CN105588822A - 一种基于离子型铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水溶性离子型铱配合物的磷光被色氨酸猝灭而定量检测色氨酸的方法，属于光谱分析检测领域。首先采用有机合成的方法制备带有羧基的离子型铱配合物六氟磷酸二(2-苯基喹啉)(4,4ˊ-二羧基-2,2ˊ-联吡啶)合铱((pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －)，加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，配成10-5mol·L-1的铱配合物检测液。当加入不同浓度的色氨酸时，铱配合物磷光强度与色氨酸加入的浓度表现出良好的线性关系。通过这种方法定量检测色氨酸具有很高的灵敏度和选择性，并且调节溶液pH能够回收铱配合物，实现循环再利用。

Description

一种基于离子型铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的方法
技术领域
本发明基于动态猝灭机理，加入的色氨酸与磷光金属铱配合物之间发生光诱导电子转移(PET)导致配合物磷光猝灭，属于光谱分析检测领域。
背景技术
氨基酸的特异性检测一直以来是分析检测方面的一大难点，因为动植物中富含的十几种氨基酸都具有相同的氨基和羧基，而不同的结构又大多为化学惰性，所以对氨基酸的检测灵敏度普遍偏低。色氨酸是一种非常重要的氨基酸，它被广泛应用于医药和食品行业。它是唯一一个连接在血浆白蛋白的氨基酸。在人脑内羟化酶的作用下，游离的色氨酸会合成5-羟色胺，其浓度的增加很容易引起神经衰弱[1]。同时研究也发现，肝功能衰竭会极大的增大脑细胞中色氨酸含量[2]。因此，临床检测色氨酸的浓度具有非常大的意义。
传统检测色氨酸的方法如色谱法、电位滴定法、荧光分析法、电化学方法等大多需要对氨基酸进行衍生化处理[3]，操作繁琐，检测限普遍偏高，而本发明采用水溶性铱配合物磷光猝灭检测色氨酸，具有非常高的检测灵敏度，检测限达到10-9mol·L-1。本发明中使用的铱配合物的磷光对色氨酸有很好的响应，为测定复杂体系中的色氨酸提供了参考模型，将来有望广泛使用。
在众多检测方法中，荧光探针被认为是目前最为快捷有效的分子检测工具，它们可以用于活体细胞以及水溶液中目标物质的定量检测[4]。然而，当荧光分析技术应用于实际样品检测时容易被一些杂散光和体系背景发射干扰，这种信号的干扰会降低信噪比，导致检测灵敏度降低[5]。为了减小这些干扰信号的影响，人们发现具有较长发光寿命的磷光(一般在微秒级)检测技术很好的克服了这一困难，因为磷光信号能容易的实现与发光寿命很短的普通荧光和杂散光产生的杂质信号区分开[6]。
近年来，铱配合物因其磷光传感器方面巨大的应用价值得到了国内外科学家的广泛关注。铱配合物的磷光发射受配体影响很大，因此配体如果和目标分子发生作用将会改变整个铱配合物的发光特性，基于这种原理可以检测一些特定的分子[7]。与一般荧光检测相比，铱配合物磷光具有非常好的光稳定性，较大的斯托克斯位移以及较长的发光寿命，可以作为一种优良的磷光传感器信号[8]。所以，铱配合物制作的磷光传感器在生物传感、生物成像、分子离子探针等方面有巨大的潜在应用价值。
使用铱配合物磷光猝灭法检测氨基酸的报道目前还比较少，其中李富友[9]使用了一种新型铱配合物磷光传感器检测高半胱氨酸分子，其检测机理是磷光铱配合物配体上修饰的醛基和体系中的高半胱氨酸分子形成一个稳定的六元环状结构，改变了配合物结构从而使磷光发生改变。YoungminYou[10]合成了一种含有米基硼配体的铱配合物，它对氟离子的检测灵敏度和选择性都非常高。但是大多数的铱配合物缺点在于水溶性很差，不能在水溶液中检测目标分子。本发明以一种水溶性离子型铱配合物(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －[11]作为磷光探针，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液控制pH，加入不同浓度的色氨酸会对铱配合物磷光猝灭从而定量的检测色氨酸分子，具有很高的灵敏度和选择性。
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发明内容
本发明提供一种金属铱配合物(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －磷光猝灭法检测色氨酸的方法。这种方法具有非常低的检测限，较高的灵敏度、很好的重现性和较长的使用寿命。为了得到比较好的检测效果，本发明特征在于：
本发明中磷光铱配合物磷光猝灭的机理为动态猝灭，色氨酸分子与铱配合物发生光诱导电子转移猝灭磷光。采用低浓度铱配合物中加入低浓度的色氨酸根据磷光的降低定量测定浓度。将铱配合物浓度固定，加入实际样品，即可检测实际样品中的色氨酸含量，具有较高的灵敏度。
