CN111650167B - 一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法 - Google Patents

一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，将分裂适配体与纳米簇信标相融合制备AgNCs‑Apt1，将AgNCs‑Apt1溶液、富含鸟嘌呤增强子序列的GRS‑Apt2溶液、含有不同浓度目标物的样品分别与Tris‑HCl缓冲液混合反应，记录发射波长下所得样品的荧光强度；绘制关系曲线图，计算目标物分子的浓度与荧光强度之间的关系式；利用关系式计算待测血清样品中的目标物分子浓度。由于银纳米簇具有可调的荧光特性以及分裂适配体对目标物的特异性识别，该传感器可以实现对多种目标物的特异性检测，通过改变适配体序列，可以拓宽该策略的应用范围。本发明具有免标记，无酶，灵敏度高的优点，能够灵敏的检测出生物样品中的目标物含量。

Description

一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目 标物的方法
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，具体为一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法。
背景技术
通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands byexponentialenrichment，SELEX)技术可以在众多核酸序列中筛选出与目标物具有高亲和力的核酸适配体序列，由于这种特异性的识别我们可以检测多种目标物分子，包括小分子氨基酸到大分子蛋白等。在生物传感分析领域中，多数是基于竞争性结合的检测策略，但是这种策略存在着非特异性的干扰，降低最终结果的准确性。根据报道，一些适体可以被分裂成多条短片段，这些短片段仍具有特异性识别目标物的能力。当加入目标检测物时，这些被分裂的适体片段与目标物形成一种夹心型的复合物，这种复合物不会引起构象的改变，可以有效地克服完整适体识别的缺点。
分裂适配体以被广泛应用于构建荧光、比色以及电化学的适体传感领域中。其中基于分裂适体的荧光传感方法具有高灵敏性、便携性以及简易性等优点，但是这种策略往往需要在双链DNA中嵌入具有毒性的荧光染料，所以会产生毒性的担忧。或者是基于依赖于距离的荧光法进行表征，这类方法相对而言可以简化检测步骤以及避免使用带有毒性的荧光染料。DNA-银纳米簇是一种具有高度光稳定性、低毒性以及合成简单等优点的荧光纳米材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用增强检测的灵敏度和准确度的包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物浓度的方法。
具体地，本发明的一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，具体包括如下步骤：
a)制备DNA-银纳米簇信标AgNCs-Apt1：将目标物分子的纳米簇信标模板即分裂适配体1Apt1溶解于Tris-HCl缓冲液中，加热至90-95℃，维持5-15min后迅速转移至冰水浴中，随后加入硝酸银溶液，涡旋混合后避光20-25℃下反应20-40min，接着，迅速加入硼氢化钠溶液，充分振摇混合过夜；目标物分子为腺苷、可卡因、17β-雌二醇、凝血酶中的一种；
b)将1体积的AgNCs-Apt1溶液、1体积的富含鸟嘌呤增强子序列的分裂适配体2GRS-Apt2溶液、2体积含有不同浓度目标物的样品分别与6体积的Tris-HCl缓冲液混合反应；
其中，当目标物分子为腺苷时，AgNCs-Apt1Ade序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCACCTGGGGGAGTAT，GRS-Apt2Ade序列从5’到3’为TGCGGAGGAAGGTGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当目标物分子为凝血酶时，AgNCs-Apt1thrombin序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGGTTGGTG，GRS-Apt2thrombin序列从5’到3’为TGGTTGGGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当目标物分子为可卡因时，AgNCs-Aptcocaine序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACA，GRS-Apt2cocaine序列从5’到3’为GGGAGTCAAGAACGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当目标物分子为17β-雌二醇时，AgNCs-Apt17β-estradiol序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTA，GRS-Apt217β-estradiol序列从5’到3’为GCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG；
c)将步骤b)所得的混合样品溶液在2000-4000rpm下的转速进行离心，接着将其置于20-25℃下孵育，在激发波长为550-570nm下，记录发射波长为610-640nm发射波长下的荧光强度；通过绘制关系曲线图，计算目标物分子的浓度与荧光强度之间的关系式；
d)将健康志愿者的血清样品进行离心，接着加入Tris-HCl缓冲液将血清样品稀释50-100倍后，取10-20μL作为待测目标物样品进行b)、c)步骤操作；
e)将待测目标物样品在发射波长为610-640nm处获得的荧光强度代入步骤c)获得的关系式，计算出血清样品中的目标物分子浓度。
进一步地，步骤b)所述的混合条件为在20-25℃下孵育20-40min。
进一步地，步骤b)所述的含有不同浓度目标物的样品中，腺苷的浓度范围是0-1600nM，可卡因的浓度范围是0-2000nM，17β-雌二醇的浓度范围是0-2000nM，凝血酶的浓度范围是0-2000nM。
进一步地，步骤c)具体为：分别在激发波长为561nm下，测定所得样品在627nm处的荧光强度。
本发明的方法原理如图1所示，可以看出当溶液中没有目标物分子时，NCB对彼此分离。随着目标物的加入，会产生夹心型复合体，激活NCB产生高荧光输出。检测不同浓度目标物分子荧光强度，绘制关系曲线图，可定量目标物分子浓度。
