-谷氨酰胺样品在反应体系中分别为0.8毫摩尔/升和1.2毫摩尔/升。反应条件和测定方法如第十四项中所述。根据测定的吸光度值以及第十四项中的标准曲线，对于这两种L-谷氨酰胺溶液，利用本发明的方法测得的浓度分别是0.83和1.24毫摩尔/升。由此可见，利用本发明的测定方法测定的浓度与实际浓度很一致。

十六、建立一个用于在紫外可见分光光度计上20分钟测量L-谷氨酰胺浓度的标准曲线

L-谷氨酰胺、ATP、和氯化镁溶液的配制如第六项中所述。

每个比色皿中含有750微升的反应液，包括7.5微升的1毫摩尔/升的ATP和氯化镁，37.5微升的L-谷氨酰胺溶液，1微尔/升的BpsA，和pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。该反应液需要先制备含有50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，BpsA，ATP和氯化镁的母液。然后将712.5微升的母液分装到不同的比色皿中。最后将37.5微升的L-谷氨酰胺溶液加入到比色皿中，即得到750微升的反应液。以没有加L-谷氨酰胺的比色皿作为阴性对照。所有反应都有三个平行。

将比色皿中的的反应液用移液枪混合。在室温下反应20分钟。用紫外可见分光光度计上在600纳米下测量反应液的吸光度值，其结果如表7所示：

表7

利用表7中的数据，可以建立一个标准曲线来描述在该分析条件下L-谷氨酰胺浓度和反应产物在600纳米下吸光度值的比例关系，如图7所示。通过该标准曲线，我们可以根据待测样品反应20分钟后在600纳米的吸光度来推算出其L-谷氨酰胺的含量。

十七、紫外可见分光光度计上反应20分钟测量两个已知浓度的L-谷氨酰胺溶液

我们随后用BpsA对两种L-谷氨酰胺标准溶液进行了测定，反应时间为20分钟。反应条件如第十六项所述，每个反应体系中含有37.5微升的待测样品。这两个已知L-谷氨酰胺样品在反应体系中分别为0.7毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升。反应条件和测定方法如第十六项中所述。根据测定的吸光度值以及第十六项中的标准曲线，对于这两种L-谷氨酰胺溶液，利用本发明的方法测得的浓度分别是0.68和1.64毫摩尔/升。由此可见，利用本发明的测定方法测定的浓度与实际浓度很一致。

实施例2

本实施例描述通过来自Streptomyces chromofuscus的indigoidine合成酶Sc-IndC来测定L-谷氨酰胺的含量的方法。

一、细菌菌株，载体和培养条件

Streptomyces chromofuscus ATCC 49982从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。它可以在YEME培养基(酵母提取物3克/升，蛋白胨5克/升，麦芽膏3克/升，葡萄糖10克/升)中30℃下生长，以获得细胞来提取基因组DNA。大肠杆菌XL1-Blue是从安捷伦公司购买，大肠杆菌BL21(DE3)是从美国New England Biolabs公司购买。

大肠杆菌XL1-Blue(安捷伦)和pJET1.2载体(Fermentas公司)用于基因克隆和测序。大肠杆菌BL21(DE3)以及pET28a(Novagen公司)和pACYCDuet-1(EMD Millipore公司)表达载体用于蛋白表达。大肠杆菌细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中培养。

二、DNA操作

S.chromofuscus ATCC 49982的基因组DNA用标准方法分离出来。大肠杆菌中的质粒用GeneJET^TM质粒小量提取试剂盒(Fermentas公司)提取。

三、Sc-IndC在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

利用PCR将4134-bp的sc-indC基因从S.chromofuscus ATCC 49982的基因组DNA中扩增出来。我们使用热启动高保真DNA聚合酶(New England Biolabs公司)和一对特异性引物，5'-aaCATatgagcgtagagaccatccc(NdeI位点以粗体表示)和5'-aaAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'(HindIII位点以粗体表示)。扩增的sc-indC利用T4DNA连接酶连到克隆隆载体pJET1.2中得到pJET1.2-sc-indC。测序后，用NdeI和HindIII将sc-indC基因从质粒pJET1.2-sc-indC中切下，并连接到pET28a载体中的相同位点之间，产生质粒pET28a-sc-indC。