首先在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中溶解10-5mol·L-1(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －，当加入10-9mol·L-1、10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、10-5mol·L-1、10-4mol·L-1浓度的色氨酸时，配合物磷光强度逐渐猝灭。由于磷光猝灭机理为动态猝灭，本身对配合物结构没有影响，因此加入稀盐酸改变溶液pH可使配合物上的羧基质子化，降低配合物在水中的溶解度而析出，收集配合物可循环利用。
本发明的优点在于磷光铱配合物可以通过调节溶液pH实现循环利用，磷光猝灭法检测色氨酸重现性好，灵敏度高，并且十几种常见的氨基酸仅有色氨酸对该配合物有磷光猝灭作用，选择性好。
附图说明
图1离子型铱配合物(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －结构式。
图2(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －磷光强度与测定体系中pH值的关系。
图3调节pH使(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －析出图。
图4色氨酸猝灭(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －磷光机理探究。
图5(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －对色氨酸的响应，其中a～g分别代表色氨酸的浓度：0mol·L-1,1.0×10-9mol·L-1,1.0×10-8mol·L-1,1.0×10-7mol·L-1,1.0×10-6mol·L-1,1.0×10-5mol·L-1,1.0×10-4mol·L-1。
图6(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －磷光对各种氨基酸的响应以及混合液中色氨酸的选择性检测。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明的技术方案，下面通过实施例子对本发明作进一步详细说明。需要说明的是，以下是发明人给出的具体实施例子，但本发明不限于这些实施例。
实例1
铱配合物磷光强度与pH的关系：取一定量铱配合物溶于0.1mol·L-1的PBS缓冲溶液中(pH分别为6、6.5、7、7.2、7.4、8、9、10)，使溶液中铱配合物的浓度为10-5mol·L-1。混合均匀后即制得几种不同pH的色氨酸检测液。分别在CARYEclipse荧光分光光度计中检测磷光强度。实验中测得了磷光强度与测定体系中pH值的关系见附图2。图2中可以看到pH＝7.4时磷光强度达到最高。因此，取一定量铱配合物溶于0.1mol·L-1的PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)，使溶液中铱配合物的浓度为10-5mol·L-1。加入色氨酸磷光猝灭后，在检测完的余液中加入一定量0.1mol·L-1的盐酸溶液调节pH在1～2，静置即有铱配合物析出，离心分离后后用水多次洗涤，烘干，即可循环再利用。通过调节溶液pH，磷光铱配合物的析出见附图3。
实例2
取一定量铱配合物溶于0.1mol·L-1的PBS缓冲溶液中(PH＝7.4)，使溶液中铱配合物的浓度为10-5mol·L-1。依次加入不同浓度的色氨酸(0mol·L-1,1.0×10-9mol·L-1,1.0×10-8mol·L-1,1.0×10-7mol·L-1,1.0×10-6mol·L-1,1.0×10-5mol·L-1,1.0×10-4mol·L-1)。铱配合物检测液对色氨酸的响应见附图5。
实例3
取一定量铱配合物溶于0.1mol·L-1的PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)，使溶液中铱配合物的浓度为10-5mol·L-1。检测时每次取出4mL,每份中加入一种新配制氨基酸40μL(混合后浓度为10-6mol·L-1)以及14种氨基酸的混合液40μL(14种混合液中每种氨基酸浓度皆为10-6mol·L-1)，(pq)2Ir(dcbpy)+PF6 －对不同氨基酸的选择性以及对混合物中色氨酸的特异性检测见附图6。

Claims (3)

1.本发明基于动态猝灭机理，带有双羧基的离子型铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的一种方法。
2.根据权利要求1，本发明所述的离子型铱配合物是指六氟磷酸二(2-苯基喹啉)(4,4'-二羧基-2,2'-联吡啶)合铱。
3.根据权利要求1,水溶性铱配合物磷光猝灭检测色氨酸的方法具有以下特征：铱配合物溶于pH＝7.4的PBS缓冲溶液，溶液浓度为10-5mol·L-1，其适宜的pH范围为7～8。当依次从低到高加入不同浓度的色氨酸溶液时铱配合物的磷光发射强度逐渐降低，根据猝灭程度定量检测实际样品中色氨酸的含量。
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