CN102993047B

CN102993047B - 快速高选择性硫化氢比色探针

Info

Publication number: CN102993047B
Application number: CN201210512345.6A
Authority: CN
Inventors: 朱宝存; 赵允洲
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN103012199B; CN103018237B; CN103012199A; CN103018237A; CN102993047A

Abstract

本发明涉及快速高选择性硫化氢比色探针。具体地，本发明的探针为一类三氰基乙烯氮苯基类化合物，其可作为硫化氢比色探针用于硫化氢的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别硫化氢/硫化钠；能够用裸眼观察的方式对硫化氢/硫化钠进行定量和定性分析；可以快速对硫化氢实现响应；可以实现对硫化氢的即时检测；性质稳定，可以长期保存使用；水溶性好，有利于在生理水平条件下对硫化氢进行检测；以及具有较强的抗干扰能力。

Description

快速高选择性硫化氢比色探针

技术领域

本发明涉及三氰基乙烯氮苯基类化合物作为硫化氢比色探针，其可在生理水平条件下对硫化氢快速高选择性识别中应用，或者其可测定样品中硫化氢/硫化钠的浓度。

背景技术

硫化氢以典型的臭鸡蛋气味和毒性而出名，然而，最近的研究发现，生命体内的硫化氢具有很多生理功能。硫化氢已成为继一氧化氮和一氧化碳之后，被发现的第三种具有生物活性的气体信号分子。生命体内的硫化氢参与了许多生理过程，具有舒张血管、调节血压、心肌收缩、调节呼吸系统、抑制细胞凋亡、神经传递等生理功能。一旦生命体内的硫化氢含量不能维持在正常的生理水平范围内，生命体便会发生许多病变，包括动脉和肺动脉高血压，心脏病，老年痴呆症，胃粘膜损伤以及肝硬变等疾病。除此之外，硫化氢还能除去细胞内的活性氮和活性氧物种。而且，许多研究表明，作为第三种被发现的气体信号分子，硫化氢与其他两种气体信号分子一氧化氮和一氧化碳之间存在相互作用。因此，硫化氢是有关生命体健康与否的重要分子。

鉴于此，发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测硫化氢的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报导的检测硫化氢的分析方法包括电化学分析法、气相色谱法、金属诱导硫化沉淀法、荧光探针检测等方法。在这些众多的检测方法中，荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点，但是目前报道的荧光探针仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂以及水溶性不够好等。生物体内的硫化氢分解代谢速度很快，引起生物体内硫化氢的含量持续不断的波动，给生命体内硫化氢的检测带来很大困难，因此发展能够快速检测生命体内硫化氢的分析方法是必要的。生命体内的硫醇与硫化氢具有类似结构，它会对硫化氢的检测构成潜在干扰，因此，发展高选择性探针成为急需解决的课题。另外，比色探针由于不需要借助先进的昂贵仪器而进行“裸眼”观察，从而达到定量和定性分析的目的，因此受到广泛关注。总之，发展选择性高的、合成简单的、水溶性好的比色探针是本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

本领域急需一种制备简单、水溶性好的快速高选择性硫化氢比色探针，从而能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测硫化氢。为此，本发明合成了一类新颖的硫化氢的比色探针，其合成简单、水溶性好、稳定性高、和/或选择性高，和/或能够快速识别硫化氢。本发明的探针可在生理水平条件下进行硫化氢的测定。

具体而言，本发明提供了一种硫化氢比色探针，其为三氰基乙烯氮苯基类化合物，其结构如下：

优选的，本发明的比色探针是：

本发明还提供了硫化氢比色探针的制备方法，其是通过将对应于本发明的探针的相应的氮苯基类化合物与四氰基乙烯通过加热而合成制得。优选的，本发明的对应于本发明的探针的相应的氮苯基类化合物是氮苯基二乙醇胺。

在本发明的硫化氢比色探针的制备方法中，反应温度是40－100℃；反应时间是4h－10h；和/或氮苯基类化合物与四氰基乙烯的摩尔比为约1：1至1：5，优选为1：1.5或1：2。

本发明还提供了用于检测样本（例如血液样本）中硫化氢浓度的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的硫化氢浓度的缓冲剂。

本发明还提供了检测样本（例如血液样本）中硫化氢浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本（例如血液样本）中硫化氢浓度的制剂中的用途。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本（例如血液样本）中硫化氢浓度的试剂盒中的用途。

本发明的硫化氢比色探针可与硫化氢进行作用，产生吸收光谱的变化（同时伴随着不同的颜色变化），从而实现对硫化氢的定量检测。

具体而言，本发明的硫化氢比色探针分别与硫醇氨基酸、非硫醇氨基酸以及其他离子进行作用均不能导致吸收光谱的明显改变，从而实现对硫化氢的选择性识别，进而可任选地用于排除这些硫醇氨基酸、非硫醇氨基酸以及其他离子的存在对硫化氢的定量测定的干扰。

