CN101603077A - 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通用分子信标核酸探针及其检测DNA的方法。该分子信标的环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列为一通用序列，与一通用序列引物的5，端互补，而该引物的3’端含有与目标DNA特异结合的序列。在实时荧光PCR反应体系中加入通用分子信标核酸探针，用通用序列引物和反向引物对待测样品进行PCR反应，并在PCR扩增热循环中，每次延伸之后降温至25℃检测荧光信号，可根据荧光信号的变化对待测样品进行DNA定性和/或定量分析。该方法可通用、低廉、灵敏、准确地应用于各种基因检测体系，不仅操作方便，而且费用大大降低，对于各种疾病早期检测、疗效评价、人群普查及遗传分析等均有很高的实用价值。

Description

一种通用分子信标核酸探针及其检测DNA的方法

技术领域

本发明涉及DNA分析检测领域，更具体地，涉及一种通过使用通用分子信标核酸探针检测DNA的方法。

背景技术

基因检测可以做到疾病的早知道、早预防、早治疗。因此临床基因检测受到了广泛地重视，为了满足快速准确地检测和/或定量感染物(如病毒、细菌等)中，以及正常和不正常基因中的突变的基因序列，大量的基因检测技术正在不断的发展和完善。这些DNA检测不仅在疾病控制和治疗中有重要的意义，还在群体遗传学、药物开发、法学、癌症和食品安全等研究领域有着很重要的意义。

实现DNA定量及序列突变检测，最常用的是核酸探针技术，其中分子信标(MolecularBeacon)核酸探针应用最为广泛。分子信标是呈发夹结构的短链DNA，一端标记荧光基团，一端标记淬灭基团，其呈茎环闭合结构时不释放荧光，茎环结构打开，释放荧光。在对DNA进行检测和/或定量时，一般采用分子信标结合实时荧光定量聚合酶链式反应技术(Real-time PCR)。该方法中，分子信标根据目标DNA的序列进行设计和优化，分子信标探针在游离状态下是茎环闭合结构，不释放荧光，在扩增反应的退火步骤，分子信标与目标序列杂交，特异性结合形成双链，茎环结构打开，释放荧光，随着扩增反应进行，荧光信号增强，从而实现对目标DNA的检测。尽管这个技术是检测和鉴别样品中目标DNA分析的有力工具，但是所采用的分子信标都是目标序列特异性的，对于不同的体系都要根据目标物重新设计分子信标，重新优化分子信标序列，优化反应条件，这些问题限制了其在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性，而且检测费用昂贵。最困难的问题之一是，在不同实验室的检测体系选用的分子信标探针序列不一样，检测和定量的条件不同，不利于测试步骤的标准化。

因此，本领域迫切需要开发普及性高、易用、灵敏、低廉、准确地检测和/或定量DNA的分析技术。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的局限性，提供一种可用于检测和/或定量DNA分析的易用、灵敏、低廉、准确的分析技术。

本发明的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了一种通用分子信标核酸探针，探针5’端标记荧光基团(比如FAM，TET，HEX，ROX，CY5，TAMRA)，3’端标记淬灭基团(如DABCYL)，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构，荧光淬灭，环部15-30个碱基，茎部4-7对互补碱基，其中环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列为一通用序列，当探针与该通用序列的互补序列结合时，茎环结构打开，释放荧光。

上述通用分子探针的环部优选为十个AG的重复序列，5’端茎部序列优选为5’-CCGGG-3’。上面所列举的各荧光基团和淬灭基团的中英文全称见表1。

表1.分子信标5’和3’的荧光基团和淬灭基团标记的中英文全称

缩写	英文全称	中文名
			FAM	6-carboxy-fluorescein；494；518green	6-羧基荧光素
TET	5-tetrachloro-fluorescein 521；538orange	5-四氯荧光素
			HEX	5-hexachloro-fluorescein 535；553；pink	5-六氯荧光素
ROX	6-carboxy-x-rhodamine；587；607；red	6-羧基罗丹明x
			CY5	Indodicarbocyanine；643；667；violet	N，N′-对羧苄基吲哚三菁
TAMRA	tetramethyl-6-carboxyrhodamine；560；582；rose	6-羧基四甲基罗丹明
			DABCYL	4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoic acid	4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测DNA的通用DNA杂交对，所述杂交对包括上述的通用分子信标和一通用序列引物，该通用序列引物又包括：

