CN110186892A - 一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明采用G‑四联体‑Hemin过氧化物模拟酶和谷氨酰胺合成酶双酶偶联体系，利用谷氨酸合成酶的选择性，特异性的识别谷氨酰胺，将谷氨酰胺定量转化为荧光信号，通过标准曲线的方法测定样品中谷氨酰胺的含量，本测定方法操作方便、成本低、快速准确、灵敏度高且对样本的损伤较小，可以广泛的应用于生物、农业等领域。

Description

一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法
技术领域
本发明涉及一种谷氨酰胺测定方法，更具体地，涉及一种可快速测定叶片中谷氨酰胺的双酶偶联体系,以及本方法在生物、农业等领域的应用。
技术背景
谷氨酰胺是植物氮代谢的重要中间产物。植物叶片中谷氨酰胺的含量能反应植物氮元素的利用信息。通过对谷氨酰胺的分析可以得到植物对氮元素的需求状况，发展谷氨酰胺的精细检测对于作物氮元素精确管理有着重要的意义。目前，谷氨酰胺的定量分析主要是采用高效液相色谱的方法测定。高效液相色谱重现性和准确性较好，但是存在仪器成本及日常分析维护成本相对高，分析耗时较久，对分析人员专业性要求高等限制因素。荧光分析法具有灵敏度高，选择性好，和操作简便等优点，在医学卫生、环境检测以及药物分析等领域得到广泛应用。也有研究将荧光分析法应用于氨基酸检测，但是缺乏针对谷氨酰胺的特异性检测方法，另外，此类方法需要一定的样品量，对于植物样本有一定损伤。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种操作方便、快速准确、对样本损伤较小且高灵敏的谷氨酰胺测定技术。本发明采用G-四联体-Hemin过氧化物模拟酶和谷氨酰胺合成酶双酶偶联体系，利用谷氨酸合成酶的选择性特异性的识别谷氨酰胺，将谷氨酰胺定量转化为荧光信号，通过标准曲线的方法测定样品中谷氨酰胺的含量。
为了实现上述发明的目的，本发明采用的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测技术，包括以下步骤：
(1)将富含有鸟嘌呤的单链DNA和富含有腺嘌呤的单链DNA分别溶解于TE缓冲液中，4℃保存，得DNA溶液A和DNA溶液B；
(2)血红素经二甲亚砜溶解后，4℃存放于磷酸钾缓冲溶液，得血红素溶液；
(3)将DNA溶液A与DNA溶液B以及血红素溶液混合，室温静置30-60分钟后得DNA模拟酶，4℃保存；
(4)配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，谷氨酰胺标准溶液和荧光试剂溶液；
(5)待测样品取样后加入酶标板加样孔中，谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
(6)向上述酶标板的加样孔加入谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育0.5-1.5小时；
(7)向上述酶标板的加样孔加入DNA模拟酶和荧光试剂溶液，孵育1-2小时；
(8)用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。
G-四联体是含有大量鸟嘌呤的DNA序列形成的特殊结构。它与血红素结合形成的DNA复合物显示催化H2O2分解的活性,因此被称为DNA模拟酶，与传统的过氧化氢酶相比，DNA酶价格低廉、稳定,可在较宽的酸度和温度范围使用，创新的将具有过氧化氢酶活力的DNA模拟酶与谷氨酰胺合成酶工作溶液偶连，本方法成本低，步骤少，灵敏度高。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，步骤(1)中所述富含有鸟嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.1＝5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；步骤(1)中所述富含有腺嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.2＝5’-CGAACTCTGCAACATAAAAAA-3’。此序列互相铰链，构成的G-四链体/血红素脱氧核酶结构稳固，其催化能力较强。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，步骤(2)中所述血红素为氯化血红素。血红素经过氯化后，所组成的核酶的催化能力能够得到增强。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，所述富含有鸟嘌呤的单链DNA：富含有腺嘌呤的单链DNA：血红素的摩尔比为1:1:2，一分子DNA结合一分子血红素，形成稳固的四联体结构。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，所述谷氨酰胺合成酶工作溶液包含以下组分：L-谷氨酰胺、α-酮戊二酸、Mg2+以及谷氨酰胺合成酶。利用谷氨酸合成酶的选择性特异性的识别谷氨酰胺，将谷氨酰胺定量转化为荧光信号，通过标准曲线的方法测定样品中谷氨酰胺的含量。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，所述谷氨酰胺标准溶液的浓度分别为0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，所述荧光试剂溶液为AmplexRed。Amplex Red与生成的谷氨酸反应，产生定量的荧光信号。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，包含以下具体步骤：
(1)配制溶解所需DNA的TE缓冲液中(10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4)，分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、5’-CGAACTCTGCAACATAAAAAA-3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；
(2)配制磷酸钾缓冲溶液(200mM K2HPO4-KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.4)，使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；
(3)将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；
(4)配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4，200mM磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7.4，200mM磷酸缓冲溶液，另含400mM NaCl与500μM荧光试剂(Amplex Red)；
(5)取样10μL，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
(6)向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育1小时；
(7)向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育1.5小时；