需要注意的是，众所周知，硫化钠和硫氢化钠在水溶液中会产生硫化氢，即硫化钠和硫氢化钠是硫化氢的供给体，而硫氢化钠溶液极不稳定，所以很难准确配制硫氢化钠溶液。故而，目前绝大多数是通过测定硫化钠来完成的，即测定硫化钠等同于测定硫化氢。因此，本发明中有关硫化氢比色探针的测定均是针对硫化钠来完成的，但是本领域技术人员将会明白，本发明的探针将能够直接用于定性或定量地测定样本（例如血样样本）中的硫化氢的浓度。

本发明还提供了用于检测样本（例如血液样本）中硫化钠浓度的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的硫化钠浓度的缓冲剂。

本发明还提供了检测样本（例如血液样本）中硫化钠浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本（例如血液样本）中硫化钠浓度的制剂中的用途。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本（例如血液样本）中硫化钠浓度的试剂盒中的用途。

本发明的硫化氢比色探针的水溶性好，从而可有利于生理水平条件下对硫化氢的检测。

可选择地，本发明的硫化氢比色探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

进一步的，本发明的硫化氢比色探针是快速高选择性硫化氢比色探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

图1a、图1b和图1c是不同浓度Na₂S(0－200μM)对探针(5μM)吸收光谱的影响和Na₂S(从左至右:0,50,100,200,300,400,500μM)存在下探针溶液颜色的变化。

图2是不同分析物(150μM)对探针(5μM)吸收光谱的影响。

图3是不同分析物(150μM)对探针(5μM)吸收光谱法定量分析Na₂S(150μM)的影响。

图4是探针(5μM)对不同浓度Na₂S(400μM,800μM)、Cys(300μM,400μM)和GSH(600μM10mM)响应时间的测试结果。

具体实施方式：

本发明提供了上述快速高选择性硫化氢比色探针的合成路线、方法、及其光谱性能。

本发明的硫化氢比色探针是一类三氰基乙烯氮苯基类化合物，其具有以下结构通式

上式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆可以相同或不同。

该类硫化氢比色荧光探针的合成路线和方法如下：

具体地，本发明的比色探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比（例如1：1－1：5）的氮苯基类化合物（例如氮苯基二乙醇胺）和四氰基乙烯溶于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后高温（例如80℃）下恒温加热回流一段时间（例如4h），然后使用有机物（例如乙酸乙酯）萃取，然后旋蒸有机相，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（例如v/v,100:1）进行柱色谱分离。

因此，本发明还提供了四氰基乙烯在制备用于检测硫化氢的比色探针中的用途。

本发明还提供了氮苯基类化合物（例如氮苯基二乙醇胺）在制备用于检测硫化氢的比色探针中的用途。

本发明的快速高选择性识别硫化氢比色探针的显著特征是能够快速高选择性地识别硫化氢/硫化钠，和/或在其他高浓度自然氨基酸和其他离子的存在下能够准确对硫化氢/硫化钠进行定量分析。重要的是，本发明的硫化氢比色探针还能够用“裸眼”观察的方式进行定性和定量分析。

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1

（方案1）将377.3mg(1mmol)氮苯基二乙醇胺和128mg(1.0mmol)四氰基乙烯溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后以80℃恒温加热回流4h，然后使用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，然后旋蒸得到粗产品，然后使用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（v/v,100:1）进行柱色谱分离，得到红色纯净产品298mg，产率为59﹪。

（方案2）将377.3mg(1mmol)氮苯基二乙醇胺和192mg(1.5mmol)四氰基乙烯溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后以80℃恒温加热回流4h，然后使用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，然后旋蒸得到粗产品，然后使用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（v/v,100:1）进行柱色谱分离，得到红色纯净产品415mg，产率为82﹪。

（方案3）将377.3mg(1mmol)氮苯基二乙醇胺和256mg(2.0mmol)四氰基乙烯溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后以80℃恒温加热回流4h，然后使用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，然后旋蒸得到粗产品，然后使用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（v/v,100:1）进行柱色谱分离，得到红色纯净产品450mg，产率为89﹪。

（方案4）将377.3mg(1mmol)氮苯基二乙醇胺和192mg(1.5mmol)四氰基乙烯溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后以60℃恒温加热回流6h，然后使用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，然后旋蒸得到粗产品，然后使用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（v/v,100:1）进行柱色谱分离，得到红色纯净产品359mg，产率为71﹪。

（方案5）将377.3mg(1mmol)氮苯基二乙醇胺和192mg(1.5mmol)四氰基乙烯溶于20mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后以100℃恒温加热回流3h，然后使用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，然后旋蒸得到粗产品，然后使用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系（v/v,100:1）进行柱色谱分离，得到红色纯净产品243mg，产率为48﹪。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ(*10^-6):3.63-3.69(m,8H,J=24Hz),4.92(t,2H,J=5.2Hz),7.06(d,2H,J=9.6Hz),7.90(d,2H,J=9.2Hz);¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ(*10^-6):53.37,58.25,74.49,113.26,114.63,114.69,114.83,116.68,132.26,135.61,154.70;ESI-MS计算值C₁₅H₁₅N₄O₂[M+H]⁺283;实测值283.