(a)通用区，该通用区位于通用序列引物的5’端并且与通用分子信标核酸探针中的通用序列互补；

(b)特异结合区，该特异结合区位于通用序列引物3’端，用于与目标序列特异性结合。

在本发明的第三方面，提供了一种DNA定性和/或定量检测方法，是在实时荧光PCR反应体系中加入通用分子信标核酸探针，用正反向引物对待测样品进行PCR反应，并在PCR的每个扩增热循环中，延伸之后降温至25℃检测荧光信号，根据荧光信号的变化对待测样品进行DNA定性和/或定量分析，其中：

所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团(比如FAM，TET，HEX，ROX，CY5，TAMRA)，3’端标记淬灭基团(如DABCYL)，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构，荧光淬灭，环部15-30个碱基，茎部4-7对互补碱基，其中环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列为一通用序列；

所述正反向引物特异性结合于目标DNA，其中之一为通用序列引物，它包括：(a)通用区，该通用区位于通用序列引物的5’端，并且与通用分子信标核酸探针中的通用序列互补；(b)特异结合区，该特异结合区位于通用序列引物3’端，用于与目标DNA特异性结合。通用分子信标核酸探针与通用序列引物结合的T_m值应高于通用序列引物与目标DNA结合的T_m值。

当所述分子信标核酸探针与通用序列引物特异性结合时释放荧光，当分子信标核酸探针被反向延伸产物取代下来时荧光淬灭，从而在PCR循环过程中产生可检测的信号。

在本发明的通用序列引物中，对所述的特异结合区的长度没有特别限制，通常长度为5-25bp；对于通用区的长度一般为25bp左右。通用分子信标核酸探针与通用序列引物杂交可以有三种情况：环部和5’茎部，环部和两端茎部，或者仅环部与通用序列引物结合。通用分子信标核酸探针与通用序列引物结合的T_m值通常比通用序列引物与目标DNA结合的T_m值高出2-20℃，较佳的高出5-12℃。

在本发明的实时荧光PCR反应体系中，通用分子信标、通用序列引物和反向引物的数量关系较佳的是通用分子信标的数量等于通用序列引物的数量，而反向引物的数量大于通用序列引物的数量，三者最佳的比例为1∶1∶1.6。这样，在反应体系中，通用分子信标处于与通用序列引物结合的状态，且在扩增反应中能完全的被反向引物延伸片段取代下来。

在本发明对目标DNA检测体系中，通用序列引物和反向引物序列要进行优化，不要出现大于4bp的二聚体的形成，而且通用序列引物自身3’端不能形成大于4bp的自杂交的茎环结构，这样就可以避免假阳性的现象。

在本发明对DNA检测的方法中，PCR每个扩增热循环中都有25℃降温的步骤，并在该步检测荧光信号，这样可以保证通用分子信标被取代后较好的恢复茎环结构，荧光淬灭效率高。

本发明的DNA检测方法可应用于DNA点突变(包括单核苷酸多态性位点)的检测和DNA序列分析。在本发明对DNA点突变的检测体系中，DNA聚合酶(Vent 3-exo^-DNA聚合酶)的数量对点突变准确性检测有较大的影响，在50μL的反应体系中，一般来说在1-1.8U情况下，区分G，A，T的碱基的匹配和错配情况较好，更佳地为1U，这样，在反应体系中，DNA聚合酶就能在更大程度上发挥识别匹配和错配的差异性的功能。

