CN113109305B

CN113109305B - 基于拆分型核酸适配体和硫代黄素t检测atp的方法

Info

Publication number: CN113109305B
Application number: CN202110327169.8A
Authority: CN
Inventors: 刘兴奋; 孙棋; 黄艳琴; 范曲立
Original assignee: Nanjing University of Posts and Telecommunications
Current assignee: Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113109305A

Abstract

本发明公开了一种基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，属于生物传感及分析领域。该方法为：将拆分型适配体Apt‑1和Apt‑2分别加入到Tris‑HCl缓冲溶液Ⅰ中，其序列分别为Apt‑1：SEQ ID NO.1和Apt‑2：SEQ ID NO.2；将Apt‑1和Apt‑2按摩尔比1：1加入到Tris‑HCl缓冲溶液Ⅱ中预处理；向含有ThT和预处理后的拆分型适配体的Tris‑HCl缓冲溶液Ⅱ中，加入含ATP的待测溶液，以440 nm为激发波长，进行荧光检测，当荧光信号增强时，则待测溶液中的ATP浓度增大；其中ThT和预处理后的拆分型适配体的摩尔比为10：1。本发明的方法不仅简便、快速、成本低，而且具有较高的选择性和实用性，在复杂的生物血清中表现出更好的检测性能，灵敏度提高了两个数量级。

Description

基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法

技术领域

本发明属于生物传感及分析领域，具体涉及一种基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测腺苷三磷酸（ATP）的方法。

背景技术

核酸适配体（Aptamer）是一段DNA（脱氧核糖核酸）或RNA（核糖核酸）序列，通常是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX），从核酸分子文库中筛选得到。据报道，核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，并且当核酸适配体与目标物质发生结合时，其自身构型会发生相应的变化。目前为止，已报道了各种目标物质的核酸适配体，包括有机小分子（ATP、四环素）、金属离子（Hg⁺、K⁺、Pb²⁺、Sr²⁺）、蛋白质（肿瘤标志物、凝血酶、干扰素、血管内皮生长因子）、癌细胞和微生物（大肠杆菌）等。由于核酸适配体分子量小、稳定性高、易于化学合成和修饰等优良特性，克服了抗体在检测中的某些不足，越来越多地被提倡用作抗体的替代品。近年来，核酸适配体已在生物分析、细胞成像、药物递送、靶向治疗、食品污染检测等领域被广泛研究和应用。

腺苷三磷酸 (adenosine triphosphate, ATP）是细胞中重要的能量分子，是生命活动能量的直接来源，在调节生命体内各种代谢过程和生化反应中起着重要的作用。例如，DNA合成与复制、激素和神经元的活动与影响以及细胞正常呼吸的维持等。研究表明，ATP代谢异常可导致低血糖症、心血管疾病和某些神经退行性疾病。因此，实现ATP的高灵敏检测对于疾病的诊断和研究具有重要的意义。1995年，Huizenga和Szostak共同筛选出了ATP的核酸适配体DNA片段，该片段由富含鸟嘌呤（guanine, G）的27个碱基组成，解离常数（Kd）值为6±3 μM，表明该核酸适配体与ATP之间具有较高的亲和力。这种富含串联重复G序列的DNA可以形成G4片层，由Hoogsteen氢键连接4个G构成单个G4片层，两个或多个G4片层可以通过π-π作用形成G四链体结构。G-四链体可以在一条富含G的DNA链中形成，也可以在两个或多个富含G的DNA分子之间形成。迄今为止，已经研究出了许多用于ATP检测的方法，如电化学、荧光、比色、化学发光、场效应晶体管等。然而，完整的适配体易于形成链内或链间二级结构，在一定程度上影响其与ATP的结合。为了解决这一问题并提高检测灵敏度，拆分型核酸适配体近年来受到广泛关注。通过合理地拆分完整的适配体可以得到两条或两条以上更短的适配体，构建与完整的适配体相似或完全不同的传感策略，从而克服了完整适配体在应用中的不足。在生物分子的光学检测中，“turn-off”模式的光学方法由于引起荧光猝灭的因素较多，常常会出现假阳性信号，导致检测的特异性较低，在许多复杂的生物体系中的使用受到限制。

发明内容

解决的技术问题：本发明要解决的技术问题是针对“turn-off”检测方法存在的不足，提供一种基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法。本发明构建了一种“turn-on”模式的方法，该方法可以改善“turn-off”特异性较低的缺点，提高检测准确性；并且构建了可以在复杂体系中检测ATP的方法，其在稀释血清体系中的灵敏度与缓冲溶液中相比提高了2个数量级。

在本发明的研究中，以“turn-on”模式的荧光检测为主要分析手段，以硫代黄素T荧光染料为信号报告基团，以无标记的ATP拆分型适配体作为识别元件，并在两个分裂适配体片段的一处末端修饰了富含GGG的DNA序列作为信号放大器。实现了复杂体系中ATP的快速、灵敏、无标记检测，为该领域今后的发展提供有价值的理论和实验依据。

