CN105928917A - 一种银纳米簇传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种银纳米簇传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种银纳米簇传感器及其制备方法和应用，该传感器为DNA荧光传感器，所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3'端修饰有猝灭剂。其制备方法包括设计多功能DNA序列、形成分子信标型DNA序列和制备银纳米簇传感器三个步骤。该传感器可用于DNA生物传感如检测基因序列，还可应用于适配体传感如检测小分子物质和大分子物质。本发明的银纳米簇传感器仅仅在识别待测物后，原本熄灭的信号才被激活，从而进行可激活荧光检测，以免去洗涤步骤并提高检测的灵敏度。

Description

一种银纳米簇传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种以DNA为模板的银纳米簇传感器及其制备方法和应用。
背景技术
DNA生物传感器是目前生物传感器中报道最多的一种，其中，由于荧光分析法的诸多优点而使荧光生物传感器的应用又最为广泛。荧光生物传感器是将探针DNA进行荧光标记或与荧光物质结合，当探针与目标物质作用时荧光信号发生变化，将识别信息转换为可检测的荧光信号，从而实现对目标物质的分析。近年来，荧光生物传感器的研宄内容主要集中对特定基因序列、蛋白质、药物、小分子、无机离子等目标分析物的存在和含量进行定性、定量分析。
用于荧光传感器经常被用于物质的检测，大多基于猝灭机制而构建，存在假阳性信号干扰，影响了检测的准确性。为了解决该问题，科研工作者发展增强型传感器，是在原有较弱荧光信号的基础上产生更强的荧光信号，在一定程度上弥补了荧光减弱型传感器的假阳性缺陷。以上两类传感器均属于常亮型传感器，但由于传感器本身具有荧光信号，检测过程中往往需要多步洗涤以除去未结合探针，增加了实验的操作步骤，并降低检测的灵敏度。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是克服现有常亮型荧光传感器存在的繁琐操作、灵敏不高的缺陷，提出一种激活型银纳米簇传感器，该传感器仅仅在识别待测物后，原本熄灭的信号才被激活，从而进行可激活荧光检测，以免去洗涤步骤并提高检测的灵敏度。
技术方案：
一种银纳米簇传感器，该传感器为DNA荧光传感器，所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3'端修饰有猝灭剂。
所述银纳米簇传感器的粒径为1～2nm。
所述的银纳米簇传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，设计多功能DNA序列，该多功能DNA序列从5'端到3'端依次为银纳米簇的模板序列、识别序列及其部分互补序列，在3'末端修饰有猝灭剂；
步骤2，形成分子信标型DNA序列，将步骤1的多功能DNA序列进行热变性并退火，即得；
步骤3，制备银纳米簇传感器，以步骤2所得分子信标型DNA序列作为稳定剂，依次加入硝酸银和硼氢化钠发生还原反应，得到银纳米簇传感器。
进一步地，步骤3中多功能DNA序列、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1 : 6 : 6。
所述的银纳米簇传感器在DNA生物传感中的应用。
所述的银纳米簇传感器在适配体传感中的应用。
有益效果：
1. 本发明的激活型银纳米簇传感器仅仅在识别待测物后，原本熄灭的信号才被激活，从而进行激活型荧光检测，以免去洗涤步骤并提高检测的灵敏度；
2. 本发明的激活型银纳米簇传感器能够特异性检测多种靶标如基因序列、小分子物质和大分子物质；
3.本发明的激活型银纳米簇传感器能够推广并应用于细胞成像及活体成像领域。
附图说明
图1为实施例1的银纳米簇传感器的合成路线及检测多种靶标示意图；
图2为实施例1中未修饰猝灭剂的分子信标型DNA序列银纳米簇传感器的荧光光谱图；
图3为实施例1的银纳米簇传感器的透射电镜表征图片；
图4为实施例2中在银纳米簇传感器中加入不同浓度p53基因后传感器的发射光谱图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
所用溶液的准备：
称取0.1052g 柠檬酸氢二钠和0.47056g柠檬酸三钠，用超纯水定容至100mL，调节溶液pH为7，即得20 mM柠檬酸缓冲溶液。将0.1698g AgNO3溶解于100mL超纯水中配置成浓度为10mM的AgNO3工作溶液；称取0.0378g NaBH4溶解于100mL水中配制成浓度为10mM的NaBH4工作溶液；将DNA链溶解于柠檬酸缓冲溶液(20 mM, pH7)中，配制成100μM储备液。
银纳米簇传感器的制备：
步骤1，多功能DNA序列设计
多功能DNA序列包含三部分，如图1所示，从5'端到3'端依次为银纳米簇的模板序列（功能片段I）、p53基因的互补序列（识别序列，功能片段II）、与识别序列5'端序列部分互补的6碱基序列（功能片段III），3'末端修饰有猝灭剂BHQ1分子。具体序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤2，制备分子信标型DNA序列