在本发明中，选用的DNA聚合酶必须具有链取代活性，而且没有3’外切活性，这样才可以实现对通用分子信标的取代并保证分子信标的完整性。

在本发明中，对待测DNA样品没有限制，病毒DNA、癌症样品DNA、微生物DNA、转基因DNA等都可用本发明的方法进行检测。

在本发明中，对于PCR反应引物对扩增的目标序列长度没有特别的限制。按照通用序列引物和反向引物的特异结合区的3’端在模板上的距离表示，通常为1bp-10kb，较佳的为20bp-2kb。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。

“目标物”：待直接或间接检测的分析物，主要是DNA。

“模板”：能够被DNA聚合酶扩增的DNA分子的全长或部分序列。

“通用序列引物”：通用序列引物是合成的寡核苷酸序列，其3’端是特异结合区，通用序列引物该结合区与目标DNA结合延伸扩增；通用区位于5’端，与通用分子信标结合。通用序列引物可以用本领域技术人员已知的各种方法合成。

“通用分子信标(Universal molecular beacon，U-MB)”：是一种茎环结构的寡核苷酸片段，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，所述的分子信标在下列两种情况下状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于通用序列引物的通用区部分，(ii)分子信标被核酸聚合酶作用产物片段延伸取代下来。

本发明所公开的方法原则上归为引物扩增取代分子信标的反应，其关键是使用通用适合的DNA杂交序列对作为分子信标探针和引物的互补通用序列，该方法可灵敏、准确和标准化地对目标DNA分子进行定性和/或定量检测，可应用于各种基因检测体系，不仅操作方便，而且费用也大大降低，特别是对于各种疾病早期检测、疗效评价、人群普查及遗传分析等均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)通用性，本发明创造性地建立了实时荧光PCR通用型DNA检测体系，通过将PCR反应中的一条引物带上通用区与分子信标特异性结合，实现了分子信标与目标检测体系没有序列相关性，而又可以做为指示信号进行扩增反应的检测。该体系为临床样品的检测结果可比性提供依据。

(2)高准确性，该体系分子信标与通用序列引物特异性结合，特别是5’茎部也与通用序列引物的通用区结合的情况，比常规的分子信标实时荧光PCR体系的结合更加稳定，而且能减少与目标序列的非特异性结合，减少假阳性现象。

(3)简化检测，现有技术中，不同检测体系的反应最佳条件各不相同，因此，优化检测条件步骤繁琐，费用高，使用本发明，更换检测体系不需要重新优化分子信标及引物浓度，便于对大量不同体系进行DNA检测，而且可实现各PCR反应体系条件标准化，从而实现在一管中对多种目标的检测。

(4)降低成本，在现有实时荧光PCR技术中，对于不同检测体系都有特异的分子信标探针，而在本发明中，不同的目标体系只需一种分子信标探针，因此，大大降低设计、合成成本。

附图说明

图1是本发明的通用序列引物与通用分子信标核酸探针结合的结构示意图。

图2是本发明的DNA检测PCR热循环流程示意图。

图3是本发明的一种DNA点突变检测方法的步骤示意图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1、用通用分子信标、通用序列引物和等位基因特异性反向引物进行DNA点突变分析

在该例子中，实时荧光PCR反应体系中使用了通用分子信标探针(U-MB)、通用序列引物和四个等位基因特异性引物(只有3’末端碱基不同，分别为C\T\A\G)，在该例子中待检测的样品是DNA。PCR热循环流程例如图2所示，反应步骤参见图3。

步骤1：将引物对、通用分子信标和待测样品置于反应体系中，然后在合适的条件下发生退火(或杂交)，即通用分子信标与通用序列引物的通用区结合，通用序列引物的3’端的特异结合区及反向引物结合于目标DNA。

