CN109406469A - 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法 - Google Patents

基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109406469A
CN109406469A CN201811245536.4A CN201811245536A CN109406469A CN 109406469 A CN109406469 A CN 109406469A CN 201811245536 A CN201811245536 A CN 201811245536A CN 109406469 A CN109406469 A CN 109406469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tryptophan
detection
double chain
dna double
allosteric
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811245536.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109406469B (zh
Inventor
赵国杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Medical University
Original Assignee
China Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Medical University filed Critical China Medical University
Priority to CN201811245536.4A priority Critical patent/CN109406469B/zh
Publication of CN109406469A publication Critical patent/CN109406469A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109406469B publication Critical patent/CN109406469B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Abstract

本发明涉及生物化学、分子生物学、氨基酸成分确认的检测方法，具体涉及一种基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法。利用色氨酸结合的阻遏蛋白，结合含有识别序列和切刻位点的DNA双链，并使含有识别序列和切刻位点的DNA双链变构，从而引起双链所在的分子信标发射荧光。根据荧光信号的强弱，定量的测定色氨酸的浓度。该方法为检测色氨酸提供了一种新的简便，快速，可定量的技术，在科学研究和生物样品的氨基酸检测领域具有广泛的应用前景。

Description

基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、氨基酸成分确认的检测方法，具体涉及一种基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法。
背景技术
左旋色氨酸（L-Trp）是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是人体的8种必需氨基酸之一。作为重要的营养物质，许多的食物（原料、半成品、产品等）、饮料和调味品、饲料中都含有色氨酸。如何方便、快捷和准确的对色氨酸进行定量分析在食品和饲料等生物制品的检测中具有重要意义。
色氨酸在生物体内除了作为原料合成蛋白质外，其很多代谢产物具有重要的生物学功能及意义。人体内的色氨酸主要通过两种途径代谢：血清素途径和犬尿氨酸途径。在血清素代谢途径即5-羟色胺途径中，首先色氨酸羟化酶催化色氨酸生成5-羟色氨酸，然后在脱羧酶作用下5-羟色氨酸生成5-羟色胺。在犬尿氨酸途径中，吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）和色氨酸2,3双加氧酶（TDO）催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代谢过程中产生的5羟色胺是一种重要的神经递质，参与神经系统的众多生理功能的调节。犬尿喹啉酸是一种兴奋性氨基酸受体的拮抗剂。色氨酸代谢途径的异常可以引起体液中色氨酸浓度的变化。因此，对色氨酸浓度进行定量检测具有重要的生物学研究和健康检测价值。
目前，最常用的检测色氨酸的方法有HPLC法、质谱法、层析法、紫外吸收法、荧光光谱法等。但是，这些检测分析方法均需要大型专业分析仪器设备，不仅需要专业人员来进行操作，而且对设备的使用和维护的要求也较高。目前，不依赖于大型仪器设备的可用于检测色氨酸的试剂盒常用的有ELISA法，该方法利用色氨酸抗体与色氨酸的结合检测色氨酸，虽然降低了对大型专业仪器设备的要求，但是该检测方法需要包被、铺板、加样、加抗体、显色以及各步之间的多次洗涤操作，步骤繁琐，易于出现人为误差。此外，也有利用滚环扩增检测的方法，然而依赖酶促反应，影响因素复杂，而且不能进行“开启式”检测。因此，开发新的检测方法，实现简便、快捷、特异性高、性价比高的色氨酸一步检测技术具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提出一种基于蛋白结合诱导DNA双链变构的全新的检测左旋色氨酸的方法，含有切刻位点的DNA双链被茎环结构固定在弯折状态，通过色氨酸诱导的蛋白结合，将弯折DNA双链变为直链，并打开茎环结构，通过该方法可以实现左旋色氨酸的简便、快捷、一步、可定量的检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白，通过识别并结合含有特异性识别序列和切刻位点的DNA双链，使DNA分子信标打开，发射荧光，荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。
所述的待检测的左旋色氨酸是制备的左旋色氨酸溶液，或是各种提取的含有左旋色氨酸的生物样本。