(8)用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，所述步骤(5)中的取样包含以下详细步骤：采用五点取样法选取五株小麦，每株选取三个叶片，用孔径为6mm的打孔器于小麦叶片上打孔取样，于靠近叶柄、叶片中部及叶尖处取样。随后将样品放入液氮冷冻。取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟。用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液(10μL)，加入酶标板的小孔中。
进一步的，上述基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法在植物叶片的谷氨酰胺含量测定中的应用。
有益效果：本发明通过合成DNA模拟酶(G-四链体/血红素脱氧核酶)，与谷氨酰胺合成酶的偶连以及荧光反应体系的建立，公开了一种操作方便、成本低，快速准确、灵敏度高且对样本的损伤较小，可以广泛应用于生物、农业等领域的基于双酶偶连的谷氨酰胺检测方法，在2μM至10μM范围内有较好的线性，检测限为0.34μM，有较高的灵敏度。将一定量的谷氨酰胺标准品加入到植物叶提取液中，测得谷氨酰胺的回收率和RSD(相对标准偏差)如表1所示，结果表明本方法可以用于实际样品中谷氨酰胺的检测。
表1
附图说明
图1为根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸和核酸序见序列表。
实施例1
(1)配制溶解所需DNA的TE缓冲液中(10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4)，分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、5’-CGAACTCTGCAACATAAAAAA-3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；
(2)配制磷酸钾缓冲溶液(200mM K2HPO4-KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.4)，使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；
(3)将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；
(4)配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4，200mM磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7.4，200mM磷酸缓冲溶液，另含400mM NaCl与500μM荧光试剂(Amplex Red)；
(5)用打孔器于水稻叶片上打孔取样，随后将样品放入液氮冷冻。取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟。用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液(10μL)，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
(6)向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育0.5小时；
(7)向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育1小时；
(8)用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。经计算田间小麦，每平方厘米叶片中，平均含谷氨酰胺的量为1.47×10-7g。
实施例2
(1)配制溶解所需DNA的TE缓冲液中(10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4)，分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、5’-CGAACTCTGCAACATAAAAAA-3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；
(2)配制磷酸钾缓冲溶液(200mM K2HPO4-KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.4)，使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；
(3)将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；
(4)配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4，200mM磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7.4，200mM磷酸缓冲溶液，另含400mM NaCl与500μM荧光试剂(Amplex Red)；
(5)：采用五点取样法选取五株小麦，每株选取三个叶片，用孔径为6mm的打孔器于小麦叶片上打孔取样，于靠近叶柄、叶片中部及叶尖处取样。随后将样品放入液氮冷冻。取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟。用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液(10μL左右)，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
(6)向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵,1小时；
(7)向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育1.5小时；
(8)用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据所述标准溶液浓度及信号值绘制标准曲线，如图1，根据样品的信号值从标准曲线上取得样品含量，经公式Y＝471.73+1698.58X计算得出田间小麦每平方厘米叶片中，平均含谷氨酰胺的量为2.97×10-7g。
实施例3
(1)配制溶解所需DNA的TE缓冲液中(10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4)，分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、5’-CGAACTCTGCAACATAAAAAA-3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；
(2)配制磷酸钾缓冲溶液(200mM K2HPO4-KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.4)，使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；
(3)将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；