将pET28a-sc-indC和实施例1第三项中构建的pACYCDuet-1-sfp导入大肠杆菌BL21(DE3)中，正确的菌落利用LB琼脂加50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素来选择。为了表达Sc-IndC，含有pET28a-sc-indC和pACYCDuet-1-sfp的大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长在含有50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素的LB液体培养基中。生长温度37℃，转速250rpm。当OD₆₀₀达到0.4～1.0时，加入200微毫摩尔/升的IPTG以诱导Sc-IndC和Sfp的表达。将温度调至较低的温度(15℃-25℃)，继续培养14小时。

四、从大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-sc-indC+pACYCDuet-1-sfp中纯化Sc-IndC

将质粒pET28a-sc-indC和pACYCDuet-1-sfp导入到大肠杆菌BL21(DE3)中。将该菌株在1升(平均分装在两个2升的大三角瓶中)的含有50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升氯霉素的LB培养基中培养。培养温度37℃，转速250rpm。当OD₆₀₀达到0.6时，加入200微摩尔/升(终浓度)的IPTG在18℃下表达。

14小时后，在2700×g下将该大肠杆菌培养液离5分钟。将菌体重新悬浮于裂解缓冲液(20毫摩尔/升Tris-HCl，500毫摩尔/升氯化钠，pH值7.9)中，并在冰上通过超声裂解细胞。细胞碎片通过在21000×g离心30分钟除去。将所得的上清液与Ni-NTA树脂孵育4小时后，将混合物装到一个开放柱，通过逐步增加咪唑的浓度(0毫摩尔/升，10毫摩尔/升，50毫摩尔/升和250毫摩尔/升)的在缓冲液A(50毫摩尔/升Tris-HCl，pH值7.9，2毫摩尔/升EDTA，2毫摩尔/升DTT)来洗脱带有N端组氨酸标签的Sc-IndC。利用Amicon-15离心式过滤器将含Sc-IndC的部分进行浓缩并交换到50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液(pH7.8)。

纯化后的Sc-IndC存于50％的甘油中并保存在-20℃，或者，也可将磷酸钠缓冲液中的酶冷冻干燥以方便存储和以后使用。

五、建立一个用于在酶标仪上使用Sc-IndC测定L-谷氨酰胺的标准曲线

L-谷氨酰胺、ATP、和氯化镁溶液的配制如实施例1第六项中所述。

用pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的L-谷氨酰胺溶液稀释成以下浓度：20毫摩尔/升，16毫摩尔/升，12毫摩尔/升，8毫摩尔/升，4毫摩尔/升。

96孔板的每个孔中含有250微升的反应体系，其组成为2.5毫摩尔/升ATP和氯化镁、12.5微升的L-谷氨酰胺、1微摩尔/升的的Sc-IndC以及pH值为7.8的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。反应开始之前，先制备含有50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，Sc-IndC，ATP和氯化镁的母液。再将237.5微升此母液加入到各个孔当中。然后添加12.5微升的L-谷氨酰胺溶液，组成总体积250微升的反应体系。各个反应中L-谷氨酰胺的终浓度分别为1毫摩尔/升、0.8毫摩尔/升、0.6毫摩尔/升、0.4毫摩尔/升、和0.2毫摩尔/升。不含L-谷氨酰胺的母液作为阴性对照。所有反应都有三个平行。

该96孔板震荡20秒，在室温下反应30分钟。利用酶标仪对反应体系在600纳米出的吸光度值进行测量，结果如表8所示。

表8

根据不同L-谷氨酰胺浓度下的不同吸光度值，可以建立一个线性关系的标准曲线，如图8所示。

六、两种已知浓度的L-谷氨酰胺标准溶液在酶标仪上的测定

我们随后用Sc-IndC对两种L-谷氨酰胺标准溶液进行了测定。反应条件如第五项所述，每个反应体系中含有12.5微升的待测样品。这两个已知L-谷氨酰胺样品在反应体系中分别为0.5毫摩尔/升和0.8毫摩尔/升。反应条件和测定方法如第五项中所述。根据测定的吸光度值以及第五项中的标准曲线，对于这两种L-谷氨酰胺溶液，利用本发明的方法测得的浓度分别是0.53和0.78毫摩尔/升。由此可见，利用本发明的测定方法测定的浓度与实际浓度很一致。