所述的色氨酸阻遏蛋白是细胞中调控色氨酸操纵子基因表达的阻遏蛋白trpR，左旋色氨酸特异性结合该蛋白能够提高该蛋白结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。
所述的DNA双链，具有切刻位点，并能够形成分子信标，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列。
与现有技术相比，本发明采用蛋白结合诱导DNA双链变构的全新的检测左旋色氨酸的方法具有下列优点。
1、操作简单、均相检测、一步检测。待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通过识别并结合含有特异性识别序列和切刻位点的DNA双链，使DNA分子信标打开，发射荧光，荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。检测方法可在30分钟之内完成，相对步骤多、耗时长的ELISA技术具有明显操作优势。
2、不需专业的大型仪器设备。因此有利于开发不依赖HPLC、质谱等大型仪器的快检试剂盒。
3、不依赖于酶促反应。与传统的生物检测方法不同，该技术采用全新原理，依赖于蛋白与DNA双链的结合变构，而不需要酶及其参与的酶促反应，因此对于影响酶促反应的检测条件和复杂待检样品成分具有较强的适用性。
4、‘开启式’检测（turn on detection）：即待检分子存在时，出现信号或信号增强。通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，即可测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是本发明检测色氨酸的原理示意图。图中，1、含有trpR识别序列以及荧光基团和淬灭基团的分子信标，2、含有trpR识别序列的互补链DNA，3、阻遏蛋白，4、色氨酸。
图3是本发明定量测定不同浓度色氨酸的测定结果。（A）不同浓度色氨酸的荧光强度，（B）色氨酸浓度和荧光强度的线性关系。Fluorescence intensity (FI)：荧光强度，Time：时间，L-Trp Concentration (μM)：左旋色氨酸浓度（微摩尔每升）。
图4是本发明特异性检测色氨酸和其他19种氨基酸的测定结果。Fluorescenceintensity (FI)：荧光强度；L-Trp：左旋色氨酸；L-Phe：左旋苯丙氨酸；L-Tyr：左旋酪氨酸；L-Ser：左旋丝氨酸；L-Thr：左旋苏氨酸；L-Met：左旋甲硫氨酸；L-Cys：左旋半胱氨酸；L-Gln：左旋谷氨酰胺；L-Asn：左旋天冬酰胺；L-Pro：左旋脯氨酸；Gly：甘氨酸；L-Ala：左旋丙氨酸；L-Leu：左旋亮氨酸；L-Ile：左旋异亮氨酸；L-Val：左旋缬氨酸；L-Glu：左旋谷氨酸；L-Asp：左旋天冬氨酸；L-Lys：左旋赖氨酸；L-Arg：左旋精氨酸；L-His：左旋组氨酸。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明。
本发明基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，增加色氨酸阻遏蛋白对其核酸识别序列的亲和力，结合在分子信标的DNA双链上，使分子信标打开，并发射荧光。分子信标的荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比。该方法包括待检测的左旋色氨酸溶液、色氨酸阻遏蛋白、分子信标、DNA互补链。其中，待检测的左旋色氨酸是配制的左旋色氨酸溶液，或是各种提取或制备的生物样本。色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白trpR，该蛋白能够特异性地结合左旋色氨酸，并发生构象变化，提高了结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。DNA双链，具有切刻位点，并能够形成分子信标，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列。
实施例1。
本发明利用分子信标荧光强度定量测定L-Trp浓度（图3）。具体步骤如下。
（1）检测体系。
配制100μl的检测体系（10mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、50nM 分子信标、50nM互补链和trpR 2.5μM），分别加入不同量的L-Trp，使其终浓度为0、1、2、4、6、8、10 μM。上述所用试剂可通过正规生物技术和试剂公司常规订购，按试剂说明及实验室常规规范配制、储存和使用。
（2）荧光的检测与作图。
利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200，Tecan，USA）检测分子信标的荧光信号。实验温度为37 ℃，激发波长480nm，发射波长524nm，每分钟一测，检测30min。分子信标的荧光值对色氨酸浓度作图，使用线性回归，定量分析色氨酸浓度（图3）。
实施例2。
本发明特异性鉴别L-Trp和其他19种氨基酸（图4）的具体步骤如下。
（1）检测体系。
配制100μl的检测体系（10mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、1 mM DTT、50mM NaCl、50nM 分子信标和trpR 2.5μM），分别加入一种氨基酸。氨基酸的终浓度分别是10μM色氨酸（L-Trp）和1.0mM（其他氨基酸：Gly、L-Ala、L-Ile、L-Leu、L-Met、L-Val、L-Arg、L-His、L-Lys、L-Asp、L-Asn、L-Glu、L-Gln、L-Ser、L-Thr、L-Phe、L-Tyr、L-Cys和L-Pro）。上述所用试剂可通过正规生物技术和试剂公司常规订购，按试剂说明及实验室常规规范配制、储存和使用。
（2）荧光的检测与作图。
利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200, Tecan, USA）检测分子信标的荧光信号。实验温度为37 ℃，激发波长480 nm，发射波长524 nm，每分钟一测，检测30分。取分子信标的最大荧光值对不同氨基酸种类作图，比较不同氨基酸的荧光值，定性鉴别色氨酸（图4）。