(4)配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4，200mM磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7.4，200mM磷酸缓冲溶液，另含400mM NaCl与500μM荧光试剂(Amplex Red)；
(5)：采用五点取样法选取五株大豆，每株选取三个叶片，用孔径为6mm的打孔器于大豆叶片上打孔取样，于靠近叶柄、叶片中部及叶尖处取样。随后将样品放入液氮冷冻。取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟。用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液(10μL左右)，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
(6)向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵,1.5小时；
(7)向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育2小时；
(8)用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据所述标准溶液浓度及信号值绘制标准曲线，根据样品的信号值从标准曲线上取得样品含量，经计算田间大豆，每平方厘米叶片中，平均含谷氨酰胺的量为1.98×10-7g。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQENCE LISTING
<110> 苏州健雄职业技术学院
<120> 一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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Claims (10)

1.一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）将富含有鸟嘌呤的单链DNA和富含有腺嘌呤的单链DNA分别溶解于TE缓冲液中，4℃保存，得DNA溶液A和DNA溶液B；
（2）血红素经二甲亚砜溶解后，4℃存放于磷酸钾缓冲溶液，得血红素溶液；
（3）将DNA溶液A与DNA溶液B以及血红素溶液混合，室温静置30-60分钟后得DNA模拟酶溶液，4℃保存；
（4）配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，谷氨酰胺标准溶液和荧光试剂溶液；
（5）待测样品取样后加入酶标板加样孔中，谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
（6）向上述酶标板的加样孔加入谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育0.5-1.5小时；
（7）向上述酶标板的加样孔加入DNA模拟酶溶液和荧光试剂溶液，孵育1-2小时；
（8）用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述富含有鸟嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.1；步骤（1）中所述富含有腺嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述血红素为氯化血红素。
4.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述富含有鸟嘌呤的单链DNA：富含有腺嘌呤的单链DNA：血红素的摩尔比为1:1:2。
5.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述谷氨酰胺合成酶工作溶液中包含以下组分：L-谷氨酰胺、α-酮戊二酸、Mg2+以及谷氨酰胺合成酶。
6.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述谷氨酰胺标准溶液的浓度分别为0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M。
7.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，所述荧光试剂溶液为Amplex Red。
8.根据权利要求1-7任一项所述一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于包含以下具体步骤：
（1）配制溶解所需DNA的TE缓冲液（10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4），分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、 5’- CGAACTCTGCAACATAAAAAA -3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM 的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；
（2）配制磷酸钾缓冲溶液（200mM K2HPO4-KH2PO4，400 mM NaCl，pH 7．4），使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；
（3）将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；
（4）配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4 ，200 mM 磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7．4 ，200 mM磷酸缓冲溶液，另含400 mM NaCl与500μM荧光试剂（Amplex Red）；
（5）取待测样品10μL，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；
（6）向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育1小时；
（7）向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育1.5小时；
（8） 用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。
9.根据权利要求8所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（5）中的取样包含以下详细步骤：采用五点取样法选取五株小麦，每株选取三个叶片，用孔径为6mm的打孔器于小麦叶片上打孔取样，于靠近叶柄、叶片中部及叶尖处取样；随后将样品放入液氮冷冻，取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟，用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液（10µL左右），加入酶标板的小孔中。
10.根据权利要求1-7任一项所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法在植物叶片的谷氨酰胺含量测定中的应用。
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