步骤2：在DNA聚合酶的作用下，引物发生延伸反应，形成DNA/DNA双链，带通用区的引物延伸后变成下一个循环的反应模板分子。

步骤3：形成的双链DNA变性，形成单链带有通用序列的互补序列的新模板。

步骤4：在合适条件下，通用分子信标与新模板上的通用序列互补序列结合，反向引物结合于新DNA模板的互补区域。

步骤5：在DNA聚合酶的作用下，会发生2种情况：

(1)发生延伸反应；

(2)不发生延伸反应。

在第一种情况下，等位基因特异性反向引物3’端与目标点匹配互补，发生延伸反应，遇到通用分子信标探针后将其取代下来，形成新的双链DNA。第二种情况则是等位基因特异性反向引物3’端与目标点不匹配，不发生延伸反应，或者延伸效率低。

步骤6：匹配体系，在通用分子信标被取代后，降温至25℃检测荧光强度，分子信标恢复茎环结构，荧光淬灭，从而产生可检测信号。不匹配体系，分子信标没有被取代，荧光强度基本不变或荧光下降较匹配体系有滞后现象。

步骤7：重复步骤4，5和6。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因通用分子信标被取代恢复茎环结构产生的可检测信号也是成指数级下降的。荧光信号用实时荧光PCR仪Strategene 3000p进行检测。

一个具体应用上述方法检测DNA点突变的例子是：

<乳腺癌p53抑癌基因点突变G→A检测>

在该实施例中，通用分子信标、通用序列引物和四个反向等位基因特异性引物的序列如下：

通用分子信标为：5’-FAM-CCGGG(AG)₁₀CCCGG-DABCYL-3’(SEQ ID No.1)

通用序列引物为：5’-(CT)₁₀CCGGGGTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3’(SEQ ID No.2)

四个反向等位基因特异性引物：5’-GTGGCTCCTGACCTGGAGTN-3’，N＝C，T，A，G(SEQ ID No.3、4、5、6)

50μL反应体系：通用序列引物100nM，反向等位基因特异性引物160nM，通用分子信标100nM；DNA聚合酶(VentR(exo-)DNA聚合酶)1U，0.4mM dNTPs，6μL(含0.5μg左右目标DNA)乳腺癌组织样品DNA提取液

PCR方案是：94℃预热10min，然后进行40个循环的扩增反应：94℃变性50s，退火50℃1min，72℃延伸1min，降温至25℃1min检测荧光信号。定义C_dt为荧光淬灭5％时对应的循环数。

3个阴性对照样分别为：不含组织提取DNA的体系，不含反向等位基因特异性引物的体系、不含通用序列引物的体系。

检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Strategene 3000p，激发光源为石英卤钨灯，波长为492nm。

检测结果：用上述引物及相应的通用分子信标探针在Strategene 3000p进行扩增。野生型样品对应的等位基因特异性引物3’端为C时在不同循环C_dt出现荧光下降信号，突变型样品对应的等位基因特异性引物3’端为T时在不同循环C_dt(15至30个循环)出现荧光下降信号，杂合型则等位基因特异性引物3’端为C和T时在不同循环C_dt(15至30个循环)出现荧光下降信号，而阴性对照样品及等位基因特异性引物3’端为G和A的体系下在扩增结束时(C_dt＞40)均未出现荧光下降信号。

实施例2<检测HBV病毒DNA>

在该实施例中，通用序列引物、通用分子信标和反向引物的序列如下：

通用分子信标为：5’-FAM-CCGGG(AG)₁₀CCCGG-DABCYL-3’(SEQ ID No.1)

通用序列引物为：5’-(CT)₁₀CCGGGAGTTGGGGGAGGAGATTAG-3’(SEQ ID No.7)

反向引物：5’-GAAGTCAGAAGGCAAAAACG-3’(SEQ ID No.8)

50μL反应体系：通用序列引物100nM，反向引物160nM，通用分子信标100nM，DNA聚合酶(VemR(exo-)DNA聚合酶)1.5U，0.4mM dNTPs，5μL血清DNA提取液。

PCR方案是：94℃预热10min，然后进行40个循环的扩增反应：94℃变性50s，退火55℃30s，72℃延伸1min，降温至25℃1min检测荧光信号。定义C_dt为荧光淬灭5％时对应的循环数。

3个阴性对照样分别为：不含血清提取DNA的体系，不含反向引物的体系、不含通用序列引物的体系

检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Strategene 3000p，激发光源为石英卤钨灯，波长为492nm。

检测结果：用上述引物及相应的通用分子信标探针在Strategene 3000p进行扩增。结果加入不同稀释度阳性样品在不同循环C_dt(15至35个循环)出现荧光下降信号，而阴性对照样品在扩增结束时(C_dt＞40)均未出现荧光下降信号。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京大学

<120>一种通用分子信标核酸探针及其检测DNA的方法

<130>JSP080132

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccgggagaga gagagagaga gagagcccgg                                     30

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctctctctct ctctctctct ccggggtgtt gtctcctagg ttggc                    45

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gtggctcctg acctggagtc                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtggctcctg acctggagtt                                           20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtggctcctg acctggagta                                           20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gtggctcctg acctggagtg                                           20

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctctctct ctctctctct ccgggagttg ggggaggaga ttag                44

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gaagtcagaa ggcaaaaacg                                           20

Claims (10)

1.一种通用分子信标核酸探针，其5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，在游离状态下形成茎环的发卡结构，荧光淬灭，环部为15-30个碱基，茎部为4-7对互补碱基，其中环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列为一通用序列，当探针与该通用序列的互补序列结合时，茎环结构打开，释放荧光。

2.如权利要求1所述的通用分子信标核酸探针，其特征在于：所述环部为十个AG的重复序列。

3.如权利要求1所述的通用分子信标核酸探针，其特征在于：所述5’端茎部序列为5’-CCGGG-3’。

4.一种用于检测DNA的通用DNA杂交对，由权利要求1～3中任一权利要求所述的通用分子信标核酸探针和一通用序列引物组成，所述通用序列引物包括下述两个部分：a)通用区，位于通用序列引物的5’端并且与通用分子信标核酸探针中的通用序列互补；b)特异结合区，位于通用序列引物3’端，用于与目标序列特异性结合。

5.一种检测DNA的方法，在实时荧光PCR反应体系中加入通用分子信标核酸探针，用正反向引物对待测样品进行PCR反应，并在PCR的扩增热循环中，每次延伸之后降温至25℃检测荧光信号，根据荧光信号的变化对待测样品进行DNA定性和/或定量分析，其中：所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构，荧光淬灭，环部为15-30个碱基，茎部为4-7对互补碱基，环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列为一通用序列；所述正反向引物特异性结合于目标DNA，其中之一为通用序列引物，它包括通用区和特异结合区两部分，所述通用区位于通用序列引物的5’端并且与通用分子信标核酸探针中的通用序列互补，所述特异结合区位于通用序列引物3’端，用于与目标DNA特异性结合；所述通用分子信标核酸探针与通用序列引物结合的T_m值高于通用序列引物与目标DNA结合的T_m值。

6.如权利要求5所述的检测DNA的方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的环部为十个AG的重复序列。

7.如权利要求5所述的检测DNA的方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的5’端茎部序列为5’-CCGGG-3’。

8.如权利要求5所述的检测DNA的方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针与通用序列引物结合的T_m值比通用序列引物与目标DNA结合的T_m值高2-20℃。

9.如权利要求5所述的检测DNA的方法，其特征在于：在实时荧光PCR反应体系中所加的通用分子信标核酸探针和通用序列引物数量相等。

10.如权利要求5所述的检测DNA的方法，其特征在于：在实时荧光PCR反应体系中所加的通用分子信标核酸探针、通用序列引物和反向引物的数量比例为1∶1∶1.6。

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