<110> 陶淑芳

<120> 基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法及测定试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 1488

<212> PRT

<213> 菊迪卡氏菌（Dickeya chrysanthemi）

<400> 1

MDNISNHAFN YPVLVLNKGL LPEHDDIALA RYLFSALALA VSRITQNEEM IVGFHLHPQE 60

ITRWKDDECI RQYILPLNIR FNSATPIAGF IREIMTWMTP DAIHQKNAMG ASVLTLGPQH 120

ALHDIFDLEI SWQPPVESEP VQALTCHVAS REDALVLTLR FNPARFSATQ MQKLPEVWRQ 180

ITASAAKNGA ETLRDIGLID DAERQRVLHA FNQTEQAWDG ETTVAARLKN RAQRHPEQTA 240

VVFRDETLSY RQLYQQAGAL AHYLNALETE RERCVGLFVE PSLTLMTGVW GILLSGNAYL 300

PLSPEYPEDR LAYMLENSQT RIIVTQPHLR ERLLALAPPG IQVVTSDDVD AFMRQHAHSL 360

PDAPQNDIAP HHLAYVIYTS GSTGKPKGVM IEHHSVLNQM NWLAQTVGLN QETVILQKTP 420

MSFDAAQWEI LSPACGCRVV MGEPGVYRNP EQLVDMLAEY RVTTLQCVPT LLQALLDTER 480

LTHCPALRQI FSGGEALQKH LAQACLETLP DCQLINLYGP TECTINNSAF RVDPVSVRQG 540

PDTLSIGAPV ANTRYYILDN CLTPVAVGQI GELYIGGDGV ARGYLNRDDL TAERFIVDPF 600

APAGSGRRLY QTGDIASWNP DGTVQYAGRA DNQVKLRGYR VELDEIRSAI ETHEWVKAAA 660

VIVRNDPFTG YQNLISFIEL NAREAALMDQ GNHGSHHQSK ADKAQVMLQL ANKGCREFPA 720

ASQPYTLDLP GKQPDEKQRL TAFSRKTYRF YDGGAVSRED ILSLLHEPLL TAISRQPDAL 780

TLDELGHWLR YLGQFTSAER LLPKYTYASP GALYATQVFL ELNGVAGLTA GHYYYQPVHH 840

QLVRVSEQAA VTPGSLRLHF VGKKSAIEPI YKNNIREVLQ MEMGHIIGML DIILPDYGLG 900

VALCDAAALD PTPLAIDLDD DYLGACDVLS GPRLPTDDDL DIYVQTAGAN IADLPVGTYR 960

YVRGDLQHIA DDVIDKKHVI AINQAVYERS SFGISVASRT EGWAGYVHVG RKLQRLQMNP 1020

LNIGLMSSGY SSETGNDLPA ARRFWQILGH RTGPYYFFIG GRISDEQKYS EGMREDAVHM 1080

KGPAEMIRDD LAAFMPDYMM PNKVLILDEM PLTANGKIDM KALANINVEL KHKTIVAPRN 1140

PLEHQVMAIW QAKLKREEMS VDDNFFESGG NSLIAVSLIN ELNATLNASL PLQVLFQAPT 1200

VEKLAAWLSR ARREPVSRLV QLQPKGRQAP IYCWPGLGGY CMNLRLLARQ LGAERPFFGI 1260

QAHGINPDET PYATIGEMAA RDIELIRQHQ PHGPYTLWGY SFGARVAFET AWQLELAGEV 1320

VENLYLLAPG SPKLRDERVA AMNRKADFDN PGYLTILFSV FIGSITDPEL ERCLETVRDE 1380