有益效果：与现有技术相比，本发明的荧光传感器高灵敏，检测限达到了皮摩尔的水平。DNA-AgNCs作为荧光探针，具有低成本、强荧光的优点。同时，DNA-AgNCs具有模块化设计的优点，不同序列组成的DNA-AgNCs的荧光物理性质具有显著差异，可根据实际应用选择合适的序列合成DNA-AgNCs，具有通用型强，检测方法简易，成本更低廉的优势。此外，本发明采用简易的纳米簇信标与拆分适配体结合形成夹心型的复合体系可用以构建开启式荧光传感平台。本发明的荧光传感器可用于多种目标物的检测，具有无需额外标记、无酶、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为该方法的原理图；
图2A是基于分裂适配体的夹心型纳米簇信标组装的多功能开启式荧光生物传感方法检测不同浓度的腺苷对应的荧光强度；图2B为基于FRET的传感器对不同浓度下腺苷的荧光变化；图2C为基于分裂适配体的夹心型纳米簇信标组装的多功能开启式荧光生物传感方法的特异性分析；
图3为基于优化后的基于分裂适配体的夹心型纳米簇信标组装的多功能开启式荧光生物传感方法对不同浓度目标物样品的荧光变化。
具体实施方式
药品和试剂：实验中使用的所有DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。分析纯的AgNO3、NaBH4从美国西格玛公司购买而来。
腺苷、可卡因、17β-雌二醇以及凝血酶的分裂适配体的DNA序列如下所示：
Figure GDA0003928995370000041
实施例1
一种目标物分子为腺苷、可卡因、17β-雌二醇或凝血酶的检测方法，包括以下步骤：
(1)DNA-银纳米簇信标AgNCs-Apt1的制备：将Tris 1.21g、800mL的去离子水、42ml0.1moI/L的盐酸定容到1L，配制pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液。将12.5μL的1.2μM的腺苷纳米簇信标模板溶解于940μL缓冲液1中，加热至95℃，维持10min后迅速转移至冰水浴中，快速降温，随后加入45μL，4mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光25℃反应30min，接着，迅速加入7μL，13.2mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合过夜；
(2)配制检测溶液：将10μL的1μM的AgNCs-Apt1溶液、10μL 1μM GRS-Apt2溶液、20μL不同浓度的目标物腺苷溶液以及60μL的Tris-HCl缓冲液进行混合，置于室温下25℃孵育30min。目标物腺苷溶液在0nM-1600nM浓度中选取2nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、250nM、500nM、800nM、1000nM、1200nM、1500nM作为取样点。
(3)目标物的荧光检测：将得到的含有不同浓度目标物的检测溶液进行荧光测定实验。将不同溶液分别置于561nm的激发波长下，然后记录627nm的发射波长下的荧光强度，如图2A、图2B所示。
将(1)中腺苷纳米簇信标模板换成可卡因纳米簇信标模板，目标物溶液在0-2000nM浓度中选取取样点，其他条件不变。
将(1)中腺苷纳米簇信标模板换成17β-雌二醇纳米簇信标模板，目标物溶液在0-2000nM浓度中选取取样点，其他条件不变。
将(1)中腺苷纳米簇信标模板换成凝血酶纳米簇信标模板，目标物溶液在0-2000nM浓度中选取取样点，其他条件不变。
实施例2
本发明检测方法的选择性实验：重复实施实施例1中的步骤，将目标物换成其他目标物分子和目标物分子的类似物，即牛血清白蛋白，溶菌酶，多巴胺，人血清白蛋白，尿苷，鸟嘌呤，胞嘧啶，其它条件不变，检测荧光，得到本方法检测目标物分子的选择性结果图，如图2C所示，从图中可以看出本发明所述方法对目标物分子具有良好的选择性。
实施例3
组装孵育时间的实验
采用腺苷纳米簇信标模，目标物溶液浓度为1000nM，孵育时间在0-60min中选取，统一实验的其他变量，结果如图3所示。
实施例4
本发明检测方法的回收率实验
将样品换成健康人体血清，并向样品中加入相同量的目标物分子，分别进行加样检测，分别添加7、14、21 nM的腺苷，添加60、120、180nM的凝血酶进行检测，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表1。
表1本发明所制备的传感器检测人体血清中腺苷和凝血酶的检测结果
Figure GDA0003928995370000061
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种包含分裂适配体的纳米簇信标型多功能荧光传感器
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccttaatcc ccacctgggg gagtat 26
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcggaggaa ggtgggtggg gtggggtggg g 31
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttaatcc ccggttggtg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggttggggg tggggtgggg tgggg 25
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccttaatcc ccgttcttca atgaagtggg acgaca 36
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagtcaag aacgggtggg gtggggtggg g 31
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccttaatcc ccgcttccag cttattgaat tacacgcaga gggta 45
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggctctgc gcattcaatt gctgcgcgct gaagcgcgga agcgggtggg gtggggtggg 60
g 61