技术方案：基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，所述方法包括步骤如下：

a.适配体配制：将拆分型适配体Apt-1和Apt-2分别加入到Tris-HCl缓冲溶液Ⅰ中，所述拆分型适配体的序列分别为Apt-1：SEQ ID NO.1和Apt-2：SEQ ID NO.2；

b.预处理：将步骤a所述的拆分型适配体Apt-1和Apt-2按摩尔比1：1加入到Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ中，90~95℃加热5~10分钟，再置于冰上孵育10~15分钟；

c.荧光检测：向含有硫代黄素T和步骤b中预处理后的拆分型适配体的Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ中，加入含ATP 的待测溶液，以440 nm为激发波长，进行荧光检测，当荧光信号增强时，则待测溶液中的ATP浓度增大；其中所述硫代黄素T和步骤b中预处理后的拆分型适配体的摩尔比为10：1。

优选的，所述步骤a中的Tris-HCl缓冲溶液Ⅰ的组成为10 mM Tris-HCl, pH 8.0。

优选的，所述步骤c中的拆分型适配体Apt-1和Apt-2的浓度均为0.1 μM。

优选的，所述步骤c中硫代黄素T作为荧光染料，浓度为1 μM。

优选的，所述步骤c的反应条件为36~38℃，50~60分钟。

优选的，所述步骤c中的待测溶液为Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ或血清溶液。

进一步的，当所述步骤c中的待测溶液为Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ时，ATP的检测浓度范围为50~1000 μM，检测线性浓度上限为500 μM。

进一步的，当所述步骤c中的待测溶液为血清溶液时，ATP的检测浓度范围为1~40μM ，检测线性浓度上限为15 μM。

优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ的组成为5 mM MgCl₂，15 mM KCl，100 mMNaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4。

有益效果：利用本发明所述的拆分型核酸适配体进行ATP荧光检测的方法，可实现对ATP的“turn-on”模式的光学检测。当用于检测稀释血清体系中的ATP时，灵敏度提高了2个数量级。本发明的方法有望为实际临床样品中ATP的检测提供一种简便、快速的方法。

附图说明

图 1为本发明利用拆分型适配体检测ATP的工作原理图；

图 2为本发明利用拆分型适配体检测ATP的可行性分析图；

图 3为本发明利用拆分型适配体检测ATP的特异性分析图；

图 4为本发明利用拆分型适配体检测缓冲溶液中ATP的灵敏度分析图；

图 5为本发明利用拆分型适配体检测10%血清体系中ATP的灵敏度分析图。

具体实施方式

本发明将拆分型核酸适配体和荧光染料硫代黄素T（thioflavin T, ThT）相结合，构建用于腺苷三磷酸 (adenosine triphosphate, ATP）检测的一种“turn-on”模式的光学方法。将富含G序列修饰到两个分裂的ATP适配体片段的末端，ThT可诱导富G的DNA序列形成G-四链体并嵌入其中发光。不存在ATP时，Apt-1、Apt-2分别与ThT结合形成分子内G-四链体；有ATP存在时，由于适配体与ATP之间亲和力更高，可以形成由Apt-1、Apt-2和ATP构成的分子间G-四链体，并嵌入更多ThT分子，荧光显著增强。该方法不仅简便、快速、成本低，而且具有较高的选择性和实用性。与缓冲溶液中的ATP检测相比，它在复杂的生物血清中表现出更好的检测性能，灵敏度提高了两个数量级。

下面结合附图和实施例进一步说明本发明。

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

荧光检测所用的仪器为Shimadzu RF-6000荧光分光光度计（岛津公司，日本）。荧光光谱的测量条件：氙灯激发，激发波长为440 nm，扫描范围为460~600 nm，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm。使用最大体积为600 µL的石英比色皿进行测量，样品总体积为400 µL。所有样品的测定均在室温下进行。

本发明实施例中所用的寡核苷酸均购自生工生物工程技术有限公司（上海，中国），所使用的ATP的拆分型适配体序列为

Apt-1：5’- GGG CTG GGT ATG TCT TTA CCT GGG GGA GTA T -3'，

Apt-2：5’- TGC GGA GGA AGG TTT TGA CAT GGG TAG GG -3'。

腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP）、尿苷三磷酸（uridinetriphosphate,UTP）、胞苷三磷酸（cytidine triphosphate, CTP）、鸟苷三磷酸（guanosinetriphosphate, GTP）和脱氧核苷酸混合物（dNTPs，25 mM）均购自生工生物工程股份有限公司。

硫代黄素T（3，6-二甲基-2-（4-二甲基氨基苯基）苯并噻唑鎓阳离子）购自上海领潮生物科技有限公司。胎牛血清（Gibco）购自KeyGen生物有限公司（南京，中国）。

所有缓冲溶液均使用Milli-Q水（18.2 MΩ.cm）制备。实验中所使用的ATP的拆分型适配体均由缓冲溶液I （10 mM Tris-HCl, pH 8.0）配制和稀释。缓冲溶液II（5 mMMgCl₂, 15 mM KCl, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4）用于ATP、适配体和ThT之间的反应及后续的荧光检测。