ESFVAFITGL NPALDDGLVR RITRIVAQTF EFTYTFSELQ QRQLNAPVTI IKAQGDDYSF 1440

IENHGGFSAQ PPTVLELMAD HYSMLKAPGI DELTSVIQYQ QSPPSLVG 1488

<210> 2

<211> 1282

<212> PRT

<213> 淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）

<400> 2

MTLQETSVLE PTLQGTTTLP GLLAQRVAEH PEAIAVAYRD DKLTFRELAS RSAALADYLE 60

HLGVSADDCV GLFVEPSIDL MVGAWGILNA GAAYLPLSPE YPEDRLRYMI ENSETKIILA 120

QQRLVSRLRE LAPKDVTIVT LRESEAFVRP EGTEAPAARS ARPDTLAYVI YTSGSTGKPK 180

GVMIEHRSIV NQLGWLRETY AIDRSKVILQ KTPMSFDAAQ WEILSPANGA TVVMGAPGVY 240

ADPEGLIETI VKHNVTTLQC VPTLLQGLID TEKFPECVSL QQIFSGGEAL SRLLAIQTTQ 300

EMPGRALINV YGPTETTINS SSFPVDPADL DEGPQSISIG SPVHGTTYHI LDKETLKPVG 360

VGEIGELYIG GIQLARGYLH RDDLTAERFL EIELEEGAEP VRLYKTGDLG QWNNDGTVQF 420

AGRADNQVKL RGYRVELDEI SLAIENHDWV RNAAVIVKND GRTGFQNLIA CIELSEKEAA 480

LMDQGNHGSH HASKKSKLQV KAQLSNPGLR DDAELAARPA FDLEGAEPTP EQRARVFARK 540

TYRFYEGGAV TQADLLGLLG ATVTAGYSRK AADLAPAELG QILRWFGQYI SEERLLPKYG 600

YASPGALYAT QMYFELEGVG GLKPGYYYYQ PVRHQLVLIS EREATGKATA QIHFIGKKSG 660

IEPVYKNNIL EVLEIETGHM VGLFEQILPA YGLDIHDRAY EPAVKDLLDV ADEDYYLGTF 720

ELVPHAGARD DQAEVYVQTH GGKVAGLPEG QYRYENGELT RFSDDIVLKK HVIAINQSVY 780

QAASFGISVY SRAEEEWLKY ITLGKKLQHL MMNGLNLGFM SSGYSSKTGN PLPASRRMDA 840

VLGANGVDSA PMYFFVGGRI SDEQIGHEGM REDSVHMRGP AELIRDDLVS FLPDYMIPNR 900

VVVFDRLPLS ANGKIDVKAL AASDQVNAEL VERPFVAPRT ETEKEIAAVW EKALRRENAS 960

VQDDFFESGG NSLIAVGLVR ELNARLGVSL PLQSVLESPT IEKLARRLER EVAQESSRFV 1020

RLHAETGKAR PVICWPGLGG YPMNLRSLAG EIGLGRSFYG VQSYGINEGE TPYETITEMA 1080

KKDIEALKEI QPAGPYTLWG YSFGARVAFE TAYQLEQAGE KVDNLFLIAP GSPKVRAENG 1140

KVWGREASFA NRGYTTILFS VFTGTISGPD LDRCLETVTD EASFAEFISE LKGIDVDLAR 1200

RIISVVGQTY EFEYSFHELA ERTLQAPISI FKAVGDDYSF LENSSGYSAE PPTVIDLDAD 1260

HYSLLREDIG ELVKHIRYLL GE 1282

<210> 3

<211> 1283

<212> PRT

<213> 金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)