Claims (4)

1.一种利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
a)制备DNA-银纳米簇信标AgNCs-Apt1：将目标物分子的纳米簇信标模板即分裂适配体1Apt1溶解于Tris-HCl缓冲液中，加热至90-95℃，维持5-15min后迅速转移至冰水浴中，随后加入硝酸银溶液，涡旋混合后避光20-25℃下反应20-40min，接着，迅速加入硼氢化钠溶液，充分振摇混合过夜；所述目标物分子为腺苷、可卡因、17β-雌二醇、凝血酶中的一种；
b)将1体积的AgNCs-Apt1溶液、1体积的富含鸟嘌呤增强子序列的分裂适配体2GRS-Apt2溶液、2体积含有不同浓度目标物的样品分别与6体积的Tris-HCl缓冲液混合反应；
其中，当所述目标物分子为腺苷时，AgNCs-Apt1Ade序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCACCTGGGGGAGTAT，GRS-Apt2Ade序列从5’到3’为TGCGGAGGAAGGTGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当所述目标物分子为凝血酶时，AgNCs-Apt1thrombin序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGGTTGGTG，GRS-Apt2thrombin序列从5’到3’为TGGTTGGGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当所述目标物分子为可卡因时，AgNCs-Aptcocaine序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACA，GRS-Apt2cocaine序列从5’到3’为GGGAGTCAAGAACGGGTGGGGTGGGGTGGGG；当所述目标物分子为17β-雌二醇时，AgNCs-Apt17β-estradiol序列从5’到3’为CCCTTAATCCCCGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTA，GRS-Apt217β-estradiol序列从5’到3’为GCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG：
c)将步骤b)所得的样品混合溶液在2000-4000rpm的转速下进行离心，接着将其置于20-25℃下孵育，在激发波长为550-570nm下，记录发射波长为610-640nm下所得样品的荧光强度；通过绘制关系曲线图，计算目标物分子的浓度与荧光强度之间的关系式；
d)将健康志愿者的血清样品进行离心，接着加入Tris-HCl缓冲液将血清样品稀释50-100倍后，取10-20μL作为待测目标物样品进行b)、c)步骤操作；
e)将待测目标物样品在发射波长为610-640nm处获得的荧光强度代入步骤c)获得的关系式，计算出血清样品中的目标物分子浓度。
2.根据权利要求1所述的利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，其特征在于：步骤b)所述的混合条件为在20-25℃下孵育20-40min。
3.根据权利要求1所述的利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，其特征在于：步骤b)所述的含有不同浓度目标物的样品中，腺苷的浓度范围是0-1600nM，可卡因的浓度范围是0-2000nM，17β-雌二醇的浓度范围是0-2000nM，凝血酶的浓度范围是0-2000nM。
4.根据权利要求1所述的利用包含分裂适配体的纳米簇信标型荧光传感器检测目标物的方法，其特征在于：步骤c)具体为：分别在激发波长为561nm下，测定所得样品在627nm处的荧光强度。
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