实施例2

本发明的发明人进行了如下测试：(a)不同浓度Na₂S(0－200μM)对探针(5μM)吸收光谱的影响；(b)527nm处的吸收强度与加入的Na ₂S浓度(0－130μM)之间的线性关系；(c)不同浓度Na₂S(从左至右:0,50,100,200,300,400,500μM)存在下探针溶液(5μM)的颜色由粉红色逐渐变成无色。上述测定是在水(20mM PBS,pH 7.4)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下Na₂S加入作用10min后测得的。结果参见图1。

从图1可以看出，伴随着探针溶液中Na₂S浓度的增加，吸收光谱逐渐下降，且在0-130μM的Na₂S浓度范围内，Na₂S的浓度和吸收强度成线性关系。目前，大多数已报道的生命体血液中硫化氢的含量为10-100μM，正好落入本发明的探针的检测范围内。因此，本发明的探针能较精确地确定待测血液样本中硫化氢的含量。

实施例3

不同分析物(150μM)对探针(5μM)吸收光谱的影响。分析物包括：半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH、亮氨酸Leu、脯氨酸Pro、苏氨酸Thr、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、钾离子K⁺、钙离子Ca²⁺、锌离子Zn²⁺、硫酸根离子SO₄ ^2-、硝酸根离子NO₃ ^-、高氯酸根离子ClO₄ ^-，硫化钠Na₂S，它们的浓度均为150μM。所有测试条件是在水(20mM PBS,pH 7.4)中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入作用10min后测得的。具体地，移取25μL的探针储备液（1mM）放进5mL比色管中，然后加入3mL超纯水，再移取75μL上述分析物储备液（10mM）加入比色管内，然后移取0.5mL的PBS溶液（pH 7.4,200mM），最后用超纯水定容至5mL。摇匀，静置10min，即可测定。结果如图2所示。

从图2可以看出，探针对硫化氢具有很高的选择性，能够专一性地和硫化氢进行反应，反应前后，吸收光谱有明显变化，而生物体内存在的常见硫醇和离子与探针作用后吸收强度并不发生明显变化。

实施例4

不同分析物(150μM)对探针(5μM)吸收光谱法定量分析硫化氢(150μM)的影响。分析物包括：半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH、亮氨酸Leu、脯氨酸Pro、苏氨酸Thr、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、钾离子K⁺、钙离子Ca²⁺、锌离子Zn²⁺、硫酸根离子SO₄ ^2-、硝酸根离子NO₃ ^-、高氯酸跟离子ClO₄ ^-，它们的浓度均为150μM。所有测试条件是在水(20mM PBS,pH 7.4)中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入作用10min后测得的。结果如图3所示，其中A₀表示纯探针溶液的测定值，A表示加入目标分析物后的测定值。

从图3可以看出，生物体内存在的常见硫醇与离子不会明显干扰探针对硫化氢的定性与定量检测。

实施例5

探针(5μM)对不同浓度Na₂S(400μM,800μM)、半胱氨酸Cys(300μM,400μM)和GSH(600μM,10mM)响应时间的测试结果。首先，移取25μL的探针储备液（1mM）放进5mL比色管中，向其加入0.5mL的PBS溶液（pH 7.4,200mM），再移取相应体积的上述分析物的储备液（10mM），最后用超纯水定容至5mL，快速摇匀，计时测定，其中所使用的探针是实施例1中所制备的探针。结果如图4所示。

从图4中可以看出，Na₂S与探针反应1min后吸收强度即发生明显变化，7min后吸收强度趋于稳定。这种吸收强度减弱的快速性与明显性说明此探针完全可以用于硫化氢的即时检测。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于检测样本中硫化氢/硫化钠含量的制剂，其包含具有以下结构的化合物：

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述的样本是血液样本。

3.用于检测样本中硫化氢/硫化钠含量的试剂盒，其包含具有以下结构的化合物：

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述的样本是血液样本。

5.根据权利要求3－4中任一项所述的试剂盒，其还包括使用说明书。

6.根据权利要求3－4中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测样本中硫化氢/硫化钠含量的缓冲剂。