<400> 3

MTLQETSVLE PTLRGTTTLP DLLAKRVAEH PEATAVAYRD EKLTYRELAS RSSALAEYLR 60

HLGVSTDDCV GLFVEPSIDL MVGAWGILSA GAAYLPLSPE YPEDRLRYMI ENSQAKIILA 120

QQRLVTRLRE LAPQDVRVVT LRESEAFVLP EGQVAPAIEG ARPDSLAYVI YTSGSTGKPK 180

GVMIEHHSIV SQLGWLRETY GIDRSKTILQ KTPMSFDAAQ WEILSPANGA TVVMGAPGVY 240

ADPEGLIETI VKYGVTTLQC VPTLLQGLLD TEKFPECTSL QQIFSGGEAL SRLLAIQTTQ 300

EMPGRALINV YGPTECTINS SSYAVDPAEL GEAPQSISIG APVADTEYHI LGKEDLKPVG 360

VGEIGELYIG GGQLARGYLH RPDLTAERFL EIEVTEGAGP VRLYKTGDLG QWNPDGTVQF 420

AGRADNQVKL RGYRVELDEI SLAIENHDWV RNAAVIVKND GRTGFQNLIA CVELSEKEAA 480

LMDQGNHGSH HASKKSKLQV KAQLSNPGLR DDADLAARVA YDLPGAEPTP EQRSRVFARK 540

TYRFYEGGAV TEADLLALLG GQVPAAYSRK AADLAPAELG QILRWFGQYL SEERLLPKYG 600

YASPGALYAT QLYFELEGVG GLQPGYYYYQ PQRHQLVLIS EKAATGRPTA HIHFIGKRGG 660

IEPVYKNNIQ EVLEIETGHI VGLFEQVLPA YGLDIRDLAY EPAVRDLLDV PEEDFYLGTF 720

ELVPHTGRRE DHAEVYVQTH GSKVANLPEG QYRYADGTLT RFSDDIVLKK QVIAINQSVY 780

QAASFGISVI SRAPEEWMHY VTLGKKLQHL MMNGLGLGFM SSGYSSKTGN PLPASRRIDS 840

VLQANGVESG PSYFFVGGRV SDEQLGHEGM REDSVHMRGP AELIRDDLVS FLPDYMIPNR 900

VVVFERLPLS ANGKIDAKAL AASDQVNAEL VERPFVAPRT ETEKEIAEVW AKSLRRESVS 960

VQDDFFESGG NSLIAVGLIR ELNSRLGVSL PLQSVLESPT VEKLSRRLER EVAQESSRLV 1020

RLHAETGKDR PVLCWPGLGG YPMNLRTLAG EIGLGRSFYG IQAHGINEGE APYATITEMA 1080

KADIEAIKEL QPKGPYTLWG YSFGARVAFE TAYQLEQAGE KVDNLFLIAP GSPTVRAENG 1140

KVYGREASFA NRAYTTILFS VFTGTISGPD LEKCLESATD EESFAGFISE LKGIDVDLAK 1200

RIISVVGQTY EFEYSFRELA ERTLAAPVTI FKARGDDYSF IENSNGYSAE PPTVIDLDAD 1260

HYSLLRTPDI GELVKHIRYL LGE 1283

<210> 4

<211> 1377

<212> PRT

<213> 褐色链霉菌（Streptomyces chromofuscus）

<400> 4

MSVETIPCSR RAALGLPGLL RERARATPDR TAAVHEHQSL TFAQLTEDSS HVGALLRQAG 60

VGRDSRVGVF MEPSLDLLTG VWGILWAGGC YVPLSPEYPE ERIAYMLADA GVDIVLTQEF 120

LRSTLQELAP AGVVVLTLDE MLRTAERDGS AFGRPEPEVR PDDLAYVIYT SGSTGKPKGV 180

MVEHRSIVSQ MRWLHDECGI DENEIILQKT PMSFDAAQWE LLALACGSTV VMGSSGIYRD 240

PEAIISTVQR HGVTTLQCVP TLLQALLDTE KFPDCGTLRR IFSGGEALSR SLAAQCLDTM 300

PGARLVNLYG PTECTINASS FVVDRAALED GPLVMPIGTP VHDTSLHVLR PDGAPVSAGE 360

IGELYIGGVQ VARGYLGRPD LTGDRFMADP FSDAPGSRLY RTGDLAHVNA DGTVQFVGRA 420

DNQVKLRGYR VELDEIRQTV ETHDWVRAAA VLLRDDATTG FQNLVAFVEL NPKEAALMDQ 480

GNHGSHHQSK ASRLQVRAQL AHPGCRDDAD LAGRAAIDLP GAEATPGQRA LAFSRKTYRF 540

YEGSPVTRDD ILHLLGPRPR PRPSARTSDI VGRDELGTIL RNFGRHLSDQ RLLPKYAYAS 600

PGSLYATQLY VEIGGGHDVP AGLYYYHPLH HRLVLVGPAS ETETSPVRIH FLGKHGAIEP 660

VYRNNVREVL EIEAGHMVGL FEEVLPAHGL RIAAAAYQPA VRHRLDCAPE DHYLGSFDLL 720

PQARGASEDT DTLDIYVQAH STRIEGLPPG QYRYTGAGLV RIGDDVILKK HVIAINQRVY 780