在1.5mL规格离心管中加入500µL柠檬酸缓冲溶液(20mM, pH7)，取90 µL多功能DNA序列(100µM)，混合均匀，放入95°C水浴锅使之变性10分钟，快速放入冰水浴中使之保持1小时，由于识别序列与部分互补序列发生特异性杂交，在上述条件下形成分子信标型DNA序列，5'端为银纳米簇模板序列，3'端为猝灭剂BHQ1分子。
步骤3，制备银纳米簇传感器
以形成的发夹型DNA序列作为稳定剂，放入冰水浴中保持10分钟，加入5.4µL硝酸银工作溶液震荡2分钟使之混合均匀，避光放入冰水浴中继续冰浴15分钟；加入5.4µL新鲜制备的硼氢化钠工作溶液，快速混匀使之反应5分钟，避光放入4°C冰箱保存使之过夜，得到激活型分子信标型银纳米簇。实验中反应物摩尔比DNA模板：硝酸银：硼氢化钠 = 1 : 6 : 6。为了确定产物的激发波长和发射波长，以未修饰猝灭剂BHQ1的分子信标型多功能DNA序列作为稳定剂，按照同样的过程制备出常亮型分子信标型银纳米簇。如图2所示，制备的分子信标型银纳米簇在445nm激发下，于520nm波长处有一荧光峰。制备的分子信标型银纳米簇的透射电镜表征如图3，该银纳米簇的粒径为2 nm，形状规则均一。
实施例2 银纳米簇传感器基于荧光增强检测p53基因
(1) 取100µL实施例1制备得到的银纳米簇传感器溶液到离心管中，加入不同浓度的p53基因序列（如SEQ ID NO.2 所示），混合均匀至少5分钟，设定激发波长为445 nm，监测其在520 nm波长处的荧光强度，记为F。同时设置对照组，即以3’端未修饰猝灭剂分子的多功能DNA链为模板，按照同样的制备方法进行合成，并用445 nm波长光激发，测定520 nm波长处的荧光强度，记为F0。
(2) 加入靶标基因后，p53基因与传感器的分子信标环状区的识别序列发生特异性结合，形成双链DNA，打开发夹结构，使银纳米簇远离荧光猝灭分子，激活传感器荧光信号并逐渐增强（图1），根据加入不同浓度p53基因标准品溶液后荧光强度的变化值 (F-F0) (图4)，计算出加入p53基因前后基于分子信标银纳米簇探针的荧光强度变化值与p53基因浓度的线性关系，并绘制标准曲线，检测限低至2 nM，线性范围为10～1000 nM。而常亮型银纳米簇传感器的检测限>10nM。
(3) 将待测样品加入基于分子信标型银纳米簇传感器溶液前后，在445 nm波长光的激发下，测试其在520 nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤2得到的线性关系，计算出待测样品中p53基因的浓度。
实施例3 银纳米簇传感器用于适配体传感
将识别序列设为小分子物质ATP或生物大分子物质Thrombin的适配体，所用多功能DNA序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4 所示，制备出ATP靶向或者Thrombin靶向激活型分子信标型银纳米簇，按照类似的过程用于荧光增强检测ATP和Thrombin，检测限分别为0.2 μM 和0.2 nM，线性范围依次为1～15μM和1～1500nM。常亮型银纳米簇传感器对二者的检测限分别为>10μM和>20nM。
序列表
<110> 盐城工学院
<120> 一种银纳米簇传感器及其制备方法和应用
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctttaacc ccttgtgcct gtcctgggag agaccggcgc acgcacaa 48
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgcgccggt ctctcccagg acaggcacaa 30
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctttaacc cctacctggg ggagtattgc ggaggaaggt tcccccagg 49
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccctttaacc cctaggttgg tgtggttggt gtggttggac accaacc 47

Claims (6)

1.一种银纳米簇传感器，该传感器为DNA荧光传感器，其特征在于：所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3'端修饰有猝灭剂。
2.根据权利要求1所述的银纳米簇传感器，其特征在于：该银纳米簇传感器的粒径为1～2nm。
3.权利要求1所述的银纳米簇传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，设计多功能DNA序列，该多功能DNA序列从5'端到3'端依次为银纳米簇的模板序列、识别序列及其部分互补序列，在3'末端修饰有猝灭剂；
步骤2，形成分子信标型DNA序列，将步骤1的多功能DNA序列进行热变性并退火，即得；
步骤3，制备银纳米簇传感器，以步骤2所得分子信标型DNA序列作为稳定剂，依次加入硝酸银和硼氢化钠发生还原反应，得到银纳米簇传感器。
4.根据权利要求3所述的银纳米簇传感器的制备方法，其特征在于：步骤3中多功能DNA序列、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1 : 6 : 6。
5.权利要求1所述的银纳米簇传感器在DNA生物传感中的应用。
6.权利要求1所述的银纳米簇传感器在适配体传感中的应用。
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