实施例1：ATP检测的可行性分析

1) DNA预处理:为去除ATP适配体的二级结构，在使用前对适配体进行预处理。首先将体积均为4 µL ，浓度均为10 µM 的Apt-1和Apt-2与42 µL缓冲溶液II在90~95℃加热5~10分钟，然后置于冰上孵育10~15分钟。

2) 在预处理的含Apt-1和Apt-2溶液中分别加入4 µL浓度为100 µM 的ThT溶液，在36~38℃下反应50~60分钟。一组作为空白对照，另一组加入4 µL浓度为100 mM的ATP作为阳性对照。

如图2所示，空白组有较弱荧光，阳性对照组具有明显的荧光增强信号，大约增强了2倍，充分表明了该方案的可行性。

实施例2：ATP检测的特异性分析

向预处理的含Apt-1和Apt-2溶液中分别加入4 µL浓度为100 mM 的ATP、GTP、CTP、UTP 和dNTPs，然后再加入4 µL浓度为100 µM 的ThT溶液，最后添加缓冲溶液Ⅱ至溶液总体积为100 µL后在36~38℃下反应50~60分钟。只含有Apt-1、Apt-2和ThT的样品作为空白对照。

如图3所示，空白、GTP、CTP和UTP体系的荧光强度都比较弱。与加入ATP的体系相似，加入dNTPs后的体系荧光强度也明显增强，这是由于dNTPs中除了含有ATP的类似物以外，也含有相同浓度的ATP，因此具有显著的荧光响应，结果表明该方法具有良好的特异性。

实施例3：ATP检测的灵敏度分析

向预处理的含Apt-1和Apt-2溶液中分别加入不同体积（0、0.2、0.4、0.5、2、3、4 µL，100 mM）的ATP溶液，然后加入4 µL浓度为100 µM 的ThT溶液，最后添加缓冲溶液Ⅱ至溶液总体积为100 µL后在36~38℃下反应50~60分钟。

如图4所示，随着ATP的浓度在0~1000 µM 范围的逐渐增加，荧光信号强度也逐渐增强。而且，在ATP浓度为0~500 µM范围内，荧光信号强度与ATP浓度之间具有良好的线性关系，其线性回归方程为y=0.66x+364.38（R²=0.96398），其中y代表荧光强度值，x代表体系中ATP的浓度（µM）。根据3σ规则，计算得出缓冲溶液体系中ATP的检测限（limit ofdetection, LOD）为220 µM。

实施例4：在10%血清中检测ATP的灵敏度分析

向预处理的含Apt-1和Apt-2溶液中分别加入不同体积（0、0.2、1、2、3、4、5、6、7、8µL，2 mM）的含10%血清的的ATP溶液，然后加入4 µL浓度为100 µM 的ThT溶液和88 µL含10%血清的缓冲溶液II。

如图5所示，在15~40 μM 浓度范围内时，荧光基本趋于稳定；而在0~15 µM范围内，荧光强度与ATP浓度之间具有较好的线性关系，其回归方程为y=17.27x+434.56（R² =0.93582），其中y代表荧光强度，x代表ATP的浓度（µM）。根据3σ原则，计算得出对血清中ATP的检测限为2.2 µM。与缓冲溶液中相比，灵敏度提高了2个数量级。原因可能是血清中的Na⁺、K⁺及凝血酶的存在使形成的G-四链体更稳定，因而具有更高的灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京邮电大学

<120> 基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggctgggta tgtctttacc tgggggagta t 31

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcggaggaa ggttttgaca tgggtaggg 29

Claims

1.基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，所述方法包括步骤如下：

c.荧光检测：向含有硫代黄素T和步骤b中预处理后的拆分型适配体的Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ中，加入含ATP 的待测溶液，以440 nm为激发波长，进行荧光检测，当荧光信号增强时，则待测溶液中的ATP浓度增大；其中所述硫代黄素T和步骤b中预处理后的拆分型适配体的摩尔比为10：1；拆分型适配体Apt-1和Apt-2的浓度均为0.1 μM，硫代黄素T作为荧光染料，浓度为1 μM。

2.根据权利要求1所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，所述步骤a中的Tris-HCl缓冲溶液Ⅰ的组成为10 mM Tris-HCl, pH 8.0。

3.根据权利要求1所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，所述步骤c的反应条件为36~38℃，50~60分钟。

4.根据权利要求1所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，所述步骤c中的待测溶液为Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ或血清溶液。

5.根据权利要求4所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，当所述步骤c中的待测溶液为Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ时，ATP的检测浓度范围为50~1000μM，检测线性浓度上限为500 μM。

6.根据权利要求4所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，当所述步骤c中的待测溶液为血清溶液时，ATP的检测浓度范围为1~40 μM ，检测线性浓度上限为15 μM。

7.根据权利要求1或4所述的基于拆分型核酸适配体和硫代黄素T检测ATP的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ的组成为5 mM MgCl₂，15 mM KCl，100 mM NaCl，20 mMTris-HCl，pH 7.4。