ERSDFGISLV ATGSASWRRY LDLGRGLQRL QMNDLHLGFM SSGYSSKSGN DLPSAKRLGR 840

ILADGGLPAG PSYFCVGGRV SDAQWRGEDM KEDVVHMQGP AELIKEDLAA LLPRYMLPNR 900

IVVLDRLPQT ANGKIDLKAL QTTQEAQLTV GERAFMAPRT PLERRIRDIW QAVLKRDQVS 960

VTDDFFELGG NSLLAVALVS RLNADFGGAI PLQILFEAPT VERLAAALEA TSPRPASRLV 1020

PLQPEGRGTP LYCWPGLGGY PMNLRPLAAA LGTERPVHGV QAHGINPGEF PYDDVRAMAA 1080

ADVEAIREIQ PHGPYLLCGY SFGARVAFEA ARQLEQAGEQ VEQLFLVAPG QPRLRPEDAV 1140

GATGRADFTD RAFLALLFSV FAGTLSGPRL DQCLRTVTDE DGFVAFVTAS FPGLGEELVR 1200

AVTGIVRRTY SLTYEFHELR GRRLDAPVTL VRATDDNYSF IEHEGGYSAR PPAVHQLRSG 1260

HYELLREPHV ARLAAVLNDR LSAGPSTSPR HSQPAQATVQ EVGVPHINIK HFPVSITEEK 1320

ELELVAAVTT AVRNAFGCTE EVVSIALEPV AQEVWNERVY IPEIVARQEL LRKTPNY 1377

<210> 5

<211> 224

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 5

MKIYGIYMDR PLSQEENERF MSFISPEKRE KCRRFYHKED AHRTLLGDVL VRSVISRQYQ 60

LDKSDIRFST QEYGKPCIPD LPDAHFNISH SGRWVIGAFD SQPIGIDIEK TKPISLEIAK 120

RFFSKTEYSD LLAKDKDEQT DYFYHLWSMK ESFIKQEGKG LSLPLDSFSV RLHQDGQVSI 180

ELPDSHSPCY IKTYEVDPGY KMAVCAAHPD FPEDITMVSY EELL 224

Claims

1.基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）建立标准曲线：将已知不同浓度的L-谷氨酰胺标准品分别与indigoidine合成酶、ATP、可溶性镁盐溶液以及缓冲液混合反应，反应温度为10-40℃，并在600纳米下测定反应特定时间后溶液的吸光度值，然后根据L-谷氨酰胺的浓度与对应的吸光度值绘制标准曲线；

（2）将待测样品在与步骤（1）相同的反应环境和反应条件下反应相同的时间，并测定反应后的溶液在600纳米下的吸光度值；

（3）根据步骤（1）所绘制的标准曲线以及步骤（2）测得的吸光度值测算出L-谷氨酰胺的含量；

所述ATP的浓度为0.1-10 毫摩尔/升，所述可溶性镁盐溶液的浓度为0.1-10 毫摩尔/升，所述缓冲液的pH值为7-11，所述特定时间为1-40分钟；在参与反应之前，须使用磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶对所述indigoidine合成酶的巯基化结构域进行活化。

2.根据权利要求1所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述indigoidine合成酶为IndC、BpsA或者Sc-IndC，所述IndC具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述BpsA具有如SEQ ID NO.2或者如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述Sc-IndC具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述特定时间为20-30分钟。

5.根据权利要求1或2所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述反应温度为20-30℃。

6.基于单酶反应的L-谷氨酰胺测定试剂盒，其特征在于包含以下组分：indigoidine合成酶、浓度为0.1-10毫摩尔/升的ATP、浓度为0.1-10 毫摩尔/升的可溶性镁盐溶液以及pH值为7-11的缓冲液。

7.根据权利要求6所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺测定试剂盒，其特征在于：所述indigoidine合成酶为IndC、BpsA或者Sc-IndC，所述IndC具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述BpsA具有如SEQ ID NO.2或者如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述Sc-IndC具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求6或7所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述试剂盒的反应温度为10-40℃。

10.根据权利要求6或7所述的基于单酶反应的L-谷氨酰胺的比色测定方法，其特征在于：所述试剂盒的反应温度为20-30℃。