Claims (4)

1.一种基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于，包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，使色氨酸阻遏蛋白识别并结合含有其识别序列和切刻位点的DNA双链，进而打开DNA分子信标，发射荧光，荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。
2.按照权利要求1所述的基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于，所述的待检测的左旋色氨酸是制备的左旋色氨酸溶液，或是各种提取的含有左旋色氨酸的生物样本。
3.按照权利要求1所述的基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于，所述的色氨酸阻遏蛋白是细胞中调控色氨酸操纵子基因表达的阻遏蛋白trpR，左旋色氨酸特异性结合该蛋白能够提高该蛋白结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。
4.按照权利要求1所述的基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于，所述的DNA双链，含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列，并具有切刻位点，并位于分子信标的环部。
CN201811245536.4A 2018-10-24 2018-10-24 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法 Active CN109406469B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811245536.4A CN109406469B (zh) 2018-10-24 2018-10-24 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811245536.4A CN109406469B (zh) 2018-10-24 2018-10-24 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109406469A true CN109406469A (zh) 2019-03-01
CN109406469B CN109406469B (zh) 2021-04-09

Family

ID=65469075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811245536.4A Active CN109406469B (zh) 2018-10-24 2018-10-24 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109406469B (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476768A (en) * 1995-03-10 1995-12-19 Becton, Dickinson And Company Mycobacteriophage DSGA specific for the mycobacterium tuberculosis complex
EP1379646A2 (en) * 2000-10-27 2004-01-14 Abbott Laboratories Engineered chimera of protein fragments and methods of use thereof
CN101603077A (zh) * 2008-06-11 2009-12-16 北京大学 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法
CN103305612A (zh) * 2013-06-04 2013-09-18 西安交通大学 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法
CN104046682A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 苏州博泰安生物科技有限公司 同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒
CN104388330A (zh) * 2014-09-26 2015-03-04 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种l-色氨酸发酵菌株及其发酵生产l-色氨酸的方法
CN104450926A (zh) * 2014-12-17 2015-03-25 中国医科大学 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法
CN104789667A (zh) * 2015-04-08 2015-07-22 西安交通大学 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
CN105188767A (zh) * 2012-07-25 2015-12-23 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
CN105588822A (zh) * 2015-12-11 2016-05-18 江南大学 一种基于离子型铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的方法
CN105899681A (zh) * 2013-11-15 2016-08-24 阿维利诺美国实验室股份有限公司 用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法
CN107073297A (zh) * 2014-07-08 2017-08-18 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476768A (en) * 1995-03-10 1995-12-19 Becton, Dickinson And Company Mycobacteriophage DSGA specific for the mycobacterium tuberculosis complex
EP1379646A2 (en) * 2000-10-27 2004-01-14 Abbott Laboratories Engineered chimera of protein fragments and methods of use thereof
CN101603077A (zh) * 2008-06-11 2009-12-16 北京大学 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法
CN105188767A (zh) * 2012-07-25 2015-12-23 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
CN104046682A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 苏州博泰安生物科技有限公司 同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒
CN103305612A (zh) * 2013-06-04 2013-09-18 西安交通大学 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法
CN105899681A (zh) * 2013-11-15 2016-08-24 阿维利诺美国实验室股份有限公司 用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法
CN107073297A (zh) * 2014-07-08 2017-08-18 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
CN104388330A (zh) * 2014-09-26 2015-03-04 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种l-色氨酸发酵菌株及其发酵生产l-色氨酸的方法
CN104450926A (zh) * 2014-12-17 2015-03-25 中国医科大学 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法
CN104789667A (zh) * 2015-04-08 2015-07-22 西安交通大学 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
CN105588822A (zh) * 2015-12-11 2016-05-18 江南大学 一种基于离子型铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMANUEL PETER等: "Regulatory mechanism of the light-activable allosteric switch LOV–TAP for the control of DNA binding: A computer simulation study", 《PROTEINS-STRUCTURE FUNCTION& BIOINFORMATICS》 *
GUOJIE ZHAO 等: "A novelstrategytoanalyze L-tryptophanthroughallostericTrpre-pressorbasedonrollingcircleamplification", 《BIOSENSORS ANDBIOELECTRONICS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109406469B (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. Simultaneous visualization of endogenous homocysteine, cysteine, glutathione, and their transformation through different fluorescence channels
CN104145022B (zh) 测定(d)‑2‑羟基戊二酸(d2hg)或(d)‑2‑羟基己二酸的工具和方法
Brand et al. Fluorescence spectroscopy
Lin et al. Transcription factor-based biosensor for detection of phenylalanine and tyrosine in urine for diagnosis of phenylketonuria
Chen et al. GelRed/[G3T] 5/Tb3+ hybrid: a novel label-free ratiometric fluorescent probe for H2O2 and oxidase-based visual biosensing
CN106565721B (zh) 一种选择识别赖氨酸和甲硫氨酸的荧光试剂及其识别应用
Chou et al. Reagent-free DOPA-dioxygenase colorimetric biosensor for selective detection of L-DOPA
Avci et al. Discrimination of urinary tract infection pathogens by means of their growth profiles using surface enhanced Raman scattering
Brown et al. A sensitive single-enzyme assay system using the non-ribosomal peptide synthetase BpsA for measurement of L-glutamine in biological samples
Zheng et al. A rhodol-derived probe for intracellular biothiols imaging and rapid labelling of sulfhydryl-containing proteins
Nguyen et al. Ultrasensitive biogenic amine sensor using an enhanced multiple nanoarray chip based on competitive reactions in an evanescent field
Li et al. A water-soluble and incubate-free fluorescent environment-sensitive probe for ultrafast visualization of protein thiols within living cells
Yu et al. A turn-on fluorescent aptasensor for ampicillin detection based on gold nanoparticles and CdTe QDs
Fu et al. Rapid and wash-free time-gated FRET histamine assays using antibodies and aptamers
Liu et al. Progress in the development and application of transitional technology of surface-enhanced Raman spectroscopy
Höfig et al. Brightness-gated two-color coincidence detection unravels two distinct mechanisms in bacterial protein translation initiation
Tarara et al. Development of an equipment free paper based fluorimetric method for the selective determination of histidine in human urine samples
Stevens et al. FRET-based identification of mRNAs undergoing translation
CN109406469A (zh) 基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测色氨酸的方法
Fischbach et al. Alizarin Red S for online pyrophosphate detection identified by a rapid screening method
Xie et al. NEM assisted real-time fluorescence detection of Cys in cytoplasm and mice imaging by a Coumarin probe containing carboxyl group
CA2361077C (en) Homogeneous enzymatic assay for vitamin b6 and improvements in h2s detection
Niwayama et al. A pyrene maleimide with a flexible linker for sampling of longer inter-thiol distances by excimer formation
CN104450926B (zh) 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法
Liu et al. A cysteine and Hg2+ detection method based on transformation supramolecular assembly of cyanine dye by AGRO100

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant